Este método ayudará a los investigadores a estudiar la biología y fisiopatología de las bacterias anaeróbicas que viven y causan infecciones en el tracto reproductivo femenino. Los modelos anteriores de inoculación vaginal murina se han centrado en bacterias cultivadas y recuperadas en condiciones aeróbicas. Nuestro método instruye sobre la inoculación y recuperación de bacterias anaeróbicas obligatorias, que requieren estrategias adicionales para minimizar la exposición al oxígeno.
Dependiendo de cuán exigentes sean, las nuevas cepas bacterianas utilizadas en este modelo pueden requerir cambios en ciertos pasos. Hemos proporcionado sugerencias para posibles modificaciones en la tabla uno del manuscrito. Para empezar, agregue 200 microlitros de un cultivo bacteriano de 16 horas de edad a una cubeta de 1.5 mililitros con 800 microlitros de medios frescos en una cámara anaeróbica.
Luego midió la densidad óptica, o OD, del cultivo diluido a 600 nanómetros en un espectrofotómetro, utilizando una cubeta separada con solo medios en blanco. Para obtener el valor real de OD del cultivo, multiplique la lectura del espectrofotómetro por cinco, luego determine el volumen de inóculo requerido para el experimento y calcule el volumen del cultivo bacteriano necesario para lograr la densidad de inóculo requerida. A continuación, pipetear el volumen requerido de cultivo bacteriano a un tubo de microcentrífuga estéril y centrifugar a 16, 000 veces G durante uno a tres minutos.
Después de retirar el sobrenadante, resuspender el pellet en PBS anaeróbico para lograr el volumen requerido de inóculo calculado anteriormente. Para determinar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas en el inóculo preparado, primero, use 10 microlitros de la suspensión bacteriana para hacer varias diluciones seriadas en PBS y use una pipeta multicanal para detectar diluciones de inóculo en placa en placas de agar. Al mismo tiempo, prepare los tubos de lavado vaginal en la cámara anaeróbica pipeteando 70 microlitros de PBS anaeróbico estéril en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcados con números de ratón.
Cierre los tubos herméticamente y sáquelos de la cámara. Para realizar el lavado vaginal, primero, coloque un mouse encima de una jaula que pueda agarrar con sus patas delanteras. Luego, agarre suavemente la parte media de la cola y levántela para que los cuartos traseros estén ligeramente elevados y la abertura vaginal quede expuesta.
Después de extraer 50 microlitros de PBS del tubo de lavado etiquetado, inserte suavemente la punta de la pipeta de dos a tres milímetros en la luz vaginal para lavarla con PBS pipeteando dentro y fuera de tres a cuatro veces. Luego, transfiera el material de lavado al tubo de lavado original con los 20 microlitros restantes de PBS no utilizado. Inmediatamente después de este lavado vaginal, inocular a cada ratón transfiriendo vaginalmente 20 microlitros de la suspensión bacteriana o control del vehículo.
Para experimentos de co-inoculación con dos cepas bacterianas diferentes, inocular por separado con 10 microlitros de cada suspensión bacteriana, en lugar de mezclar las cepas de antemano. Para evitar que el volumen administrado se acumule inmediatamente en el introito vaginal, continúe sosteniendo la parte trasera del ratón durante 10 a 20 segundos. Transfiera el ratón inoculado a una nueva jaula o con compañeros de jaula ya inoculados, y repita el procedimiento con los otros ratones.
Después de inocular a todos los ratones, obtenga las unidades formadoras de colonias post-inóculo colocando diluciones seriadas del inóculo en la cámara anaeróbica. Para recolectar órganos de ratón, prepare tubos de recolección de órganos de cinco mililitros en la cámara anaeróbica agregando un mililitro de PBS anaeróbico estéril a cada tubo para vaginas y cuello uterino. Agregue 750 mililitros de PBS a los tubos marcados para cuernos uterinos.
