We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Los siguientes protocolos se describen métodos para el cultivo y el estudio de la invasión por las especies anaerobias, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden ser utilizados para una serie de patógenos anaerobios. Aunque se utilizan HUVECs, este protocolo puede ser utilizado para otras células eucariotas, tanto inmunes y no inmunes. 1. anaeróbico Cámara de uso y mantenimiento Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno encontrado en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aquí, mantener una atmósfera artificial designado como gas anaeróbico mixta (80% N 2, 10% H 2, 10% de CO 2) en una cámara anaeróbica de vinilo (Figura 1A). Utilice una esclusa de aire (Figura 1B) para la transferencia de los artículos en el entorno del laboratorio a la cámara anaeróbica. La esclusa de aire opera manualmente, twpurga hielo con gas N2 antes de introducir el gas anaeróbico mixta. </li><li> Utilice una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno (Figura 1C) para la eliminación libre de mantenimiento del sulfuro de hidrógeno indeseable. Coloque un deshumidificador dentro de la cámara para eliminar el H 2 O creado por el catalizador y para evitar los aerosoles que facilitan la dispersión de la contaminación. Nota: El sulfuro de hidrógeno es un subproducto metabólico natural de muchas bacterias anaerobias y su acumulación es tóxico para las bacterias y puede resultar en el daño a la electrónica y disminuir el tiempo de vida de un catalizador. </li><li> Utilice una caja de ventilador para hacer circular la atmósfera de la cámara a través de un catalizador de paladio, que elimina el oxígeno en presencia de hidrógeno (Figura 1D). Nota: Un atmosférica (HEPA) elimina la recirculación de contaminantes en el aire con un tamaño de 0,22 micras o más grandes. </li><li> Bacterias anaerobias Cultura en una incubadora a 37 ° que se encuentra dentro del anaeróbicocámara. Utilizar técnicas asépticas estándar cuando se trabaja dentro de la cámara anaeróbica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. cámara anaeróbica de vinilo y sus componentes. (A) una cámara anaeróbica de vinilo sellada completamente de oxígeno atmosférico proporciona espacio de trabajo para dos personas a la vez (32 x 78 en in). Contiene una incubadora a 37 ° C (media de la espalda). (B) Una esclusa de aire se utiliza para la transferencia de los artículos en el entorno de laboratorio a la cámara anaeróbica. En la foto, una esclusa de aire automático operado a través de un controlador que puede ser programado para realizar automáticamente los procedimientos de vacío y purga necesarios para crear un ambiente anaerobio. (C) Un sulfuro de hidrógeno Columna Remoción proporciona la eliminación de gran capacidad sin necesidad de mantenimiento de sulfuro de hidrógeno indeseable. (D) Dos cajas de ventiladores catalizador soncolocado en toda la cámara anaeróbica para ayudar a circular la atmósfera de la cámara a través de catalizador de paladio, el cual, en presencia de hidrógeno, elimina el oxígeno. La cámara anaeróbica está configurado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Preparación de bacterias anaerobias Nota: P. gingivalis es aerotolerant y puede ser almacenado en condiciones aeróbicas pero no va a crecer en la presencia de oxígeno a niveles superiores a 6% 17,18. Una cámara anaeróbica es necesario para el cultivo apropiado de P. gingivalis y otras especies anaerobias (Figura 1). Se requiere capacitación adecuada y la educación sobre el uso de cámara anaeróbica antes de trabajar con microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos los medios líquidos y placas a Condit anaeróbicoiones durante al menos 12 horas antes de la experimentación para eliminar el oxígeno residual. </li><li> Traslado P. gingivalis desde -80 ° C congelador para cámara anaeróbica, permiten deshielo. </li><li> Streak P. gingivalis en placas de agar sangre tripticasa de soja (TSA II con 5% de sangre de oveja). Envuelva las placas en parafina y se almacena a 37 ° C en una incubadora anaeróbico durante 4-7 días. </li><li> Inocular P. gingivalis en 3 ml de infusión de cerebro corazón (BHI) suplementado con hemina y menadiona, un enriquecidos medios líquidos no selectivos para el aislamiento y cultivo de anaerobios y microorganismos exigentes, utilizando bucles estériles. Nota: Para el almacenamiento a largo plazo, mezclar cultivos bacterianos preparados en BHI con glicerol o DMSO (concentración final 10 a 20%), y meterlo en un congelador a -80ºC. </li><li> Preparar un cultivo iniciador de P. gingivalis haciendo una dilución 1:10 y permitiendo que las bacterias crecen hasta la fase semilogarítmica. </li></ol> Nota: La densidad óptica de la bacsuspensión terial se determina y la concentración bacteriana para cada cepa ser examinado se ajusta. Para P. gingivalis una suspensión a una DO 660 de 0,7 corresponde a la fase semilogarítmica y ~ 7 x 10 8 células / ml. Las condiciones de crecimiento descritas en el protocolo anterior son específicos para P. gingivalis y pueden necesitar ser adaptado para otras cepas bacterianas. 