Este protocolo se puede utilizar para correlacionar los patrones de actividad del calcio con la expresión génica a nivel de célula única, lo que permite a los investigadores investigar preguntas novedosas sobre las relaciones entre estas dos características. A diferencia de los enfoques anteriores, que suelen estudiar tejidos enteros, nuestra técnica se acerca al nivel de una sola célula, lo que nos permite evaluar las relaciones autónomas celulares entre la actividad del calcio y la expresión génica. Comience por esterilizar UV dos platos Petri de plástico de 35 milímetros y un plato de cultivo celular de 35 milímetros durante aproximadamente 30 minutos.
Trabajando en la capucha de flujo laminar, agregue 10 mililitros de dos solución de calcio mili evolucionador a cada uno de dos tubos cónicos de plástico de 50 mililitros, una placa Petri esterilizada con UV y la placa de cultivo celular esterilizada con UV. Añadir dos mililitros de solución libre de calcio y magnesio a la otra placa Petri esterilizada con UV y llenar dos platos Petri de plástico de 100 milímetros y un plato Petri de plástico de 35 milímetros con 0.1X MMR complementado con gentamicina. A continuación, llene un plato Petri de plástico de 60 milímetros con 70% de etanol.
Inmediatamente antes de la disección, mezcle a fondo 0,01 gramos de colágeno B en un tubo de solución de calcio. Añadir la solución a una nueva placa Petri de plástico de 60 milímetros y utilizar un microscopio de disección para identificar embriones de la etapa de desarrollo deseada. Utilice una pipeta de transferencia estéril para mover al menos seis embriones apropiados en una placa de 100 milímetros que contenga MMR más gentamicina.
A continuación, mueva un embrión de la placa de retención a la segunda placa de 100 milímetros de MMR más gentamicina y coloque esta placa de disección bajo el microscopio. Usando un par de fórceps contundentes para estabilizar el embrión, despeje cuidadosamente la membrana vitellina que rodea el embrión con un par de fórceps finos. Cuando se haya eliminado toda la membrana, utilice los fórceps finos para pellizcar el embrión a lo largo del eje posterior anterior para separar las regiones dorsal y ventral.
Utilice la nueva pipeta de transferencia estéril para transferir la parte dorsal a la placa de 60 milímetros de solución de collageno durante uno a dos minutos antes de transferir cuidadosamente la muestra de nuevo a la placa de disección. Para completar la disección, retire cuidadosamente toda la contaminación endodérmica y mesodérmica residual del tejido neural presuntivo del ectodermo y transfiera suavemente el explant a la placa de 35 milímetros de solución de calcio. Cuando se hayan recogido tres explantes más, utilice una micropipeta P1000 para transferir los cuatro explantes a la placa de 35 milímetros de solución libre de calcio y magnesio teniendo cuidado de evitar cualquier contacto entre los explantes y la interfaz de agua de aire.
A continuación, gire suavemente el plato para que todos los explantes se agrupen en el centro de la placa e incubar los especímenes durante una hora a temperatura ambiente para permitir que los tejidos se disocien. Durante esta incubación, transfiera los dos últimos embriones al segundo plato de MMR con gentamicina, y cubra el plato para permitir que estos especímenes se desarrollen sin perturbaciones. Al final de la incubación, utilice súper pegamento para fijar un cubreobjetos micro-reglado en la parte inferior de la placa de cultivo celular de 35 milímetros y utilice una micropipeta P100 para recoger los explantes disociados.
Sosteniendo la pipeta en un ángulo poco profundo cerca de la superficie de la placa de cultivo celular, coloque la punta de la pipeta en la esquina de la rejilla orientada hacia adentro y expulse firmemente la suspensión de la celda a través del área cuadriculada. Idealmente, las células se asentarán en un racimo apretado y denso. Deje que las células se adhieran a la placa durante una hora a temperatura ambiente.
