Die Yeh Labor wird durch Forschungsmittel von einem American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) von einem Department of Defense Zuschuss an die Hollings Cancer Center an MUSC verliehen, durch Forschungsförderung (W81XWH-11-2- unterstützt 0229) bei MUSC und von einem preis vom Concern Foundation (zum ESY).

Das Protokoll folgt den Richtlinien und Tierpflegestandards der Medical University of South Carolina (MUSC) und seine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). 1. Lung Dissection <ol><li> Mammatumor-Dissektion (optional je nach Studienziele und ob Primärtumor Analyse oder Schwanzveneninjektion durchgeführt wurde). <ol><li> Euthanize Maus mit einer letalen Dosis von Isofluran-Narkose nach IACUC und Hochschulverordnung. Bestätigen Euthanasie durch chirurgische Luxation. </li><li> Am Schaumbrett, Stift mit Dissektion Stifte, indem Sie die Maus auf seiner Rückseite mit Gliedmaßen Verbreitung. </li><li> Spray-Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette, fassen Sie den unteren Teil des Tieres in den Mittelpunkt. </li><li> Verwendung Schere, schneiden oben in Richtung auf den Hals durch die Haut, man aufpassen, nicht in die Bauchhöhle der Maus durchbohren. </li><li> Schnitt zurück Haut an den Extremitäten, um Tumorgewebe zu offenbaren. </li><li> Sezieren Tumorgewebe und preserve von bevorzugten Verfahren wie Gefrier- oder Fixierung, zur weiteren Analyse (nicht weiter in diesem Protokoll beschrieben). </li></ol></li><li> Lungengewebe Dissektion. <ol><li> Wenn Tumorgewebe wurde wie oben beschrieben geerntet, festzunageln überschüssige Haut. </li><li> Mit einer Pinzette fassen Peritoneum am unteren Ende des Tieres und beginnen Schneiden nach oben in Richtung auf die Basis des Halses. </li><li> Vorsichtig entlang der linken und rechten Seite des Brustkorbs vorsichtig, um zu vermeiden Trennen keine Blutgefäße, die in die Brusthöhle bluten können geschnitten. Entfernen der Rippenknochen durch Schneiden nach links und rechts durch die Membran und den oberen Abschnitten der Rippen. </li><li> Mit einer Pinzette greifen die Luftröhre des Maus und nach vorne ziehen. </li><li> Sever die Luftröhre mit Dissektion Schere und der Lunge zu entfernen von der Maus. Hinweis: Das Herz kann in die Lunge angebracht bleiben. In diesem Fall sorgfältig sezieren Herzen von Lunge darauf achten, alle fünf Lappen zu sammeln (siehe Abbildung 1 </strong&gt;). </li><li> Waschen Sie sich leicht mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen. </li></ol></li><li> Gross Bewertung der Lungengewebe. <ol><li> Option 1: In-vivo-Bildgebung. <ol><li> Luciferase-Bildgebung, ~ 10 min vor der Bilderzeugung, geben den Tieren eine 150 mg / kg Dosis von Luciferin durch intraperitoneale (ip) Injektion. Bild Lunge in vivo bei anästhesierten Tieren oder beim Entfernen nach der Sektion (2) 5. </li></ol></li><li> Option 2: Brutto Auswertung. <ol><li> Untersuchen Lunge unter Stereomikroskop zur Tumorknoten zu visualisieren. Hinweis: Wenn Zellen GFP-markierten kann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop in der Lage, die eine Lichtwürfel mit dem entsprechenden Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm), um GFP erkennen verwendet werden, um die Lunge für die Fluoreszenz vor der Verarbeitung stereoskopisch untersucht werden. </li></ol></li><li> Wenn die Lunge sind sofort analysiert werden, ist dem Kapitel &#39;RNA Isolation&#39; fortzufahren. Andernfalls Snap freeze Gewebe unter Verwendung liquid Stickstoff oder Trockeneis. Bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. RNA-Isolierung Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde RNA mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit (siehe Materialliste) isoliert. Während die aktuelle Analyse eines bestimmten Herstellers Produkt verwendet, eine Vielzahl von Isolation Kits sind von verschiedenen namhaften Herstellern. Zusätzlich werden nicht-Kit auf Basis Zentrifugationsverfahren auch eine Option. cDNA sollte auch von einer positiven Kontroll-RNA Probe hergestellt werden, beispielsweise eine Zelllinie oder ein Plasmid, für Standard-Kurvenanalyse. Alternativ kann eine positive Kontrolle, die für das Primer Sondensatz erworben werden (siehe Materialliste). <ol><li> Wenn Sie zuvor gefrorenem Gewebe, sammeln gefrorenem Gewebe auf Trockeneis. </li><li> Homogenisieren, mit einer der folgenden Methoden, wie beispielsweise Gewebe: Mörser Schleifen von Hand über Trockeneis nach dem Einfrieren Gewebe in flüssigem Stickstoff durchgeführt wird; Gewebehomogenisator oder mechanische Dissoziation Gerätpro Hersteller Vorschlag; Beschallung oder andere bevorzugte Methode. Hinweis: Für die repräsentative Analyse, ist die bevorzugte Methode der Homogenisierung Beschallung. <ol><li> Für die Analyse in Figur 3 dargestellt, herzustellen Lysepuffer (in RNA Isolation Kit bereitgestellt) und 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 20 ul 2-Mercaptoethanol für je 1 ml Lysepuffer. Resuspendieren Gewebe in 300 ul Lysepuffer ergänzt mit 2-Mercaptoethanol für jede 30 g Gewebe, und mit Ultraschall 10 s mit Beschallungsgerät bei 30% Amplitude eingestellt. </li><li> Wenn Sie nach dem Schleifen Mörser und Stößel, resuspendieren Grundgewebe in 300 ul Lysepuffer. </li></ol></li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Proteinase K bis 590 &amp; mgr; l TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Fügen Sie 600 ul Proteinase K-Lösung, um alle 300 &amp; mgr; l (dh für jede 30 mg) von Gewebe. Inkubation für 10 min bei RT. Hinweis: Aufschlusszeit kann variieren. </li><li> Centrifuge Proben bei ≥13.000 g für 10 min, um Trümmer zu entfernen. </li><li> Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Mit 450 &amp; mgr; l Ethanol (96% -100%) für jeweils 900 &amp; mgr; l des Überstands, um RNA auszufällen. </li><li> Übertragen 700 ul des Lysats / Ethanol Mischung auf die Säule. </li><li> Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 1 min, um RNA zu Säule bindet. </li><li> Entsorgen flüssiger Abfall und fügen verbleibende Überstand zur Spalte wieder zu spinnen. </li><li> Sobald das gesamte Lysat durch die Säule geschleudert, mit 350 ul Waschpuffer 1 an dem oberen Abschnitt der Säule und Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 30 sec. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Vorbereitung DNase durch Mischen von 5 Einheiten DNase I-Enzym mit 5 ul von 10x DNase und 40 ul DNase / RNase freiem Wasser pro Probe (Gesamtvolumen von 50 ul / Probe). </li><li> Dann werden 50 ul DNase mischen, um jede Spalte und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 350 ul Waschpuffer 1 bis Säule und zentrifugieren samsätze bei ≥13,000 g für 30 Sekunden. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Mit 600 &amp; mgr; l Waschpuffer 2 an die Säule und Spin 30 sec bei ≥13,000 g. </li><li> Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen. </li><li> Fügen Sie 250 ul Waschpuffer 2 und Zentrifuge für 2 min bei ≥13,000 g. </li><li> Setzen Sie Teil der Kolonne in neuen Sammelröhrchen und entsorgen Sie alte Sammelröhrchen. </li><li> In 50 bis 100 &amp; mgr; l RNase / DNase freies Wasser zur Säule und Inkubation für 1 min. </li><li> Spin für 1 min bei ≥13,000 g. </li><li> Re-run bis Spalte gesammelten Eluats auf RNA-Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Für den sofortigen Einsatz, halten Proben auf Eis und zur Quantifizierung. Für die spätere Verwendung, Snap freeze auf Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt. </li></ol> 3. Erststrangsynthese Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde die Reverse Transkriptase (RT) -Reaktion durchgeführt a First cDNA-Synthese-Kit für QRT-PCR entwickelt (siehe Materialliste). <ol><li> Wenn Proben wurden zuvor gesammelten, tauen Röhrchen auf Eis. </li><li> Messen Sie RNA-Menge mit einem Spektralphotometer. </li><li> Verwendung 0,5-2 ug Gesamt-RNA, führen die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA Lager zu erzeugen. <ol><li> In sterile, RNase / DNase-frei PCR-Gefäße / Platten, bereiten Sie die Reaktionsmischung (Tabelle 1). Vorsichtig mischen und zentrifugieren. Programmieren Sie eine Standard-PCR-Maschine (Tabelle 2). </li></ol></li><li> Verdünnen Sie fertigen Reaktion auf gewünschte Lautstärke (in der Regel 50 bis 100 &amp; mgr; l) mit sterilen Nuklease-freies Wasser. </li></ol> 4. Echtzeit-PCR Hinweis: Für die repräsentative Analyse, SYBR Green verwendet wurde. Jedoch kann jede bevorzugte Methode im Ermessen des Benutzers ersetzt werden. <ol><li> Verwendung eines positiven Steuer cDNA, richten Sie eine Standardkurve für jedes Primerpaar. <ol><li> Für die Analyse gezeigt, in Abbildung 3, bereiten Sie die Standardkurve für den menschlichen HER2 mit dem Hersteller empfohlene positive Kontroll cDNA (siehe Materialliste). Für Maus GAPDH, verwenden Sie die Negativkontrolle Lungen-cDNA um eine Standardkurve zu erzeugen. Für jede Sonde, seriell verdünnter die cDNA 1: 4 bis 5-Norm zu erzeugen. </li></ol></li><li> Berechnen der Gesamtzahl der Proben, die der Standardkurve und die experimentellen Proben enthalten sollte. Hinweis: Für die Analyse hier beschrieben, wurden 2-3 experimentellen Wiederholungen pro Probe analysiert. Standardkurvenanalyse durchgeführt, um ein einfaches lineares Regressionsmodell, die angewendet werden, um die relative Menge von HER2 und GAPDH pro Probe zur endgültigen normierte Größe berechnen bestimmen zu erzeugen. Diese Analyse wird auch dafür sorgen, dass der Primer Effizienz angemessen für die Analyse bei der Hand ist. </li><li> In einem sterilen, RNase / DNase-frei Rohr, bereiten Master-Mix (Tabelle 3). <ol><li> Berechnen Mastermix amount pro Probe. Scale-up für mehr als eine Probe. Verwenden Sie einen Master-Mix für jeden experimentellen Gen von Interesse, als auch als interne Kontrolle, wie GAPDH. Verwenden Primer für GAPDH in einer Endkonzentration von 200 nM. Hinweis: Der interne Kontrolle ist besonders nützlich, wenn versucht wird, zwischen Mensch und Maus-Zell Ursprungs zu unterscheiden. Hinweis: Primer-Konzentration für HER2 wurde optimiert und durch den Hersteller bestimmt. </li></ol></li><li> Bereiten Testplatte, die 1 &amp; mgr; l cDNAs entsprechend jeder Standard- oder Versuchsprobe. Hierbei mindestens 1 cDNA-Probe / Vertiefung für jedes Primersonde. In 19 ul des Master-Mix pro Vertiefung für jedes Primersonde. Anmerkung: Für den repräsentativen Daten in Abbildung 3 wurden die cDNA-Proben in zweifacher Ausführung für jeden Primer Sonde analysiert und als der Mittelwert der zwei Proben grafisch dargestellt. </li><li> Führen Reaktion in QRT-PCR-Maschine mit den empfohlenen oder zuvor PCR-Protokoll getestet. Siehe Tabelle 4 </strong&gt; für den für die repräsentativen Daten in Abbildung 3 und 4 verwendeten PCR-Protokoll. </li></ol>