3. Cultivo Celular Endotelial Nota: Compra agruparon HUVECs primarias y cultivo en medio basal que contienen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> HUVECs de semillas en matraces T-75 en 2.5 x 10 5 células / matraz de 15 ml en los medios de comunicación VEGF. Nota: Consulte la viabilidad a través de una dilución 1: 1 con 4,0% de azul de tripano. Las células con una membrana comprometida retendrá azul tripán, aparecerá blanco células sanas con membranas intactas cuando se observa bajo un microscopio óptico binocular. CounT 100 células, asegúrese de que más del 80% de las células son viables 20. </li><li> Reemplace los medios cada 2 días con pre-calentado medios VEGF fresca hasta que las células alcanzan ~ 80% de confluencia. </li><li> Lavar las células una vez con PBS pre-calentado. Libera a las células del matraz T75 mediante incubación con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de una solución neutralizante 2 ml de tripsina. </li><li> Recoger HUVECs en suspensión en un tubo cónico de 50 ml. Lavar las células adicionales de T-75 frascos con PBS y transferir a 50 ml tubos cónicos. </li><li> Células centrifugar a 200 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de VEGF pre-calentado. </li><li> Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células similar. </li><li> Calcular la cantidad de suspensión celular para agregar a cualquier placa de 6 pocillos (400.000 / pocillo) o una placa de 12 pocillos con cubreobjetos (50.000 / pocillo). HUVECs estará listo para la experimentación el día siguiente. </li></ol> 4. Supervivencia ensayo de invasión / Interacción(Enchapado) Nota: Al realizar este ensayo, se preparan dos placas de 6 pocillos de células endoteliales sembradas a 400.000 células / pocillo. Una placa se usa para evaluar las bacterias unidas a y internalizados por células huésped. La otra placa dará cuenta de bacterias intracelulares. La placa de 6 pocillos permite triplicados de dos muestras que se realizan en un solo experimento. Para una descripción de este protocolo por favor refiérase al diagrama de flujo ensayo de supervivencia (Figura 2). <ol><li> Preparar las bacterias anaerobias como se describió anteriormente (véase la sección 1) hasta que alcancen un crecimiento semilogarítmica (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Bacterias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Si centrífuga es cámara anaeróbica exterior, llevar muestras de bacterias en un tubo de 15 ml cerrado herméticamente, envuelva la tapa con parafilm para evitar la fuga de oxígeno. </li><li> Coloque granulado P. gingivalis atrás en la cámara, se descarta el sobrenadante. Lavar con PBS, las bacterias de pellets de nuevo antes de la resuspensión de VEGF mídia. Preparar suspensiones para todas las cepas bacterianas a ensayar a una DO 660 de 0,7 que corresponde a la fase semilogarítmica (~ 7 x 10 8 células / ml). Las bacterias están ahora listos para la infección. </li><li> Transferencia de placas de 6 pocillos que contienen HUVECs de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Retire los medios de comunicación y lavar tres veces con PBS anaeróbico. Añadir 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y colocar las placas a 37 ° C en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar la temperatura para la infección. Nota: Las bacterias de la placa sobre placas de agar sangre para garantizar las utilizadas para la infección son homogéneos y no contaminada tras la infección. </li><li> Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI: bacterias anfitrionas) de 100: 1. Nota: el número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión tripano en un solo pozo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 x 5 = 10 8 células / ml). segundoconcentración acterial se ajusta a MOI adecuado basado en la concentración HUVECs 21. </li><li> Colocar placas de 6 pocillos con HUVECs infectadas en incubadora anaeróbica y permiten que las bacterias interactúan con las células huésped durante 30 min. </li><li> Preparar saponina en BHI (1,0% w / v) dentro de la cámara anaeróbica y filtrar a través de un filtro de 0,2 micras. </li><li> La supervivencia de ambas bacterias adheridas y internalizados. <ol><li> Retire las placas de la incubadora, los medios de aspirado, lavado tres veces con PBS y anaeróbico añaden 2 ml filtran 1,0% saponina (preparado como se describe en el paso 4.8). Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspar el fondo de cada pocillo con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer una dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Proceda a realizar diluciones seriadas de la muestra. Dependiendo de las especies bacterianas y concentración, ajuste diluciones en serie. Comience con 1: 100 o 1: 1000 diluciones. </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Wrap tél placas en parafina y el lugar en la incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C, retirar las placas y contar unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando una caja de luz para contar manualmente colonias. Nota: UFC se enumeran. Para cantidades más grandes de UFC, las imágenes pueden ser tomadas y los programas informáticos se pueden utilizar para facilitar el recuento de UFC. </li></ol></li><li> La supervivencia de las bacterias internalizadas. <ol><li> Retire las placas de la incubadora. Lavar tres veces con PBS anaerobio y añadir 2 ml de medios suplementados con VEGF antibióticos (300 g / ml de gentamicina y 400 g / ml de metronidazol). </li><li> Incubar durante 1 hora. Asegúrese de probar los antibióticos por lo que son 100% eficaz en matar la cepa bacteriana deseado y asegurarse de que no penetran en las células huésped 22,23. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, añadir 2 ml de filtrada 1,0% saponina. Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspe parte inferior de cada well con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Preparar diluciones seriadas de la muestra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafina y colocar en la incubadora anaeróbico. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C eliminar los platos y contar UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática de un protocolo utilizado para la supervivencia de las bacterias anaerobias con células eucariotas. Ambos ensayos para una supervivencia total de bacterias y la supervivencia de las bacterias internalizadas se pueden realizar al mismo tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. La internalización de bacterias en Host CeLLS (fluorescente Microscopy) Nota: P. gingivalis se etiqueta con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM). BCECF-AM es un colorante de la membrana permeable no fluorescente; su conversión a BCECF fluoresceína a través de la acción de esterasas intracelulares puede indicar la viabilidad celular. P. gingivalis se etiqueta con el BCECF-AM colorante y luego se usa para infectar células eucariotas. Después de la infección, las células se fijan y se marcaron con DAPI y TRITC-faloidina. La mancha DAPI se utiliza para teñir el núcleo de la célula eucariota también etiquetar núcleo de la célula bacteriana, que proporciona una contramedida para identificar bacterias no viables que pueden no metabólicamente pegue BCECF-AM. Las células huésped se destacan con TRITC-phalloidin, un tinte rojo actina. <ol><li> Cubreobjetos autoclave. Añadir asépticamente cubreobjetos a placas de 12 pocillos antes de la siembra de células endoteliales a 5 x 10 4 células / pocillo. (Preparado días antes de experimento) </li><li&gt; tienen células endoteliales preparadas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares en placas de 12 pocillos como se describió anteriormente. </li><li> Preparar bacterias anaeróbicas que crecen a mediados de la fase de registro (OD 660 = 0,5 a 0,7) como se describe en el apartado 1. </li><li> Bacterias Lavar 2 veces con PBS anaerobio por centrifugación a 5000 xg y se suspende el sedimento en PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Añadir 20 l de 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml de suspensión bacteriana (5-7 x 10 8 células / ml) a una concentración final de BCECF-AM de 2 mM. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Placas de transferencia con las células endoteliales sembradas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Lavar con PBS y el intercambio con los medios de comunicación VEGF anaeróbico. Nota: Verifique que HUVEC están sanos bajo un microscopio óptico. HUVECS debe ser ~ 80% de confluencia, la morfología debe ser comparable a los fabricantes. </li><li> Centrifugar etiquetados bacterias en5.000 xg durante 10 min para eliminar residual colorante BCECF-AM. Suspender en 2 ml de medio VEGF anaeróbico. </li><li> Infectar células huésped con bacterias marcadas en MOI de 100: 1 (bacterias: host). </li><li> Incubar en cámara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Después de la infección las células de lavado con PBS tres veces y fijar en recién preparada 4,0% de paraformaldehído durante 10 min. Nota: Después de fijar las células, el experimento puede llevarse a cabo fuera de la cámara anaeróbica. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 1 ml de 0,2% Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 50 l de TRITC faloidina (50 g / ml) a cubreobjetos durante 45 min. </li><li> Lave cubreobjetos tres veces, retirar de la placa de 12 pocillos y el lugar en un portaobjetos con medio de montaje-set blanda que contiene DAPI. Selle los lados con esmalte de uñas. Nota: Las diapositivas se puede conservar durante un par de meses en la oscuridad. Evitar exposición a la luz para evitar la foto-blanqueo. </li><li> Ver diapositivasutilizando un microscopio confocal. <ol><li> En este caso, utilizar un sistema de 34 canales espectrales (detector de red de 32 canales y dos detectores PMT lado, además de un detector de luz transmitida) configurado en torno a