We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Die folgenden Protokolle werden Methoden für die Kultivierung und Untersuchung der Invasion durch die anaerobe Arten, P. beschreiben gingivalis; jedoch können diese Protokolle für eine Reihe von anaeroben Pathogene verwendet werden. Obwohl HUVECs verwendet werden, kann dieses Protokoll für andere eukaryontische Zellen sowohl immune und nicht-immune verwendet werden. 1. anaeroben Kammer Betrieb und Wartung Hinweis: P. gingivalis ist eine anaerobe empfindlich auf ein normales Niveau von Sauerstoff in der Luft auftreten. Eine kontrollierte anaerobe Umgebung ist für die Kultivierung von P. gingivalis. <ol><li> Hier aufrechtzuerhalten eine gemischte anaerobe Gas (80% N 2, 10% H 2, 10% CO 2) in einem Vinyl anaeroben Kammer (1A) bezeichneten künstlichen Atmosphäre. Verwenden Sie eine Luftschleuse (1B) für die Übertragung von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer. Die Luftschleuse betreibt manuell, twEis Spülung mit N2-Gas vor der Einführung des gemischten anaeroben Gas. </li><li> Verwenden Sie einen Schwefelwasserstoff-Entfernungssäule (1C) für wartungsfreie Entfernung der unerwünschten Schwefelwasserstoff. Legen Sie einen Luftentfeuchter in der Kammer, um H 2 O durch den Katalysator zu entfernen und Aerosole, die die Ausbreitung der Kontamination zu erleichtern vermeiden. Anmerkung: Schwefelwasserstoff ist ein natürliches Stoffwechselnebenprodukt vieler anaeroben Bakterien und ihre Akkumulation Bakterien toxisch und kann in einer Beschädigung des elektronischen Folge und eine Verringerung der Lebensdauer des Katalysators. </li><li> Verwenden Sie ein Fan-Box auf der Kammeratmosphäre durch eine Palladium-Katalysator, der Sauerstoff in Gegenwart von Wasserstoff (Abbildung 1D) entfernt zu zirkulieren. Hinweis: Ein Rezirkulieren Atmosphären (HEPA) Filter entfernt Verunreinigungen aus der Luft mit einer Grße von 0,22 um oder mehr. </li><li> Kultur anaeroben Bakterien in einem Inkubator bei 37ºC, die in der anaeroben befindetKammer. Verwenden Sie Standard-aseptischer Techniken beim Arbeiten im Inneren des anaeroben Kammer. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Abbildung 1. Anaerobe vinyl Kammer und seiner Komponenten. (A) einem Vinyl anaeroben Kammer vollständig vom Luftsauerstoff abgedichtet stellt Arbeitsplatz für zwei Personen zu einem Zeitpunkt (32 in x 78 in). Es enthält einen Brutschrank bei 37 ° C (hinten Mitte) eingestellt. (B) eine Luftschleuse für den Transfer von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer eingesetzt. Pictured ist eine automatische Luftschleuse durch eine Steuerung, die so programmiert, dass das Vakuum und Säuberungsverfahren erforderlich, um eine anaerobe Umgebung zu erstellen automatisch durchführen kann betrieben. (C) Eine Entfernung von Schwefelwasserstoff Column bietet wartungsfreien Hochleistungs Entfernung unerwünschter Schwefelwasserstoff. (D) Zwei Katalysator-Fan-Boxen sindwährend des anaeroben Kammer angeordnet, um die Zirkulation der Raumatmosphäre durch Palladium-Katalysator, der in Gegenwart von Wasserstoff, Sauerstoff entfernt. Die anaeroben Kammer wird gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Herstellung von anaeroben Bakterien Hinweis: P. gingivalis aerotolerant und kann unter aeroben Bedingungen gelagert werden, aber es wird nicht in Gegenwart von Sauerstoff wachsen auf einem höheren Niveau als 6% 17,18. Einer anaeroben Kammer ist notwendig für die ordnungsgemäße Pflege der P. gingivalis und anderen anaeroben Spezies (Abbildung 1). Richtiges Training und Ausbildung auf anaeroben Kammer Gebrauch ist, bevor Sie mit microanaerobes 19 erforderlich. <ol><li> Gleichgewicht kommen alle flüssigen Medien und Platten, um anaerobe conditIonen für mindestens 12 h vor dem Experiment um den restlichen Sauerstoff zu entfernen. </li><li> Bringen P. gingivalis von -80 ° C Gefrierschrank bis anaeroben Kammer, noch