Mientras las células se están asentando, determine y registre la etapa de desarrollo de los embriones de control de hermanos. Al final de la incubación, mueva el plato de muestra a un lugar protegido por la luz y aspire 100 microlitros de solución desde el borde del plato. Mezclar esta solución con siete microlitros de una solución de ácido Fluo-4 AM Pluronic F127 recién preparada con pipeteo arriba y abajo antes de devolver el volumen completo al plato de muestra.
Gire suavemente para mezclar y cubrir la placa con papel de aluminio. Después de una hora a temperatura ambiente, reemplace un mililitro del sobrenadante de la placa de cultivo explanta por tres mililitros de solución fresca de dos mililitros de calcio. A continuación, sustituya tres mililitros de sobrenadante por tres mililitros de solución de calcio fresco dos veces más.
Para la toma de imágenes por actividad de calcio dentro de los explantes, coloque la placa de muestra en el escenario de un microscopio confocal invertido protegido de la exposición a la luz ambiental y utilice un marcador para etiquetar el punto frontal de la placa de modo que se pueda encontrar el mismo campo de visión en las sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores. Utilice los objetivos 10 y 20 veces para localizar una muestra bajo el microscopio y seleccionar un campo de visión apropiado que sea denso en celdas pero no tan denso que las células estén agrupadas o sean difíciles de distinguir individualmente. Ajuste el enfoque del microscopio para que el cubreobjetos reglado por cuadrícula sea visible, cambiando el campo de visión original hasta que haya un número identificable en el marco según sea necesario.
Obtenga una imagen de campo brillante del campo de visión seleccionado con el cubreobjetos reglado por cuadrícula en el foco y una imagen de campo brillante del campo de visión seleccionado con las celdas enfocadas. Sin una imagen clara del cubreobjetos cuadriculado y el campo de visión, no podrás co-registrar tus celdas con las de las imágenes de peces que generarás más adelante. A continuación, ilumine las muestras con un láser de 488 nanómetros.
Para una imagen de dos horas, modifique la configuración de imágenes para grabar 901 fotogramas con un tiempo de escaneo de 3,93 segundos en un intervalo de ocho segundos antes de ejecutar la configuración para adquirir la imagen. Una vez completada la toma de imágenes, retire la placa de la etapa del microscopio y reemplace el sobrenadante de cultivo por un mililitro de 1X MEMFA durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente teniendo cuidado de registrar la etapa de desarrollo de los embriones de control de hermanos al comienzo de la incubación. La visualización de una gráfica compuesta que contiene trazas para todas las celdas registradas en un experimento revela el grado en que las mediciones a granel o de población pueden ocultar patrones más matizados de comportamiento de punción.
Cuando se aíslan los perfiles registrados de células individuales, se pueden identificar claramente ejemplos de la actividad irregular de picoteo característica de las células progenitoras neuronales. Para cuantificar esta complejidad, se pueden aplicar diferentes métodos de análisis de datos, incluidos diversos parámetros para definir un pico. Si las placas se manipulan aproximadamente o los lavados se realizan con demasiada fuerza durante la hibridación fluorescente in situ, las células se pueden desalojar de las superficies de la placa, lo que hace imposible que las células coincidan con las imágenes.
Si esta interrupción afecta solamente a algunas de las celdas en el campo de visión, todavía puede ser posible detectar y asignar algunas de las celdas dentro de la imagen. Sin embargo, la cantidad máxima de datos se obtiene de un experimento en el que la hibridación se realiza con cuidado y pocas celdas se pierden o se reposicion entre imágenes. Los resultados de experimentos que recopilan la actividad del calcio con la expresión de genes marcadores de progenitores neuronales pueden revelar numerosas asociaciones entre patrones específicos de actividad de calcio y fenotipos neurotransmisores.
Con estos datos, los investigadores pueden sondear características más complejas de estos patrones dinámicos de calcio y las relaciones con la expresión génica en lugar de limitarse al simple recuento de picos.
