We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Aşağıdaki protokoller anaerobik türler, P. tarafından işgali kültüre ve eğitim yöntemlerini anlatacağız gingivalis; Bununla birlikte, bu protokoller anaerobik patojenlerin bir dizi kullanılabilir. HUVECler kullanılsa da, bu protokol immün olmayan bağışıklık hem de ökaryotik hücreler için kullanılabilmektedir. 1. Anaerobik Odası Kullanımı ve Bakımı Not: P. gingivalis ortam havasındaki karşılaşılan oksijen normal düzeylere duyarlı bir anaerob olduğunu. Kontrollü bir anaerobik ortam P. ekimi için hayati önem taşımaktadır gingivalis. <ol><li> Burada, karışık anaerobik gaz (% 80 N2,% 10 H2, 2 10% CO) bir vinil anaerobik odası içinde (Şekil 1A) &#39;de verilen bir yapay atmosferi korumak. Anaerobik odasına laboratuar ortamında öğeleri aktarmak için bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanın. Hava kilidi elle tw faaliyetKarışık anaerobik gazın önce N 2 gazı ile buz temizleme. </li><li> Istenmeyen hidrojen sülfid bakım gerektirmeyen çıkarılması için bir bir hidrojen sülfür arındırma kolonu (Şekil 1C) kullanın. Katalizör tarafından oluşturulan O H 2 kaldırmak ve kontaminasyon yayılmasını kolaylaştıran aerosoller önlemek için bölme içinde bir nem alıcı yerleştirin. Not: Hidrojen sülfür, birçok anaerobik bakteri doğal metabolik yan ürünü olduğunu ve birikim bakteriler için toksik ve elektronik zarar ve bir katalizör ömrünü azaltabilir. </li><li> Hidrojen mevcudiyetinde (Şekil 1D) oksijeni ortadan kaldıran bir paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin sirküle edilmesi için bir fan kutusu kullanın. Not: Bir çevrimli atmosferik (HEPA) filtresi 0.22 um veya daha büyük bir boyutu ile havadaki kirletici kaldırır. </li><li> Anaerobik içinde bulunan bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde kültür anaerobik bakterilerodası. Anaerobik odasının içine çalışırken standart aseptik teknikler kullanın. </li></ol><img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Şekil 1. Anaerobik vinil odası ve bileşenleri. (A) atmosferik oksijen tamamen kapatılmış bir vinil anaerobik odası bir anda (32 x 78 in) iki kişi için çalışma alanı sağlar. Bu (geri orta) 37 ° C&#39;de ayarlanmış bir inkübatör içermektedir. (B) Bir hava kilidi anaerobik odasına laboratuar ortamında öğelerin aktarımı için kullanılır. Resimde otomatik olarak anaerobik ortam yaratmak için gerekli vakum ve temizleme işlemleri gerçekleştirmek için programlanabilir bir kontrolör ile çalıştırılan bir otomatik airlock olduğunu. (C) bir hidrojen sülfür arındırma Sütun istenmeyen hidrojen sülfitin bakım gerektirmeyen bir yüksek kapasiteli kaldırma sağlar. (D) İki katalizör fan kutularıhidrojen varlığında, oksijeni ayırmaktadır, paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin dolaşımını sağlamaya anaerobik odası boyunca yerleştirilir. Anaerobik odası üreticinin talimatlarına göre ayarlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Anaerobik Bakterilerin 2. Hazırlık Not: P. gingivalis aerotolerant ve havadar koşullarda saklanabilir ancak% 6 17,18 daha yüksek seviyelerde oksijen varlığında büyüme olmaz. Bir anaerobik odası P. uygun yetiştirilmesi için gerekli olan