auftauen. </li><li> Streak P. gingivalis auf Trypticase-Soja Blutagarplatten (TSA II mit 5% Schafblut). Wickeln Sie Platten in Parafilm und lagern bei 37 ° C in einer anaeroben Inkubator für 4-7 Tage. </li><li> Impfen P. gingivalis in 3 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Brühe, ergänzt mit Hämin und Menadion einem angereicherten nicht-selektiven flüssigen Medien für die Isolierung und Kultur von anaeroben und anspruchsvoller Mikroorganismen, mit sterilen Schleifen. Hinweis: Für die langfristige Lagerung, Mischung Bakterienkulturen in BHI mit Glycerin oder DMSO (10-20% Endkonzentration) und in einen -80 ° C Gefrierschrank vorbereitet. </li><li> Bereiten Sie eine Starterkultur von P. gingivalis, indem Sie eine 1:10 Verdünnung und damit Bakterien bis Mitte der log-Phase wachsen. </li></ol> Anmerkung: Die optische Dichte des bacterial Suspension wird bestimmt, und die Bakterienkonzentration für jeden Stamm untersucht werden eingestellt. Für P. gingivalis eine Suspension bei einer OD 660 von 0,7 entspricht der mittleren log-Phase und ~ 7 x 10 8 Zellen / ml. In dem Protokoll beschriebene Wachstumsbedingungen vorstehend spezifisch für P. gingivalis und eventuell auf andere Bakterienstämme angepasst werden. 3. Endothelzellkultur Hinweis: Der Kauf gepoolt primäre HUVECs und Kultur in Basalmedium, enthaltend vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) bei 37 ° C in 5% CO 2 nach Herstelleranweisungen. <ol><li> Samen HUVECs in T-75-Flaschen mit 2,5 × 10 5 Zellen / Kolben in 15 ml VEGF Medien. Hinweis: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit über ein 1: 1-Verdünnung mit 4,0% Trypanblau. Zellen, die mit einem geschwächten Membran Trypanblau behalten, werden gesunde Zellen mit intakten Membranen weiß erscheinen, wenn sie unter einem binokularen Lichtmikroskop. CounT 100-Zellen, zu gewährleisten, dass über 80% der Zellen lebensfähig sind 20. </li><li> Ersetzen Medien alle 2 Tage mit vorgewärmter Frisch VEGF Medien, bis die Zellen zu erreichen ~ 80% Konfluenz. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten PBS. Befreien Zellen von der T75-Flasche durch Inkubation mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%) für 5 Minuten, gefolgt von 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung. </li><li> Sammeln suspendiert HUVECs in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie keine zusätzlichen Zellen aus T-75-Kolben mit PBS und Transfer in 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 200 g für 10 min. </li><li> Überstand entfernen, auszusetzen Zellpellet in 10 ml vorgewärmten VEGF Medien. </li><li> Bestimmen Sie, Zellkonzentration mit einer Zählkammer oder ähnliche Zellzählung Gerät. </li><li> Berechnen Menge an Zellsuspension, um entweder auf 6-Well-Platte (400.000 / well) oder 12-Well-Platte mit Deckgläsern hinzufügen (50.000 / Well). HUVECs werden bereit für Experimente am nächsten Tag. </li></ol> 4. Überlebensassay Invasion / Interaction(Überzug) Anmerkung: Bei der Durchführung dieses Tests, bereiten zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Endothelzellen auf 400.000 Zellen / Well. Eine Platte wird verwendet, um Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Die andere Platte wird für intrazelluläre Bakterien ausmachen. Die 6-Lochplatte ermöglicht Triplikaten von zwei Proben in einem Experiment durchgeführt werden. Für einen Überblick über dieses Protokoll finden Sie in der Überlebensassay Flussdiagramm (Abbildung 2) zu entnehmen. <ol><li> Bereiten anaerobe Bakterien, wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 1), bis sie Mitte der log-Wachstums (OD 660 von 0,5 bis 0,7) zu erreichen. </li><li> Zentrifuge Bakterien bei 5.000 × g für 10 min. Hinweis: Wenn Zentrifuge außerhalb anaeroben Kammer führen Bakterienproben in einem dicht verschlossenen 15 ml-Tube, wickeln Sie die Kappe mit Parafilm zu Sauerstoff Auslaufen zu verhindern. </li><li> Zeigen