<ol>
	<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+in+the+mouse.">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li><li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+tumor+metastasis.">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li><li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis.">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li><li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models.">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li></ol>

ESY und MAA nicht durch FirstString Research Inc. verwendet und nicht ein finanzielles Interesse an der Gesellschaft halten. FirstString Research Inc. zur Verfügung gestellt, die die Luciferase Bilddaten, die in diesem Manuskript vorgestellt wurde. GSG ist Präsident und CEO von FirstString Research. CLG ist Mitarbeiter von FirstString Research. GSG und CLG haben Aktienoptionen durch FirstString Forschung ausgegeben.

Dieses Protokoll beschreibt Verwendung von QRT-PCR, um Brust Metastasierung von Tumorzellen in die Lunge mit einem Xenograft Mausmodell zu bewerten. Es wird anerkannt, dass andere Techniken, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfügung und sind auch wirksam zum Erfassen Metastasierung obwohl ihre eigenen Werte und Grenzen. Die vorgestellten Daten zeigen, dass qRT-PCR stellt eine wirksame Maßnahme zum Nachweis von Tumor-abgeleitete mRNA im Lungengewebe zur Quantifizierung von Gesamt Metastasierung. Es wird v...

QRT-PCR-Analyse als ein Verfahren zur Beurteilung der Tumormetastasierung vorgeschlagen. Dieses Verfahren wird als eine Alternative für die Nutzer, die sich für die Bewertung der Metastasierung sind, aber keinen Zugriff auf bestimmte Geräte wie in vivo bildgebenden Geräten oder einem Fluoreszenz fähig Stereoskop vorgeschlagen. Eine Diskussion der am häufigsten verwendeten Verfahren wird durch eine Demonstration, wie qRT-PCR-Analyse kann entweder als getrennte oder als Begleiter Verfahren zur Metastasierung auszuwerten dieser genutzt werden können gefolgt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, eine quantitative Analyse von metastatischen Last bereitzustellen. Standardverfahren der Brutto-Analyse, einschließlich der Visualisierung der Lunge unter einem Stereomikroskop sowie Serienschnitt gefolgt von Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung von Lungengewebe, quantifizierbar sind, sondern verlassen sich stark auf benutzerdefinierte Parameter zum Zählen 2-5. Bei der Bewertung der gesamten Lunge mit einem Stereomikroskop, nur große Oberfläche Metastasen sind visiBLE und Analyse erfordert die Prüfer, angemessene Kenntnisse der Lungen anatomischen Struktur, um festzustellen, was eine metastatische Läsion haben. Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen mit einem Marker, wie GFP und die Verwendung eines Stereomikroskops, das eine Licht Würfel mit dem geeigneten Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm für GFP) enthält hilft bei diesem Verfahren jedoch nur Oberflächentumorknötchen nachweisbar . Zusätzlich Fluoreszenz von Blutkontamination, die unter den gleichen Parametern wie GFP sichtbar ist, kann zu falschen Identifizierung möglicher Metastasen führen. Schneiden der Lunge, gefolgt von H &amp; E-Färbung auf Lungenmetastasen zu visualisieren ist eine nützliche Methode, um Mikrometastasen und anderen mikroskopischen Verfahren, einschließlich Immunzellinfiltration zu bewerten, sondern erfordert oft den Einsatz des gesamten Lungengewebe für die Paraffineinbettung, Schneiden und Färbeverfahren. Daher folgt dieser metho sind nachgeschalteten Verfahren nicht ideald. Obwohl quantifizierbaren, erfordert dieses Verfahren den Forscher eine Vielzahl von gefärbten Lungenschnitten pro Tier bewerten, um sicherzustellen, dass die Analyse berücksichtigt die gesamte 3D-Struktur der Lunge. Somit ist diese Art der Untersuchung zeitaufwendig, können Zählfehler zu führen, und die Analyse stützt sich stark auf Ermittler Diskretion. Mehrere in vivo bildgebenden Verfahren (zB MRT, PET, SPECT) werden gegenwärtig verwendet, durchzuführen oder zu testen, biologische Prozesse in experimentellen Tiermodellen 8. In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist eine gängige Methode verwendet, um eine grobe Ansicht von Metastasen 9 zu erwerben. Diese Technik wird im allgemeinen angewandt, um die Anwesenheit von Luciferase-Reporteraktivität zu beurteilen aufgrund der Akkumulation von Tumorzellen, die dazu entworfen sind, um eine Luciferase-Reaktionselement enthält, die in bestimmten Organen wie der Brustdrüse nach der Tumorzellimplantation und der Lunge, bei einer spontanen Metastasierung aufzuhalten 10. Visualisierung der Luciferase-Reporteraktivität durch die Anwesenheit von Luciferin-Substrat (D-Luciferin) induziert. Luciferase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin Erzeugen Biolumineszenz. Während informative wird dieses Verfahren durch mehrere Faktoren, einschließlich Substratstabilität (dh kurze Halbwertszeit), eine angemessene Verteilung des Substrats, wie sie an Versuchstiere geliefert wird, hängt, und geringe Nachweisempfindlichkeit 9 begrenzt. Ein Haupt Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist, kann an lebenden Tieren durchgeführt werden und kann auf den Nachweis von Tumorzellmetastasen in verschiedenen Organen, die nicht normal zu Dissektion 9,10 geerntet führen kann. Ein positiver Aspekt der in vivo bildgebenden Verfahren ist, dass das Lungengewebe ungestört so dass für sekundäre Eingriffe wie Paraffineinbettung oder wie hier, QRT-PCR-Analyse vorgestellt. Da jedoch QRT-PCR ist theoretically ein empfindlicheres Maß für die Erkennung, kann grobe Auswertung nicht verraten geringe Zahl von Tumorzellen in der Lunge vorhanden. Zwar nützlich, können die oben beschriebenen Bildgebungstechniken ersetzt oder die unmittelbar beschriebene qRT-PCR-Verfahren ergänzt werden. QRT-PCR hat das Potential, ein empfindliches Maß tumorderivierten mRNA innerhalb einer Lunge bereitzustellen.