gingivalis ve diğer anaerobik türler (Şekil 1). Anaerobik odası kullanımı ile ilgili uygun eğitim ve öğretim microanaerobes 19 ile çalışmaya başlamadan önce gerekmektedir. <ol><li> Anaerobik iklimlendirme tüm sıvı ortamları ve plakaları dengelenmesiEn az 12 saat boyunca deney öncesinde iyonları artık oksijen çıkarmak için. </li><li> P Transferi anaerobik odasına -80 ° C derin dondurucuda gelen gingivalis, çözülme edelim. </li><li> Streak P. (TSA II% 5 koyun kanı ile) triptikaz soya kan agar plaklarına gingivalis. 4-7 gün için bir anaerobik kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de parafilm ve mağaza plakaları sarın. </li><li> P aşılamak 3 ml beyin kalp infüzyon halinde gingivalis (BHI) et steril döngüleri kullanarak, hemin ve menadoin anaerobik ve titiz mikroorganizmaların izolasyonu ve kültürü için zenginleştirilmiş bir seçici olmayan sıvı ortam ile takviye edilmiştir. Not: Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda gliserol veya DMSO (% 10-20 nihai konsantrasyon) ve yer ile BHI hazırlanan bakteri kültürleri karıştırın. </li><li> P. bir başlangıç ​​kültürünü hazırlayın 1:10 seyreltme yapılmadan ve bakteri, orta log fazına kadar büyümeye izin vererek gingivalis. </li></ol> Not: bac optik yoğunluğunuarteryal Süspansiyon belirlenir ve incelenecek her bir suş için bakteri konsantrasyonu ayarlanır. P. gingivalis, orta log fazında ve • 7 x 10 8 hücre / ml 0,7 tekabül OD 660 bir süspansiyon. Protokolde tarif edildiği büyüme koşulları yukarıdaki P. özgüdür gingivalis ve diğer bakteri türleri için adapte edilmesi gerekebilir. 3. Endotel Hücre Kültürü Not: Alma üreticinin talimatlarına uygun olarak,% 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de, vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF) ihtiva eden bazal ortam içinde primer HUVECler ve kültür toplanmış. <ol><li> 15 ml VEGF medyada 2.5 x 10 5 hücre / şişeye T-75 matara Tohum HUVECler. Not:% 4,0 tripan mavisi ile 1 seyreltme: 1 vasıtasıyla canlılığı kontrol edin. Binoküler ışık mikroskobu altında bakıldığında tripan mavisi koruyacaktır bir tehlikeye membran ile hücreler, intakt membranlı sağlıklı hücre, beyaz görünecektir. Counhücrelerin% 80&#39;den fazla 20 yaşayabilir olduğundan emin olun, 100 hücre t. </li><li> Hücreler ~% 80 confluency ulaşana kadar önceden ısıtılmış taze VEGF medya ile Ortam 2 günde değiştirin. </li><li> Önceden ısıtılmış bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. 2 ml tripsin nötrleştirme çözeltisi, ardından 5 dakika boyunca 2 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edilerek T75 şişeden hücreler serbest bırakılması. </li><li> Bir 50 ml konik bir tüp içinde süspansiyon haline getirilmiş edilmiş HuVEClerde toplayın. PBS ile T-75 şişeler herhangi bir ekstra hücreleri yıkayın ve 50 ml konik tüpler transfer. </li><li> 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> Süpernatantı 10 ml önceden ısıtılmış VEGF medya hücre pelet askıya. </li><li> Hemasitometre veya benzer hücre sayım cihazı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> (50.000 / oyuk) lamelleri ile 6-çukurlu bir tablaya (400,000 / çukur) veya 12-çukurlu plaka ya da eklemek hücre süspansiyonu