pelletiert P. gingivalis zurück in der Kammer, Überstand verwerfen. Erneut mit PBS waschen, Pellet-Bakterien vor Resuspendieren in VEGF michdia. Vorbereitung Suspensionen für alle Bakterienstämme bei einer OD 660 von 0,7, die bis zur mittleren log-Phase (~ 7 x 10 8 Zellen / ml) entspricht, getestet werden. Die Bakterien sind nun bereit für die Infektion. </li><li> Transfer 6-Well-Platten, die HUVECs von Gewebekultur-Inkubator in anaeroben Kammer. Entfernen Sie das Medium und dreimal mit anaeroben PBS. 2 ml der anaeroben VEGF Medien in jede Vertiefung und legen die Platten bei 37 ° C in der anaeroben Inkubator für 20 Minuten, um die Temperatur für eine Infektion zu äquilibrieren. Hinweis: Platte Bakterien auf Blutagarplatten, diejenigen für die Infektion verwendet, sicherzustellen, sind homogen und nicht nach Infektion kontaminiert. </li><li> Infizieren Wirtszellen mit Bakterien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI Bakterien: Host) von 100: 1. Anmerkung: HUVEC-Zellzahl durch Ausführen einer Trypanblau-Ausschlusstests an einem einzigen Bohrloch vor der Infektion bestimmt. Bakterienzellzahl wird über die optische Dichte bestimmt (beispielsweise von 0,5 OD = 5 x 10 8 Zellen / ml). Bacterial Konzentration auf richtige MOI basierend auf HUVECs Konzentration 21 eingestellt. </li><li> Legen Sie 6-Well-Platten mit infizierten HUVECs in anaeroben Inkubator und lassen Bakterien mit Wirtszellen für 30 Minuten zu interagieren. </li><li> Vorbereitung Saponin in BHI (1,0% w / v) in der anaeroben Kammer und filtriert durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Überleben beider befestigt und verinnerlicht Bakterien. <ol><li> Platten entfernen aus dem Inkubator, absaugen Medien, waschen dreimal mit anaeroben PBS und 2 ml gefiltert 1,0% Saponin (hergestellt wie in Schritt 4.8 beschrieben). Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen. </li><li> Kratzen Boden jeder Vertiefung mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und eine 1: 1-Verdünnung in BHI. </li><li> Fahren Sie mit seriellen Verdünnungen der Probe zu machen. Je nach Bakterienart und Konzentration, passen Verdünnungsreihen. Beginnen Sie mit 1: 100 oder 1: 1000 Verdünnungen. </li><li> Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wrap ter Platten in Parafilm und in der anaeroben Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Platten und zählen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit der Lichtbox manuell zählen Kolonien. Hinweis: KBE aufgezählt werden. Für größere Mengen an CFUs können Bilder aufgenommen werden, und Computersoftware kann verwendet werden, um die Zählung von CFUs erleichtern. </li></ol></li><li> Survival of verinnerlicht Bakterien. <ol><li> Platten entfernen aus dem Inkubator. Dreimal Waschen mit anaeroben PBS und 2 ml VEGF Medien, ergänzt mit Antibiotikum (300 ug / ml Gentamicin und 400 ug / ml von Metronidazol). </li><li> Inkubation für 1 Std. Achten Sie darauf, die Antibiotika zu testen, so dass sie zu 100% effektiv bei der die gewünschte Bakterienstamm zu töten und stellen Sie sicher, dass sie Wirtszellen 22,23 nicht durchdringen. </li><li> Absaugen Medien, 2 ml gefiltertes 1,0% Saponin. Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen. </li><li> Kratzen Sie unten auf jeder well mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und stellen Sie 1: 1-Verdünnung in BHI. </li><li> Bereiten Sie Verdünnungen der Probe (1: 100, 1: 1.000). </li><li> Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wickeln Sie Platten in Parafilm und in anaeroben Inkubator. </li><li> Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C Platten zu entfernen und zu zählen KBE. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung eines Protokolls für das Überleben von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen verwendet. Beide Assays für insgesamt bakterielle Überleben und das Überleben von verinnerlicht Bakterien können zur gleichen Zeit durchgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 5. Internalisierung von Bakterien in Wirts Cells (Fluoreszenz-Mikroskopie) Hinweis: P. gingivalis ist mit 2 &#39;bezeichnet, 7&#39;-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM ist ein nicht-fluoreszierendes membranpermeablen Farbstoff; ihre Umwandlung in Fluorescein BCECF über die Wirkung der intrazellulären Esterasen kann angeben Zellviabilität. P. gingivalis mit BCECF-AM-Farbstoff markiert und dann verwendet, um eukaryontische Zellen zu infizieren. Nach der Infektion werden die Zellen fixiert und mit DAPI und TRITC-Phalloidin markiert. Die DAPI-Färbung verwendet, um die eukaryotische Zellkern Fleck wird auch beschriften bakteriellen Zellkern, der eine Gegenmaßnahme, um nicht lebensfähige Bakterien, die nicht können metabolisch spalten BCECF-AM zu identifizieren bietet. Wirtszellen werden mit TRITC-Phalloidin rotem Aktin Farbstoff markiert. <ol><li> Autoklaven Deckgläser. Aseptisch Deck zu 12-Well-Platten hinzuzufügen vor der Aussaat Endothelzellen bei 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung. (Vorbereitet Tag vor Versuch) </li><li&gt; Haben Endothelzellen auf 18 mm (# 1.5 Dicke) kreisförmige Deckgläser hergestellt in Platten mit 12 Vertiefungen wie oben beschrieben. </li><li> Bereiten anaeroben Bakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (OD 660 = 0,5-0,7), wie in Kapitel 1 beschrieben. </li><li> Wasch Bakterien 2x mit anaerober PBS durch Zentrifugation bei 5.000 × g und Suspensions Pellet in PBS bei 5-7 x 10 8 Zellen / ml. </li><li> Werden 20 ul 0,2 mM BCECF-AM bis 2 ml Bakteriensuspension (5-7 x 10 8 Zellen / ml) zu einer Endkonzentration von BCECF-AM von 2 uM. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Übertragungsplatten mit Endothelzellen auf 18 mm (# 1.5 Dicke) kreisförmigen Deckgläser von Gewebekultur-Inkubator ausgesät in den anaeroben Kammer. Mit PBS und Austausch mit anaeroben VEGF Medien waschen. Hinweis: Überprüfen Sie, ob HUVECs werden unter einem Lichtmikroskop gesund. HUVECs sollte ~ 80% konfluent waren, sollten vergleichbare Morphologie für die Hersteller sein. </li><li> Centrifuge markierten Bakterien an5.000 × g für 10 min, um restliche BCECF-AM Farbstoff zu entfernen. Suspend in 2 ml anaeroben VEGF Medien. </li><li> Infizieren Wirtszellen mit markierten Bakterien bei einer MOI von 100: 1 (Bakterien: Host). </li><li> Inkubieren in anaeroben Kammer bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Nach der Infektion Wasch Zellen mit PBS dreimal und in frisch hergestellten 4,0% Para fix für 10 min. Hinweis: Nach der Fixierung von Zellen, kann Experiment außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden. </li><li> Waschdeckgläser mit PBS dreimal. </li><li> 1 ml 0,2% Triton X-100 für 10 min. </li><li> Waschdeckgläser mit PBS dreimal. </li><li> Dann werden 50 ul des TRITC-Phalloidin (50 ug / ml) auf Deckgläsern für 45 min. </li><li> Wash Deckgläser dreimal, von der 12-Well-Platte und setzen Sie auf einem Objektträger mit Soft-Set Eindeckmedium enthält DAPI. Dichten Sie die Seiten mit Nagellack. Hinweis: Die Objektträger können für ein paar Monate im Dunkeln gelagert werden. Vermeiden Sie Belichtung zur Photobleaching zu verhindern. </li><li> Blick gleitetmit einem konfokalen Mikroskop. <ol><li> Hier verwenden Sie ein 34-Kanal spektrale System (32-Kanal-Array-Detektor und zwei Seiten PMT-Detektoren, sowie eine Durchlichtdetektor) um eine AxioObserver (invertiert) konfiguriert, stehen mit einem motorisierten XY-Tisch. Das System verfügt über fünf Laser: blau-Diode (405 nm), mit mehreren Leitungen Argon (458, 488, 514 nm), grüne Diode (561 nm), roten HeNe (633 nm) und einem 440 nm gepulsten Laser. Anlegen eines Fluorescence Lifetime Imaging-System mit 2-Hybrid GaAsP Detektoren (für FRET-FLIM). </li><li> Detektieren die Fluoreszenz von DAPI und TRITC in einem Kanal unter