un AxioObserver (invertida) de pie con una etapa de XY motorizado. El sistema cuenta con cinco rayos láser: diodo azul (405 nm), varias líneas de argón (458, 488, 514 nm), el diodo verde (561 nm), HeNe rojo (633 nm) y un láser pulsado nm 440. Equipa un sistema de imágenes de vida de fluorescencia con 2 detectores híbridos GaAsP (para FRET Flim). </li><li> Detectar la fluorescencia de DAPI y TRITC en un canal utilizando un filtro de doble banda con longitudes de onda de excitación de 340-380 nm y 540-560 nm, y un filtro de emisión de 435 a 485 nm y 570 a 590 nm, respectivamente. Detectar fluorescencia de BCECF-AM utilizando un filtro con excitación longitud de onda de 440 a 500 nm y un filtro de emisión de 510 a 590 nm. Nota: Los controles para BCECF-AM se debe hacer en cada cepa bacteriana siendo estudiado para garantizar el etiquetado adecuado de bacterias viables. Primero validar que nonviabbacterias le son DAPI-positivas y BCECF negativo. En segundo lugar, asegúrese de que las bacterias vivas pueden metabolizar BCECF-AM en BCECF fluoresceína. Concentraciones variables de las bacterias o BCECF-AM tinte pueden necesitar ser probado para el etiquetado óptimo. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Todos los métodos anteriores se pueden utilizar para diseñar ensayos específicos para evaluar la interacción de las bacterias anaeróbicas con células eucariotas. Sin embargo, hay varias consideraciones para realizar con éxito los experimentos. Primero están los cepas microbianas para ser utilizados en un estudio. Es crucial en la comparación de dos cepas tanto con el ensayo de supervivencia así como por análisis de microscopía de que están en fases de crecimiento similares y alc...

Las bacterias anaerobias colonizan casi todas las superficies del cuerpo humano. Aunque predominante en la flora de los tractos intestinales y genitourinarias, donde las concentraciones de oxígeno son bajos, sino que también existen en altos niveles en la piel, la boca, la nariz y la garganta 1. Las bacterias anaerobias son una causa común de infecciones endógenas y se aíslan con frecuencia de sitios enfermos. Sin embargo, debido a su naturaleza fastidioso, anaerobios pueden ser difíciles de aislar y cultivar. Los estudios que incluyen bacterias anaerobias deben realizarse bajo condiciones restringidas. Técnicas anaeróbica de cultivo modernos permiten a los investigadores para imitar la configuración anaeróbicas necesarias para estudiar muchas cepas de laboratorio anaeróbico o incluso aislados clínicos 2,3. Bacterias anaerobias patógenas han desarrollado una relación dinámica y co-evolución con las células huésped en las que residen. La mayoría de los anaerobios son susceptibles a la destrucción por la respuesta inmune del huésped antes de llegar a infectiniveles sas. Sin embargo, algunas bacterias patógenas han desarrollado mecanismos para escapar de o subvertir el respuesta inmune del huésped. Logran este objetivo a través de mecanismos tales como la evasión de reconocimiento inmune, la neutralización de mediadores inmunes, alteración de la inmunidad celular, la invasión de las células huésped, y la alteración de inmune de señalización 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas implicado en tanto oral como enfermedades extraorales, es un ejemplo de un patógeno bacteriano altamente adaptada capaz de causar cambios patógenos en el hospedador 5-7. Los bolsillos de la placa de biofilm devengan en profundas grietas que se forman entre los dientes y la mucosa gingival tejido pueden albergar bacterias anaerobias que están protegidos de oxígeno atmosférico 8. Estas bolsas periodontales sirven como un nicho para diversos patógenos anaerobios, tales como P. gingivalis 9. P. gingivalis es un patógeno piedra angular que es capaz de remodelacióning la comunidad microbiana oral en formas que promuevan el desarrollo y la progresión de las enfermedades periodontales 10. Produce un gran número de factores de virulencia que son activos contra un amplio espectro de proteínas del huésped y proporciona mecanismos para la evasión de las defensas del huésped 11. También es capaz de invadir células epiteliales, endoteliales, fibroblastos, y células del ligamento periodontal in vitro 12-14 in vivo 15. Al invadir con eficacia las células huésped, P. gingivalis puede escapar la inmunidad del huésped. Invasión eficaz de las células huésped no sólo permite la bacteria para escapar de las defensas del huésped sino que también sirve como un depósito para futuras re-infección, así como altera la célula huésped. Se necesitan estudios de los mecanismos moleculares implicados en la adhesión y la internalización de la bacteria por células huésped. La investigación en varios laboratorios se centra en la comprensión de los eventos moleculares asociados con la internalización de P. gingivalis por las células huéspedasí como los mecanismos utilizados para reprimir y secuestrar la respuesta inmune y sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped hostiles. Hay muchos ensayos capaces