miktarını hesaplayın. HUVECler ertesi gün deneme için hazır olacak. </li></ol> 4. Survival Testi Invasion / Etkileşim(Kaplama) Not: Bu deney yaparken, / de 400,000 hücre &#39;de tohumlanmakta endotel hücrelerinin iki 6-oyuklu plakalar hazırlamak. Bir tabak bakteri bağlı ve ana hücreler tarafından değerlendirmek için kullanılacaktır. Diğer levha içi bakteriler için hesap verecek. Iki numune kopyaların bir deneyde ifa edilecek olan, 6-yuvalı plaka sağlar. Bu protokolün bir taslak hayatta kalma tahlil akış şeması (Şekil 2) bakınız. <ol><li> Onlar orta-log büyüme (OD 660 0.5-0.7) ulaşıncaya kadar (bölüm 1) yukarıda açıklandığı gibi anaerobik bakteri hazırlayın. </li><li> Santrifüj bakteri 10 dakika için 5000 xg&#39;de. Santrifüj dış anaerobik odası ise, sıkıca kapatılmış bir 15 ml tüp içinde bakteriyel numuneleri taşıyan oksijen sızmasını önlemek için parafilm kap sarma: edin. </li><li> Topak haline P. yerleştirin gingivalis geri odasında, süpernatant atın. VEGF Beni resuspending önce tekrar PBS ile pelet bakteri yıkayındia. Tüm bakteri soyları, orta log fazında (~ 7 x 10 8 hücre / ml) karşılık gelen 0.7 OD 660 değerinde test için süspansiyonlar hazırlayın. Bakteriler şimdi enfeksiyon için hazır. </li><li> Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör HUVECler içeren transfer 6 oyuklu plakalar. Ortamı çıkarın ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa, anaerobik VEGF ortamının 2 ml ilave edilir ve enfeksiyon için sıcaklık dengelenmesi için 20 dakika boyunca anaerobik bir inkübatörde 37 ° C&#39;de plakalar yerleştirin. Not: enfeksiyon için kullanılan olanları sağlamak için kan agar plaklarına Plaka bakteriler homojen ve enfeksiyon sırasında kontamine değildir. </li><li> 100: enfeksiyon çokluğunda bakteri konakçı hücreleri (ana MOI bakteriler) Infect 1. Not: HUVEC hücre sayısı enfeksiyondan önce tek bir oyuk üzerinde tripan dışlama testi ile tespit edilir. Bakteriyel hücre sayısı (0,5 = 5 x 10 8 hücre / ml OD, gibi), optik yoğunluk ile belirlenmiştir. Bİçeriği: Bakteri konsantrasyonu HUVECler konsantrasyonuna 21 dayalı doğru İçişleri Bakanlığı ayarlanır. </li><li> Anaerobik inkübatör içine enfekte HUVEC 6-çukurlu tabak yerleştirin ve bakteriler, 30 dakika boyunca, konak hücreleri ile etkileşim sağlar. </li><li> BHI içinde saponin anaerobik odası içinde ve 0.2 um&#39;lik bir filtreden filtre (ağ / hac% 1.0) hazırlayın. </li><li> Hem takılı ve içselleştirilmiş bakteri Survival. <ol><li> Inkübatörden, aspirat ortam plakaları çıkarın anaerobik üç kez PBS ile yıkayın ve 2 ml (adım 4.8 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır),% 1.0 saponin, süzüldü ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Hücre kazıyıcı ile her iyi alt kazıyın. Beher kuyudan hücre karışımını toplamak ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme. </li><li> Numunenin seri dilüsyonları yapmaya devam edin. Bakteriyel türler ve konsantrasyona bağlı olarak, seri dilüsyonları ayarlayın. 