We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Os seguintes protocolos vai descrever métodos para a cultura e estudar a invasão pelas espécies anaeróbicas, P. gingivalis; No entanto, estes protocolos podem ser utilizados para uma série de agentes patogénicos anaeróbios. Embora HUVECs são usados, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas tanto imunes e não-imunes. 1. Anaerobic Chamber Uso e Manutenção Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos níveis normais de oxigénio encontradas no ar ambiente. Um ambiente anaeróbio controlado é vital para o cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aqui, manter uma atmosfera artificial designado como gás anaeróbico misto (80% de N2, 10% de H 2, 10% de CO 2) numa câmara anaeróbia de vinilo (Figura 1A). Usar uma câmara de vácuo (Figura 1B) para a transferência de itens a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. A câmara de compressão opera manualmente, twpurga de gelo com gás N2 antes de introduzir o gás anaeróbico misto. </li><li> Utilizar uma coluna de remoção de sulfureto de hidrogénio (Figura 1C) para a remoção livre de manutenção do sulfureto de hidrogénio indesejável. Coloque um desumidificador dentro da câmara para remover H2O criada pelo catalisador e aerossóis para evitar que facilitam a propagação da contaminação. Nota: Sulfeto de hidrogênio é um subproduto metabólico natural de muitas bactérias anaeróbias e sua acumulação é tóxica para bactérias e pode resultar em danos à eletrônica e diminuir o tempo de vida de um catalisador. </li><li> Utilize uma caixa de ventilador fazer circular a atmosfera da câmara, através de um catalisador de paládio, que remove o oxigénio na presença de hidrogénio (Figura 1D). Nota: Uma recirculação atmosférica (HEPA) remove os contaminantes transportados pelo ar com um tamanho de 0,22 mm ou maior. </li><li> Cultura de bactérias anaeróbicas num banho a 37 ° C incubadora que está localizado dentro do anaeróbiocâmara. Use técnicas assépticas padrão quando se trabalha dentro da câmara anaeróbia. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. câmara anaeróbia de vinilo e os seus componentes. (A) uma câmara anaeróbica vinilo selado completamente a partir de oxigénio atmosférico proporciona espaço de trabalho para dois indivíduos de cada vez (32 em x 78 em). Ele contém uma incubadora ajustada a 37 ° C (de volta do meio). (B) Uma câmara de compressão é utilizado para a transferência de objectos a partir do ambiente de laboratório para a câmara de anaerobiose. Na foto é uma câmara automática operada através de um controlador que pode ser programado para executar automaticamente os procedimentos de vácuo e purga necessários para criar um ambiente anaeróbico. (C) A sulfeto de hidrogênio Coluna Remoção fornece remoção de alta capacidade livre de manutenção de sulfeto de hidrogênio indesejável. (D) Duas caixas de ventilador catalisador sãocolocado ao longo da câmara anaeróbica para ajudar a circular a atmosfera da câmara, através do catalisador paládio, o qual, na presença de hidrogénio, remove o oxigénio. A câmara anaeróbia é configurado de acordo com as instruções do fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Preparação de bactérias anaeróbicas Nota: P. gingivalis é aerotolerant e pode ser armazenado em condições aeróbias mas não crescerão na presença de oxigénio em níveis mais elevados do que 6% 17,18. Uma câmara de anaerobiose é necessária para o cultivo adequado de P. gingivalis e outras espécies anaeróbicas (Figura 1). Formação adequada e educação sobre o uso anaeróbio câmara é necessária antes de trabalhar com microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos os meios líquidos e placas para condit anaeróbioiões durante pelo menos 12 horas antes da experimentação para remover o oxigénio residual. </li><li> Transferir P. gingivalis de -80 ° C freezer para câmara anaeróbia, deixe descongelar. </li><li> Streak P. gingivalis em placas de ágar sangue de tripticase de soja (TSA II com 5% de sangue de carneiro). Enrole placas em parafilme e armazenar a 37 ° C numa incubadora anaeróbica durante 4-7 dias. </li><li> Inocular P. gingivalis em 3 ml de infusão cérebro coração (BHI) suplementado com hemina e