de identificar y caracterizar los agentes patógenos que son capaces de invadir células huésped. Sin embargo, los estudios in vitro con patógenos anaeróbicos plantean muchos problemas experimentales para el investigador principalmente porque es difícil llevar a cabo estudios que se basan en instrumentos voluminosos en la ausencia de oxígeno. Esto se ve agravado por el hecho de que las células eucariotas requieren oxígeno para crecer y por lo tanto deben ser preparados por separado en incubadoras de cultivo de tejidos. Una forma de evitar estos obstáculos sería realizar los estudios con el oxígeno del aire, pero eso haría que el crecimiento de las bacterias anaerobias imposible. Otro método sería utilizar bacterias muertas por calor para infectar y estudiar las interacciones de la célula huésped. Sin embargo, existen diferencias entre las bacterias muertas por calor y viables que disminuyen la relevancia de la interacti huésped-patógenoel 16. Es fundamental para estudiar bacterias viables con la expresión inalterada la interacción con las células huésped; por lo tanto, métodos para el cultivo de P. se dan gingivalis en un entorno anaeróbico. También, dos protocolos rentables simples se demuestran para la evaluación de la capacidad de P. gingivalis a ser internalizado por las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC). El primer protocolo se basa en el ensayo de protección populares antibiótico. Aunque el ensayo es sencillo, se dan consideraciones al utilizar microorganismos anaerobios. El segundo protocolo requiere el uso de un microscopio de barrido fluorescente para visualizar la interacción e internalizado P. gingivalis. Cada ensayo tiene sus limitaciones y ventajas que se tratarán de proporcionar al investigador un esquema para el estudio de la invasión de bacterias anaerobias. Aunque el manuscrito actual estudia P. gingivalis y HUVECs, estos protocolos se pueden utilizar para muchas otras bacterias anaerobias, asíEn cuanto a otros tipos de células huésped.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Las bacterias anaerobias son mucho más numerosos aerobios en muchos nichos humanos, como el intestino, la boca y la vagina. Además, las infecciones anaeróbicas son comunes y con frecuencia de origen indígena. La capacidad de algunos patógenos anaeróbicos para invadir las células humanas les da medidas de adaptación para escapar de la inmunidad innata, así como para modular el comportamiento de la célula huésped. Sin embargo, lo que garantiza que las bacterias anaerobias son en vivo durante la investigación experimental de los eventos puede plantear desafíos. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas, es capaz de invadir una variedad de células no fagocíticas eucariotas. En este artículo se describe cómo con éxito la cultura y evaluar la capacidad de P. gingivalis para invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se desarrollaron dos protocolos: uno para medir las bacterias que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias que interactúan con las células huésped. Estas técnicas requieren el uso de un anaeRobic cámara para suministrar P. gingivalis con un ambiente anaeróbico para un crecimiento óptimo. El primer protocolo se basa en el ensayo de protección a los antibióticos, que se utiliza en gran medida para estudiar la invasión de células huésped por bacterias. Sin embargo, el ensayo de protección de antibiótico es limitada; sólo las bacterias intracelulares que son cultivables tras el tratamiento antibiótico y la lisis de la célula huésped se miden. Para evaluar todas las bacterias que interactúan con las células huésped, tanto vivas y muertas, hemos desarrollado un protocolo que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar la interacción huésped-patógeno. Las bacterias se marcaron fluorescentemente con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) y se utiliza para infectar las células eucariotas bajo condiciones anaeróbicas. Después de la fijación con paraformaldehído y permeabilización con 0,2% Triton X-100, las células huésped se etiquetan con TRITC faloidina y DAPI para etiquetar el citoesqueleto de la célula y el núcleo, respectivamente. Múltiple images tomadas en diferentes puntos focales (Z-pila) se obtienen para la visualización temporal-espacial de las bacterias. Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a cualquier anaerobio cultivable y cualquier tipo de célula eucariota.

Protocolos mencionados anteriormente fueron utilizados en el estudio de la interacción huésped-patógeno entre P. gingivalis y las células endoteliales. P. gingivalis W83 y P. gingivalis V3150 que porta una deleción de PG0228 se utilizaron en el estudio. El PG0228 se prevé para codificar una proteína que puede alterar los niveles de ARN y proteínas, lo que puede afectar en última instancia interacción de P. gingivalis con células huésped. Para investigar el efecto ...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.1K vistas.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...