1 ile başlayın: 100 veya 1: 1000 dilüsyonları. </li><li> Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Bürünmüş37 ° C&#39;de anaerobik kuluçka makinesinde parafilm ve yerine o plakalar. </li><li> 37 ° C&#39;de yedi günlük inkübasyondan sonra, plakalar çıkarın ve el koloniler saymak için bir ışık kutusu kullanılarak koloni oluşturan birimler (CFU) sayısı. Not: CFU numaralandırılan. CFU büyük miktarlar için, görüntü alınabilir ve bilgisayar programı CFU numaralandırılmasına kolaylaştırmak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Içselleştirilmiş bakteri Survival. <ol><li> Inkübatör plakaları çıkarın. Anaerobik PBS ile üç kez yıkanır ve takviye antibiyotik (gentamisin 300 ug / ml, metronidazole 400 ug / ml) ile 2 ml VEGF ortamı eklenir. </li><li> 1 saat süreyle inkübe edin. Istenilen bakteri suşu öldürme% 100 etkilidir, böylece antibiyotik test etmek ve onlar konakçı hücreleri 22,23 nüfuz olmadığından emin olmak için emin olun. </li><li> Aspire medya, süzülmüş% 1.0 saponin 2 ml ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Her wel alt Pençehücre kazıyıcı ile l. Her kuyudan hücre karışımı toplayın ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme. </li><li> Örnek (: 100, 1: 1000, 1) seri dilüsyonları hazırlayın. </li><li> Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Anaerobik inkübatör parafilm ve yerinde plakaları sarın. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübasyondan yedi gün sonra plakaları kaldırmak ve CFU sayımı C. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Şekil 2. ökaryotik hücreler ile anaerobik bakteri hayatta kalmak için kullanılan bir protokol şematik. Toplam bakteri hayatta kalma ve içselleştirilmiş bakteri hayatta kalmak için her iki deneyleri aynı anda yapılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Ana Ce içine Bakterilerin 5. içselleştirilmesills (Floresan Mikroskobu) Not: P. gingivalis, 2 &#39;ile 7&#39;-bis- etiketlenmiştir (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein, asetoksimetil ester (BCECF-AM). BCECF-AM floresan olmayan bir zan-geçirgen bir boyadır; Hücre içi esterazların etkisi ile floresein BCECF olan dönüşüm hücre canlılığı gösterebilir. P. gingivalis BCECF-AM boyası ile etiketlenmiş ve sonra ökaryotik hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Enfeksiyonu takiben, hücreler sabitlenir ve DAPI ve TRITC-falloidinle etiketli. Ökaryotik hücre çekirdeği leke kullanılan DAPI leke da değil metabolik cleave BCECF-AM can cansız bakterileri tanımlamak için bir karşı-önlem sağlar bakteriyel hücre çekirdeğine, etiketleyecektir. Konakçı hücreler TRITC-Phalloidin, kırmızı aktin boya ile vurgulanır. <ol><li> Otoklav lamelleri. Aseptik / gözenek 5 x 10 4 hücre endotelial hücreler, tohumlamadan önce 12 oyuklu plakalara lamelleri ekleyin. (Deneyden önce hazırlanan gün) </li><li&gt; yukarıda tarif edildiği gibi 12-yuvalı plakalar içinde 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lamelleri hazırlanan endotel hücrelerini yazıldı. </li><li> Bölüm 1&#39;de anlatıldığı gibi orta-log fazı büyüdü anaerobik bakteriler (= 0.5-0.7 OD 660) hazırlayın. </li><li> Yıkama bakteri 5000 xg&#39;de santrifüj ve 5-7 x 10 8 hücre / ml&#39;de PBS içinde süspansiyon haline pelet ile anaerobik PBS ile 2x. </li><li> 2 uM BCECF-AM bir son konsantrasyona kadar bakteriyel süspansiyon (5-7 x 10 8 hücre / ml) içinde 2 ml 0,2 mM BCECF-AM 20 