menadiona, um meio líquido enriquecido não selectivos para o isolamento e cultivo de anaeróbios e microorganismos exigentes, usando loops estéreis. Nota: Para armazenamento a longo prazo, misturar culturas bacterianas preparados em BHI com glicerol ou DMSO (concentração final de 10-20%) e colocar num congelador de -80 ° C. </li><li> Prepare uma cultura inicial de P. gingivalis, fazendo uma diluição de 1:10 e permitindo que as bactérias a crescer até fase mid-log. </li></ol> Nota: A densidade óptica da BACterial de suspensão é determinada e a concentração de bactérias para cada estirpe a ser examinada é ajustado. Para P. gingivalis uma suspensão a DO660 de 0,7 corresponde à fase mid-log e 7 x 10 ~ 8 células / ml. As condições de crescimento descritas no protocolo acima são específicos para P. gingivalis e pode precisar ser adaptado para outras estirpes bacterianas. 3. endotelial Cultura de Células Nota: Compra HUVEC reunidas primárias e cultura em meio basal contendo factores de crescimento endotelial vascular (VEGF), a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> HUVECs de sementes em frascos T-75 em 2.5 x 10 5 células / balão em 15 ml de mídia VEGF. Nota: Verificar a viabilidade através de uma diluição de 1: 1 com 4,0% de azul de tripano. As células com uma membrana comprometida manterá azul de tripano, as células saudáveis ​​com membranas íntegras aparece branco quando visto sob uma luz microscópio binocular. Councélulas T 100, garantir que mais de 80% das células são viáveis ​​20. </li><li> Substituir mídia a cada 2 dias com a mídia VEGF fresco pré-aquecido até que as células chegar a ~ 80% de confluência. </li><li> Lave as células uma vez com PBS, pré-aquecido. Libertar células do frasco T75 por incubação com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de solução de 2 ml de tripsina de neutralização. </li><li> Recolhe HUVEC suspensas num tubo cónico de 50 ml. Lavar as células extras a partir de frascos T-75 com PBS e transferir para tubos de 50 ml cônico. </li><li> Centrifugar células a 200 xg durante 10 min. </li><li> Remover o sobrenadante, suspende sedimento celular em 10 ml de meio de VEGF pré-aquecido. </li><li> Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro ou dispositivo de contagem de células semelhantes. </li><li> Calcular quantidade de suspensão de células para adicionar a qualquer placa de 6 poços (400.000 / poço) ou placa de 12 poços com lamelas (50.000 / poço). HUVECs estará pronto para a experimentação no dia seguinte. </li></ol> 4. Survival ensaio de invasão / Interação(Chapeamento) Nota: Quando a realização deste ensaio, preparar duas placas de 6 poços de células endoteliais semeadas a 400.000 células / poço. Uma placa será usado para avaliar bactérias aderidas para e internalizadas pelas células hospedeiras. A outra placa serão responsáveis ​​por bactérias intracelulares. A placa de 6 poços permite triplicados de duas amostras para ser executado em um experimento. Para um esboço deste protocolo por favor consulte o fluxograma ensaio de sobrevivência (Figura 2). <ol><li> Prepare bactérias anaeróbicas, como descrito acima (ver secção 1) até atingirem crescimento mid-log (DO660 0,5-0,7). </li><li> Bactérias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Se centrífuga é câmara anaeróbia fora, transportar amostras bacterianas em um tubo de 15 ml hermeticamente fechado, enrole a tampa com parafilme para evitar o vazamento de oxigênio. </li><li> Coloque peletizada P. gingivalis de volta na câmara, elimine o sobrenadante. Lavar com PBS, as bactérias da pelota de novo antes de ressuspensão em VEGF-media. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a ser testado em OD 660 de 0,7 o que corresponde a fase mid-log (~ 7 x 10 8 culas / ml). As bactérias estão agora prontos para a infecção. </li><li> Transferência de placas de 6 poços contendo células HUVEC incubadora de cultura de tecidos a partir de dentro da câmara anaeróbia. Remova a mídia e lavar três vezes com PBS anaeróbio. Adicionar 2 ml de meio anaeróbio VEGF a cada poço e colocar as placas a 37 ° C na incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar a temperatura durante a infecção. Nota: as bactérias da placa em placas de agar de sangue para garantir que as utilizadas para a infecção são homogêneas e não contaminada por infecção. </li><li> Infectar as células hospedeiras com as bactérias a uma multiplicidade de infecção (MOI: bactérias hospedeiras) de 100: 1. Nota: o número de células HUVEC é determinada através da realização de um teste de exclusão de tripano num único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinada por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 x 10 5 = 8 células / mL). Bacterial concentração é ajustada para MOI adequado com base na concentração HUVECs 21. </li><li> Coloque placas de 6 poços com células HUVEC infectados na incubadora anaeróbica e permitir que as bactérias para interagir com as células hospedeiras durante 30 min. </li><li> Prepare saponina em BHI (1,0% w / v) dentro da câmara de anaerobiose e filtrar através de um filtro de 0,2 um. </li><li> A sobrevivência de ambas as bactérias aderidas e internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador, meios aspirado, lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de filtrado de 1,0% de saponina (preparada tal como descrito no passo 4.8). Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poço com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição a 1: 1 em BHI. </li><li> Proceder para fazer diluições em série das amostras. Dependendo da espécie e da concentração bacteriana, ajustar as diluições em série. Comece com 1: 100 ou 1: 1.000 diluições. </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Envoltório tele placas em parafilme e lugar na incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Na sequência de sete dias de incubação a 37 ° C, retire as placas e contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs) usando uma caixa de luz para contar manualmente colônias. Nota: as UFC são enumerados. Para maiores quantidades de CFUs, as imagens podem ser tomadas e software de computador pode ser utilizado para facilitar a contagem de CFU. </li></ol></li><li> A sobrevivência das bactérias internalizadas. <ol><li> Retirar as placas do incubador. Lavar três vezes com PBS e anaeróbio adicionar 2 ml de VEGF meios suplementados com antibióticos (300 ug / ml de gentamicina e 400 ug / ml) de metronidazol. </li><li> Incubar durante 1 h. Certifique-se de testar os antibióticos assim que eles são 100% eficaz em matar a estirpe bacteriana desejada e certifique-se de que eles não penetram células do hospedeiro 22,23. </li><li> Aspirar a mídia, adicione 2 ml de filtrado 1,0% de saponina. Incubar durante 15 min para permitir a lise da célula hospedeira. </li><li> Raspe fundo de cada poçol com raspador de células. Recolhe-se a mistura de células de cada poço e fazer diluição 1: 1 em BHI. </li><li> Preparar diluições em série da amostra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 ul de diluição desejada em placas de agar sangue. Embrulhe em filme plástico e placas lugar na incubadora anaeróbica. </li><li> Depois de sete dias de incubação a 37 ° C, remover as placas e contagem de UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática de um protocolo usado para a sobrevivência de bactérias anaeróbias com células eucarióticas. Ambos os ensaios para a sobrevivência bacteriana total e sobrevivência de bactérias internalizadas pode ser realizada ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Interiorização de bactérias em Ce Anfitriãolls (Microscopia fluorescente) Nota: P. gingivalis é rotulado com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, éster acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM é um corante não fluorescente membrana permeável; a sua conversão em BCECF fluoresceína através da acção de esterases intracelulares pode indicar a viabilidade celular. P. gingivalis é marcado com o corante BCECF-AM e então utilizado para infectar as células eucarióticas. Após a infecção, as células são fixadas e marcadas com DAPI e TRITC-faloidina. A mancha DAPI utilizado para corar o núcleo da célula eucariótica também irá rotular núcleo da célula bacteriana, que fornece uma contra-medida para identificar as bactérias não-viáveis ​​que podem não se apegam metabolicamente BCECF-AM. As células hospedeiras são realçadas com TRITC-phalloidin, um