<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet RNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25636&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>100-25716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gapdh Primer Sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time pcr

Metastasen ist die Verbreitung von bösartigen Tumorzellen aus dem Primärkrebs Website zu einem entfernten Orgel und ist die Hauptursache von Krebs Tod 1. Gemeinsame Standorte Metastasierung sind Lunge, Lymphknoten, Gehirn und Knochen 2. Mechanismen, die Metastasen zu fahren sind intensiv Bereichen der Krebsforschung. Folglich effektiven Tests, um metastatic Belastung zu messen in entfernten Stellen von Metastasen sind maßgeblich für die Krebsforschung. Bewertung der Lungenmetastasen in Mammatumor-Modellen wird im allgemeinen grob qualitative Beobachtung von Lungengewebe nach Dissektion durchgeführt. Quantitative Methoden zur Bewertung der Metastasierung sind derzeit auf ex vivo- und in vivo-Bildgebungstechniken, die auf Basis benutzerdefinierter Parameter erfordern beschränkt. Viele dieser Techniken sind in den gesamten Organismus Ebene als zellulärer Ebene 3-6. Obwohl neuere bildgebende Verfahren, die Multi-Photonen-Mikroskopie in der Lage, metas bewertenTASIS auf zellulärer Ebene 7 sind diese sehr elegante Verfahren besser geeignet für die Beurteilung Mechanismen der Verbreitung statt quantitative Bewertung der metastatischen Last. Hier wird ein einfaches in vitro-Verfahren für die quantitative Erfassung der Metastasierung wird vorgestellt. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) kann tumorzellspezifischen mRNA in der Maus-Lungengewebe nachgewiesen werden.

Über die Zeit, die für den anfänglichen Inokulation von Tumorzellen in das Versuchstier und durchzuführen, wenn die Durchführung ist ein 1-2 Tag Verfahren primären Tumor in vivo Analyse der Gewebeernte, RNA-Isolierung und qRT-PCR-Analyse (Figur 1) . Ein Beispiel für eine grobe Analyse ist Biolumineszenz-Bildgebung, um Tumorzellen im Lungengewebe zu bewerten. Hier wurde eine Brusttumorgenese Exp...

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Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Forschung

Medizin

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...