ul ekle. </li><li> Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lamelleri numaralı seribaşı endotel hücreleri ile transfer plakaları. PBS ve anaerobik VEGF medya ile alışverişi ile yıkayın. Not: HUVECler ışık mikroskobu altında sağlıklı olduğundan emin olun. HUVECler% 80 birleşen, morfoloji üreticilerine karşılaştırılabilir olmalıdır ~ olmalıdır. </li><li> Santrifüj etiketli bakteriler10 dakika için 5000 xg artık BCECF-AM boya kaldırmak için. 2 ml anaerobik VEGF medyada Askıya. </li><li> 1 (bakteri: host) 100 MOI&#39;da etiketlenmiş bakteri ile konak hücreleri enfekte. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de anaerobik odasında inkübe edilir. </li><li> Ve PBS ile üç kez enfeksiyon yıkama hücreleri sonra 10 dakika boyunca taze hazırlanmış% 4.0 paraformaldehid düzeltmek. Not: hücrelerin sabitlenmesi sonra deney anaerobik ile odacığın dış tarafına yapılabilir. </li><li> Yıkama PBS ile üç kez lamelleri. </li><li> 10 dakika için% 0.2 Triton X-100, 1 ml ekleyin. </li><li> Yıkama PBS ile üç kez lamelleri. </li><li> 45 dakika boyunca lamelleri TRITC falloidinle (50 ug / ml) 50 ul ekle. </li><li> Yıkama DAPI içeren yumuşak set montaj ortamı ile bir slayt 12 plaka ve yerden kaldırmak üç kez lamelleri. Oje ile kenarlarını kapatın. Not: Slaytlar karanlıkta birkaç ay saklanabilir. Foto-ağartma önlemek için hafif maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Görünüm slaytlarkonfokal mikroskop ile incelendi. <ol><li> Burada, (ters) bir AxioObserver etrafında düzenlenmiş bir 34 kanallı spektral sistemi (32 kanal dizi detektörü ve iki yan PMT dedektörleri, artı iletilen ışık dedektörü) bir motorlu XY sahnede stand kullanın. Mavi diyot (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), yeşil diyot (561 nm), kırmızı HeNe (633 nm) ve 440 nm darbeli lazer: Sistem beş lazerler vardır. (FRET-Flim için) 2 hibrid GaAsP dedektörleri ile bir Flüoresans Ömrü Görüntüleme sistemini donatın. </li><li> 340-380 nm ve 540-560 nm, ve sırası ile 435-485 nm ve 570-590 nm&#39;lik bir emisyon filtresi uyarım dalga boyları ile bir çift bant filtre kullanılarak bir kanalda DAPI ve TRITC floresans algılama. 440-500 nm eksitasyon dalga boyu ve 510-590 nm&#39;lik bir emisyon filtresi olan bir filtre kullanılarak BCECF-AM floresans algılama. Not: Her bakteri suşu yapılmalıdır BCECF-AM için Kontrolleri canlı bakteri doğru etiketleme sağlamak için çalışılmaktadır. Öncelikle bu nonviab doğrulamakle bakteri DAPI-pozitif ve BCECF-negatiftir. İkincisi, canlı bakteri floresein BCECF içine BCECF-AM metabolize sağlamak. Bakteri veya BCECF-AM boyası değişken konsantrasyonları uygun etiketleme için test edilmesi gerekebilir. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Yukarıdaki yöntemler eukaryotik hücreleri ile anaerobik bakteri ilişkinin değerlendirilmesi için özel bir tahlilleri tasarlamak için de kullanılabilir. Ancak, başarılı deneyler gerçekleştirmek için bazı noktalar vardır. İlk çalışmada kullanılan mikrobiyal soylar bulunmaktadır. Bu, benzer bir büyüme aşamalarında ve invazyon verim 13 etkileyebilir yukarıda herhangi bir fark benzer hücre konsantrasyonları elde hayatta kalma tahlilinde hem de iki suşlar?...