corante vermelho actina. <ol><li> Lamelas autoclave. Adicionar assepticamente lamelas para placas de 12 poços antes de semear as células endoteliais a 5 x 10 4 células / poço. (Preparado dia antes da experiência) </li><li&gt; têm células endoteliais preparadas em 18 mm de espessura (# 1.5) lamelas circulares em placas de 12 poços como descrito acima. </li><li> Prepare bactérias anaeróbias cultivadas até à fase semi-log (OD 660 = 0,5-0,7), conforme descrito na seção 1. </li><li> Lavar 2x com bactérias anaeróbias PBS por centrifugação a 5.000 xg e suspensão da pelota em PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Adicionar 20 uL de 0,2 mM de BCECF-AM a 2 ml de suspensão bacteriana (5-7 x 10 8 culas / ml) para uma concentração final de BCECF-AM 2 uM de. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min no escuro. </li><li> Placas de transferência com células endoteliais semeadas em 18 mm (# 1.5 espessura) lamelas circulares de cultura de tecidos incubadora na câmara anaeróbia. Lavar com PBS e intercâmbio com a mídia VEGF anaeróbia. Nota: Verifique se HUVECs são saudáveis ​​sob um microscópio de luz. HUVECS deve ser ~ 80% confluentes, morfologia devem ser comparáveis ​​aos fabricantes. </li><li> Centrífuga marcado bactérias na5.000 xg durante 10 min para remover o corante BCECF-AM residual. Suspender em 2 ml de mídia VEGF anaeróbia. </li><li> Infectar células hospedeiras com bactérias marcadas na MOI de 100: 1 (bactérias: host). </li><li> Incubar em câmara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Após infecção de células de lavagem três vezes com PBS e fixar em recém-preparado 4,0% de paraformaldeído durante 10 min. Nota: Depois de consertar as células, experimento pode ser realizado fora da câmara de anaerobiose. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de 0,2% de Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Lavar lamelas com PBS três vezes. </li><li> Adicionar 50 ul de TRITC-faloidina (50 ug / ml) para lamelas durante 45 min. </li><li> Wash lamelas três vezes, remover da placa de 12 poços e coloque em um slide com soft-set meio de montagem contendo DAPI. Selar os lados com unha polonês. Nota: As lâminas podem ser armazenadas por um par de meses no escuro. Evite a exposição à luz para evitar a foto-branqueamento. </li><li> Visualização de diapositivosutilizando um microscópio confocal. <ol><li> Aqui, use um sistema de 34 canais espectrais (detector de conjunto de 32 canais e dois detectores PMT lado, além de um detector de luz transmitida) configurado em torno de um AxioObserver (invertido) estar com um palco motorizado XY. O sistema tem cinco lasers de diodo: azul (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe vermelho (633 nm) e um laser pulsado nm 440. Equipar um sistema de imagem Lifetime fluorescência com 2 detectores GaAsP híbridos (para FRET-FLIM). </li><li> Detectar a fluorescência a partir de DAPI e TRITC em um canal utilizando um filtro de banda dupla, com comprimentos de onda de excitação de 340-380 nm e 540-560 nm, e um filtro de emissão de 435-485 nm e 570-590 nm, respectivamente. Detectar a fluorescência de BCECF-AM, utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 440-500 nm e um filtro de emissão de 510-590 nm. Nota: Os controles para BCECF-AM deve ser feito em cada estirpe bacteriana sendo estudadas para garantir uma rotulagem adequada de bactérias viáveis. Em primeiro lugar validar que nonviable bactérias são DAPI-positivas e BCECF-negativo. Em segundo lugar, garantir que as bactérias vivas pode metabolizar BCECF-AM em fluoresceína BCECF. Concentrações variáveis ​​de as bactérias ou corante BCECF-AM podem precisar de ser testado para rotulagem óptima. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Todos os métodos acima podem ser utilizados para conceber ensaios específicas para avaliar a interacção de bactérias anaeróbicas com células eucarióticas. No entanto, há várias considerações para realizar com sucesso experiências. Primeiro são as estirpes microbianas para ser utilizados num estudo. É crucial para a comparação de duas estirpes com ambos o ensaio de sobrevivência, bem como por análise de microscopia de que eles estão em fases de crescimento semelhantes e at...