Para recoger el lavado final en el sacrificio, prepare otro juego de tubos de lavado vaginal como se demostró anteriormente. Además, para enjuagar y esterilizar instrumentos de disección, prepare un vaso de precipitados de 50 mililitros de agua desionizada y un vaso de precipitados de 50 mililitros de 70 a 90% de etanol. Inmediatamente antes o después de sacrificar los ratones, realice el lavado final como se demostró anteriormente.
Después del sacrificio, rocíe el abdomen y la espalda de un ratón con etanol al 70%. Luego, use tijeras esterilizadas con etanol y secas para abrir la cavidad pélvica abdominal del ratón con cortes verticales. Luego, use los fórceps para retirar la piel.
Para exponer el tracto reproductivo, empuje suavemente los intestinos fuera de la cavidad del cuerpo hacia el lado del campo abierto y retire la vejiga del ratón para acceder a la parte inferior del tracto reproductivo. Después de eso, recorte el centro del hueso púbico con tijeras sin cortar la vagina. Luego, use dos juegos de fórceps para agarrar cada lado de la pelvis y tire de la pelvis para abrir lateralmente para exponer la parte inferior de la vagina debajo.
Agarre suavemente el cuello uterino con fórceps y tire de él hacia arriba para exponer el colon. Después de eso, use tijeras pequeñas para liberar la vagina de los tejidos conectivos externos. Suelte cuidadosamente la vagina del colon sin perforar el tracto intestinal.
Cuando la vagina esté completamente liberada del colon, use tijeras para flanquear la vagina en el introito y luego corte para eliminarla del cuerpo del ratón. Manteniendo un agarre suave en el cuello uterino, tire de él hacia arriba para hacer que los cuernos uterinos sean más visibles y corte directamente debajo de los ovarios en los lados derecho e izquierdo para liberar los cuernos uterinos. A continuación, retire el tracto reproductivo del cuerpo del ratón y colóquelo en una placa de Petri estéril.
Luego, con una cuchilla de afeitar, separe los cuernos uterinos, el cuello uterino y la vagina. Coloque cada tejido en su respectivo tubo de recolección etiquetado. Para homogeneizar los órganos, prepare un homogeneizador de mano en un gabinete de bioseguridad.
Primero, prepare un conjunto de tres tubos de 50 mililitros con agua desionizada, etanol al 70% y PBS, respectivamente, para lavar las cuchillas homogeneizadoras después de homogeneizar cada órgano. Para limpiar el homogeneizador, sumerja la cuchilla en el tubo de agua y encienda la máquina a toda velocidad durante unos tres segundos. Luego, agite la cuchilla sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de agua.
Enjuague la cuchilla sucesivamente en etanol al 70% y PBS. Después del enjuague inicial, baje la sonda homogeneizadora hasta el fondo de un tubo con órganos para atrapar el tejido debajo. Luego, encienda el homogeneizador para moler el tejido y mueva suavemente la sonda hacia arriba y hacia abajo unas cinco veces, manteniéndola sumergida.
Apague y retire el homogeneizador y asegure visualmente la interrupción completa del tejido. Después de la homogeneización, vuelva a colocar la muestra en la cámara anaeróbica y realice una dilución en serie para la recuperación de UFC. Siguiendo este protocolo, la recuperación de bacterias viables y la enumeración de unidades formadoras de colonias de los lavados vaginales podría realizarse con éxito para las cepas bacterianas, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia y Fusobacterium nucleatum.
Además, el número de unidades formadoras de colonias de Gardnerella vaginalis obtenidas de lavados vaginales se correlacionó con las recuperadas de los homogeneizados del tejido vaginal. Este método también reveló que los títulos de Prevotella bivia y los tejidos uterinos de ratón fueron significativamente más altos durante la coinfección con Gardnerella vaginalis frente a la monoinfección por Prevotella. Además, este método podría utilizarse con éxito para comparar la persistencia vaginal de una cepa mutante de Fusobacterium nucleatum con la del tipo salvaje a las 24 y 72 horas posteriores a la inoculación.
Para investigar la respuesta inmune a la inoculación bacteriana vaginal, se pueden ejecutar ensayos de citoquinas en los homogeneizados del tejido. Alternativamente, los tejidos podrían guardarse para el examen histológico para evaluar los signos de inflamación.