Anaerobik bakteriler insan vücudunun hemen hemen tüm yüzeyleri kolonize. Oksijen konsantrasyonu düşüktür bağırsak ve genitoüriner yolun florasında baskın olmasına rağmen, aynı zamanda cilt, ağız, burun, boğaz ve 1 yüksek seviyelerde bulunmaktadır. Anaerobik bakteriler endojen enfeksiyon ortak bir nedenidir ve sıklıkla hastalıklı sitelerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, bunların üreyen doğa anaeroblar izole etmek ve kültür, zor olabilir. Anaerobik bakteri içeren çalışmalar kısıtlı şartlarda yapılmalıdır. Modern anaerobik-kültür teknikleri araştırmacılar, birçok anaerobik laboratuar suşları ve hatta klinik izolatları 2,3 incelemek için gerekli olan anaerobik ayarlarını taklit izin verir. Patojenik anaerobik bakteriler içinde bulundukları konakçı hücreler ile dinamik bir ilişki ve ko-evrim geliştirdik. En anaeroblar infecti ulaşmadan önce bir vücut bağışıklığı tepkisi ile öldürülmeye duyarlılı seviyeleri. Ancak, bazı patojen bakteriler kaçmak ya da konak immün yanıtı yıkmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bunlar, bağışıklık tanıma bağışıklık aracılarının nötralizasyon, hücre-aracılı bağışıklığın bir değişiklik, konakçı hücrelerin istilası ve 4 sinyal İmmün alterasyon kaçırma gibi mekanizmalarla bu amacı gerçekleştirmek. Porphyromonas gingivalis, hem oral hem de karışmış bir Gram-negatif anaerob ağız dışı hastalıklar, ev 5-7 patojen değişikliklerin neden olabilecek yüksek adapte bakteriyel patojenin bir örnektir. Biyofilm plak cepler atmosferik oksijen 8 korunur anaerobik bakteri barındırabilir diş ve dişeti mukoza dokusunun arasında oluşan derin yarıklar oluşmuştur. Bunlar periodontal cepler gibi P. gibi çeşitli anaerobik patojenler, bir niş olarak hizmet gingivalis 9. P. gingivalis şeklini kapasitesine sahip bir kilit taşı patojendirPeriodontal hastalıkların 10 gelişmesini ve ilerlemesini teşvik şekillerde ağız mikrobiyal topluluk ing. Bu ana proteinlerin geniş bir spektrumuna karşı aktif olan ve ana savunma 11 kaçırma için mekanizmalar sağlar hastalık oluşturma faktörlerinin çok sayıda üretir. Aynı zamanda, in vitro ve in vivo 12-14 15 epitel, endotel, fibroblastik ve periodontal ligament hücreleri istila edebilir. Etkin bir şekilde, P. konakçı hücreleri işgal tarafından gingivalis konak bağışıklık kaçabilir. Konakçı hücrelerin etkili işgali sadece bakteri konak savunma kaçmasına izin değil, aynı zamanda gelecekte yeniden enfeksiyon için bir rezervuar olarak hizmet yanı sıra konakçı hücreyi değiştirir. Konakçı hücreler tarafından yapışması ve bakterinin içselleştirme yer alan moleküler mekanizmalar çalışmalar gereklidir. Birkaç laboratuvarlarda Araştırma P. içselleştirilmesi ile ilgili moleküler olayları anlamaya odaklanmıştır konakçı hücreler tarafından gingivalishem de bastırmak ve bağışıklık yanıtı kaçırmak ve düşman konak savunma mekanizmaları hayatta kalmak için kullanılan mekanizmalar olarak. Tanımlanması ve konakçı hücreleri işgal edebilen patojenleri karakterize edebilen çok sayıda deneyler vardır. Oksijen yokluğunda hantal araçlara dayanan çalışmalar yapmak zor olduğundan Ancak, anaerobik patojenler ile in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak araştırmacı birçok deneysel sorunlar oluşturmaktadır. Bu ökaryotik hücreler büyümeye oksijene ihtiyaç ve dolayısıyla doku kültürü inkübatörlerde ayrı hazırlanmış olmalıdır gerçeği ile birleşir. Bu tür engelleri önlemek için bir yolu atmosferik oksijenin altında çalışmalar yapmak olurdu, ama o anaerobik bakteri büyüme imkansız hale getirecektir. Başka bir yöntem, enfekte ve ana-hücre etkileşimini incelemek ısı ile öldürülmüş bakterilerin kullanmak olacaktır. Ancak, farklılıkların konak-patojen etkileflimlere alaka azaltmak ısı ile öldürülmüş ve canlı bakteri arasındaki mevcut16. Bu konak hücreleri ile etkileşim değişmeden ifade ile canlı bakteri incelemek için merkezi; P kültürlemek