As bactérias anaeróbicas colonizar quase todas as superfícies do corpo humano. Embora predominante na flora do trato intestinal e genito-urinário, onde as concentrações de oxigênio são baixos, eles também existem em níveis elevados na pele, boca, nariz e garganta 1. As bactérias anaeróbicas são uma causa comum de infecções endógenas e frequentemente são isoladas de sítios doentes. No entanto, devido à sua natureza fastidiosa, anaeróbios podem ser difíceis de isolar e cultivar. Estudos envolvendo bactérias anaeróbias deve ser feito sob condições restritas. Técnicas anaeróbio-cultura moderna permitem aos pesquisadores para imitar as configurações anaeróbias necessárias para estudar muitas cepas laboratoriais anaeróbia ou mesmo isolados clínicos 2,3. Bactérias anaeróbicas patogénicas têm desenvolvido uma relação dinâmica e co-evolução com as células hospedeiras em que residem. A maioria dos anaeróbios são susceptíveis à morte pela resposta imunitária do hospedeiro antes de atingir infectiníveis OUs. No entanto, algumas bactérias patogénicas desenvolveram mecanismos para escapar ou subverter a resposta imune do hospedeiro. Eles alcançar este objetivo através de mecanismos como a evasão de reconhecimento imunológico, neutralização de mediadores do sistema imunológico, alteração de imunidade mediada por células, invasão de células hospedeiras, e alteração da imunológico sinalizando 4. Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbia Gram-negativo implicado em ambos oral e doenças extra-orais, é um exemplo de um agente patogénico bacteriano altamente adaptado capaz de causar alterações patogénicas no hospedeiro 5-7. Bolsões de biofilme placa acumulado em fendas profundas formadas entre os dentes e tecido da mucosa gengival pode abrigar bactérias anaeróbias que são protegidos de oxigênio atmosférico 8. Estas bolsas periodontais servir como um nicho para vários patógenos anaeróbicos, como P. gingivalis 9. P. gingivalis é um agente patogénico da distorção que é capaz de remodelaçãoing a comunidade microbiana oral, de forma a promover o desenvolvimento e progressão de doenças periodontais 10. Ela produz um grande número de fatores de virulência que são ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro e fornece mecanismos para a evasão de defesas do hospedeiro 11. É também capaz de invadir epiteliais, endoteliais, fibroblastos e células do ligamento periodontal in vitro e in vivo 12-14 15. Por eficazmente invadir as células hospedeiras, P. gingivalis pode escapar imunidade do hospedeiro. Invasão efectiva de células hospedeiras não só permite que a bactéria de escapar defesas do hospedeiro, mas também serve como um reservatório para o futuro re-infecção, bem como a célula hospedeira altera. São necessários estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na adesão e internalização da bactéria por células hospedeiras. Pesquisa em vários laboratórios está focada na compreensão dos eventos moleculares associados com a internalização de P. gingivalis pelas células hospedeirasbem como os mecanismos utilizados para suprimir e sequestrar a resposta imune e sobreviver a mecanismos de defesa do hospedeiro hostis. Existem muitos ensaios capazes de identificar e caracterizar agentes patogénicos que são capazes de invadir as células hospedeiras. No entanto, estudos in vitro com agentes patogénicos anaeróbios apresentam muitos problemas experimentais para o investigador, principalmente porque é difícil realizar estudos que dependem de instrumentos volumosos, na ausência de oxigénio. Esta situação é agravada pelo fato de que as células eucarióticas necessitam de oxigênio para crescer e, portanto, deve ser preparado separadamente em incubadoras de cultura de tecidos. Uma maneira de evitar tais obstáculos seria realizar os estudos sob o oxigénio atmosférico, mas que iria tornar o crescimento de bactérias anaeróbicas impossível. Outro método seria a utilização de bactérias mortas por calor para infectar e estudar interacções célula-hospedeiro. No entanto, existem diferenças entre as bactérias mortas pelo calor