için, bu nedenle, yöntem anaerobik ortamda gingivalis verilmiştir. Aynı zamanda, iki basit düşük maliyetli protokoller P. yeteneğini değerlendirmek için gösterilmektedir gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) tarafından içselleştirilebilir için. Birinci protokol popüler antibiyotik koruma deneyi dayanmaktadır. Deney basittir, ancak anaerobik mikroorganizmalar kullanılarak hususlar verilmiştir. İkinci protokol etkileşim görselleştirmek için bir floresan tarama mikroskobu kullanılmasını gerektirir ve P. içsel gingivalis. Her deney sınırlamaları ve anaerobik bakteri invazivliğini eğitimi için araştırmacı bir taslağını sunmak üzere ele alınacak avantajlara sahiptir. Geçerli el yazması P çalışmaları olsa da gingivalis ve HUVECler, bu protokoller ve diğer pek çok anaerobik bakteriler için kullanılabilirEv sahibi hücre tiplerine olarak gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Anaerobik bakteriler çok böyle gut, ağız ve vajina gibi birçok insan nişler aerop çoğunluktadır. Ayrıca, anaerobik enfeksiyonlar sık ​​ve sık sık yerli kökenlidir. İnsan hücreleri istila bazı anaerobik patojenlerin yeteneğini onlara doğal bağışıklığı kaçmak için de konakçı hücre davranışını modüle edilmesi için bir tedbir alınması verir. Ancak, anaerobik bakteriler zorluklar oluşturabilecek olayların deneysel soruşturma sırasında canlı sağlanması olduğunu. Porphyromonas gingivalis, bir Gram-negatif anaerob, ökaryot fagositik olmayan hücrelere çeşitli işgal yeteneğine sahiptir. Bu makale başarıyla kültür ve P. yeteneğini değerlendirmek için nasıl özetliyor gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) işgal etmek. İki protokolleri geliştirilmiştir: Bir başarı istila ve ev sahibi içinde hayatta ve diğer konakçı hücreleri ile etkileşim bakteri görselleştirmek için bakteriler ölçmek için kullanılır. Bu teknikler, bir ANAE kullanımını zorunlurobic P. tedarik bölmesi Optimal büyüme için bir anaerobik ortam ile gingivalis. Birinci protokol büyük ölçüde bakterilerin konakçı hücrelerin istilası incelemek için kullanılır antibiyotik koruma deneyi, dayanmaktadır. Bununla birlikte, antibiyotik koruma deneyi sınırlıdır; Antibiyotik tedavisi ve konak hücre lizis aşağıdaki kültürlenebilen sadece hücre içi bakteriler ölçülür. Canlı ve ölü konakçı hücreler ile etkileşen tüm bakteri değerlendirmek için, konukçu-patojen etkileşimini incelemek için flüoresan mikroskopi kullanan bir protokol geliştirilmiştir. Bakteriler flüoresan olarak, 2 &#39;ile 7&#39;-bis- (2-karboksietil) olarak etiketlenmiştir -5- (and-6) -carboxyfluorescein asetoksimetil ester (BCECF-AM) ve anaerobik koşullar altında ökaryotik hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır. % 0.2 Triton X-100 ile formaldehit ve geçirgenliği ile tespit eden konakçı hücreler, sırasıyla, hücre sito-iskeletini ve çekirdeği etiketlemek için TRITC falloidinle ve DAPI ile etiketlenmiştir. Çoklu imaFarklı odak noktaları (Z-yığın) alınan ges bakterilerin zamansal-mekansal görselleştirme için elde edilir. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri, herhangi bir ekilebilir anaerob herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Yukarıda özetlenen Protokoller P. arasındaki konak-patojen etkileşimi inceleyerek kullanılmıştır gingivalis ve endotel hücreleri. P. gingivalis W83 ve bir P. PG0228 bir silme taşıyan gingivalis V3150 çalışmada kullanılmıştır. PG0228 sonuçta P. etkileşimini etkileyebilir RNA ve protein seviyelerini değiştirebilir bir protein kodladığı tahmin edilmiştir Ev sahibi hücreleri ile gingivalis. P. PG0228 etkisini araştırmak ...

Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

porphyromonas-gingivalis-as-model-organism-for-assessing-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.2K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

Video: Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...