e viáveis ​​que diminuem a relevância do interacti patógeno-hospedeirono dia 16. Ele é central para estudar bactérias viáveis ​​com expressão inalterada interagindo com células hospedeiras; Assim, os métodos para a cultura de P. gingivalis em um ambiente anaeróbico são dadas. Além disso, dois protocolos de baixo custo simples são demonstrados para avaliar a capacidade do P. gingivalis para ser internalizada pelas células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC). O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico populares. Embora o ensaio é simples, as considerações ao usar microrganismos anaeróbios são dadas. O segundo protocolo requer a utilização de um microscópio de varrimento de fluorescência para visualizar a interagir e internalizado P. gingivalis. Cada ensaio tem as suas limitações e vantagens que serão discutidos para fornecer o pesquisador um esboço para estudar a invasão de bactérias anaeróbicas. Embora o manuscrito atual estuda P. gingivalis e HUVEC, estes protocolos podem ser utilizados para muitos outros tipos de bactérias anaeróbicas, bemcomo para outros tipos de células hospedeiras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

As bactérias anaeróbicas longe superam os aeróbios em muitos nichos humanos, tais como o intestino, boca e vagina. Além disso, infecções anaeróbias são comuns e frequentemente de origem indígena. A capacidade de alguns agentes patogénicos anaeróbios de invadir células humanas lhes dá as medidas de adaptação para escapar imunidade inata, bem como para modular o comportamento da célula hospedeira. No entanto, assegurar que as bactérias anaeróbias são vivo durante a investigação experimental dos eventos pode representar desafios. Porphyromonas gingivalis, um anaeróbio Gram-negativos, é capaz de invadir uma variedade de células não fagocíticas eucarióticas. Este artigo descreve como para com êxito a cultura e avaliar a capacidade do P. gingivalis de invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Dois protocolos foram desenvolvidos: um para medir as bactérias que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro, e a outra para visualizar as bactérias que interagem com as células hospedeiras. Estas técnicas requerem a utilização de um anaecâmara para fornecer P. Robic gingivalis com um ambiente anaeróbico para o crescimento ideal. O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico, que é largamente utilizada para estudar a invasão das células hospedeiras por bactérias. No entanto, o ensaio de protecção de antibiótico é limitada; apenas bactérias intracelulares que são cultiváveis ​​após o tratamento antibiótico e a lise da célula hospedeira são medidos. Para avaliar todas as bactérias interagem com células hospedeiras, tanto vivos e mortos, desenvolvemos um protocolo que utiliza a microscopia fluorescente para examinar interação patógeno-hospedeiro. As bactérias são marcado por fluorescência com 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetoximetil éster (BCECF-AM) e utilizados para infectar células eucarióticas em condições anaeróbias. Após fixação com paraformaldeído e permeabilização com 0,2% de Triton X-100, as células hospedeiras são marcados com TRITC-faloidina e DAPI para marcar o citoesqueleto da célula e do núcleo, respectivamente. Multiple images tomadas em diferentes pontos focais (Z-stack) são obtidos para visualização temporal e espacial das bactérias. Os métodos usados ​​neste estudo pode ser aplicada a qualquer bactéria anaeróbia cultiváveis ​​e qualquer tipo de célula eucariótica.

Protocolos descritas acima foram usadas no estudo de interação patógeno-hospedeiro entre P. gingivalis e células endoteliais. P. gingivalis W83 e um P. gingivalis V3150 transportando uma deleção de PG0228 foram utilizados no estudo. O PG0228 está previsto para codificar uma proteína que podem alterar os níveis de RNA e proteínas, o que pode em última análise afectar a interacção de P. gingivalis com células hospedeiras. Para investigar o efeito da PG0228 em <em...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...