Verwendung eines Dual-Band-Filter mit Anregungswellenlängen von 340-380 nm und 540-560 nm und einem Emissionsfilter von 435 bis 485 nm und von 570 bis 590 nm. Detektieren die Fluoreszenz von BCECF-AM unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 440 bis 500 nm und einem Emissionsfilter von 510 bis 590 nm. Hinweis: Steuerungen für BCECF-AM sollte auf jedem Bakterienstamm durchgeführt werden untersucht, um die ordnungsgemäße Kennzeichnung der lebensfähigen Bakterien zu gewährleisten. Zuerst überprüfen, dass nonviable Bakterien sind DAPI-positive und BCECF-negativ. Zweitens, sicherzustellen, dass lebende Bakterien können BCECF-AM in Fluorescein BCECF verstoffwechseln. Variable Konzentrationen der Bakterien oder BCECF-AM Farbstoff eventuell auf optimaler Kennzeichnung geprüft werden. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Alle oben genannten Verfahren können verwendet werden, um spezifische Assays, um die Wechselwirkung von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen beurteilen zu entwerfen. Jedoch gibt es einige Überlegungen, die Versuche erfolgreich durchzuführen. Zuerst gibt es die Mikrobenstämme in einer Studie verwendet werden. Es ist von entscheidender Bedeutung bei dem Vergleich von zwei Stämmen sowohl mit dem Überlebens-Assay sowie durch Mikroskopie-Analyse, daß sie sich in einer ähnlichen W...

Anaerobe Bakterien besiedeln fast alle Oberflächen des menschlichen Körpers. Obwohl überwiegend in der Flora des Darm und Urogenitaltrakts, wo Sauerstoffkonzentrationen sind niedrig, es gibt sie auch in hohen Konzentrationen auf der Haut, Mund, Nase und Rachen 1. Anaerobe Bakterien sind eine häufige Ursache von endogenen Infektionen und werden häufig von erkrankten Stellen isoliert. Jedoch aufgrund ihrer Natur anspruchsvolle Anaerobier können schwierig zu isolieren und Kultur. Studien mit anaeroben Bakterien sind unter eingeschränkten Bedingungen durchgeführt werden. Moderne anaeroben Kulturtechniken es den Forschern ermöglichen, um die anaerobe Einstellungen erforderlich, um viele anaerobe Laborstämmen oder klinischen Isolaten 2,3 studieren zu imitieren. Pathogenen anaeroben Bakterien haben eine dynamische Beziehung und Co-Evolution mit den Wirtszellen in dem sie wohnen entwickelt. Esten Anaerobier sind anfällig für das Töten von der Immunantwort des Wirts vor Erreichen infectischiedenen Ebenen. Allerdings haben einige pathogene Bakterien Mechanismen zu entkommen oder untergraben die Wirtsimmunantwort entwickelt. Sie erreichen dieses Ziel durch Mechanismen wie Umgehung der Immunerkennung, Neutralisation von Immunmediatoren, Veränderung der zellvermittelten Immunität, Invasion von Wirtszellen und Veränderung der Immunsignal 4. Porphyromonas gingivalis, eine Gram-negative anaerobe sowohl mündlich als auch in Verbindung gebracht extraoralen Erkrankungen, ist ein Beispiel eines hoch angepasst bakterielles Pathogen Lage verursacht pathogenen Veränderungen im Aufnahme 5-7. Taschen der Biofilm Plaque in tiefen Spalten zwischen den Zähnen und Zahnfleischschleimhautgewebe gebildeten anaeroben Bakterien, die von Luftsauerstoff 8 geschützten Hafen abgegrenzt. Diese Zahnfleischtaschen dienen als Nische für verschiedene anaerobe Erreger wie P. gingivalis 9. P. gingivalis ist eine Keystone-Erreger, der in der Lage ist, umgestaltening die mündliche mikrobiellen Gemeinschaft in einer Weise, die Entwicklung und Progression von Parodontalerkrankungen 10 zu fördern. Es erzeugt eine große Anzahl von Virulenzfaktoren, die aktiv sind gegen ein breites Spektrum von Wirtsproteinen und stellt Mechanismen für die Umgehung der Wirtsabwehr 11. Es ist auch in der Lage eindringenden Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Parodontalligament Zellen in vitro und in vivo-12-14 15. Durch die effiziente Invasion von Wirtszellen, P. gingivalis kann Wirtsimmunität zu entkommen. Effektive Invasion von Wirtszellen ermöglicht nicht nur das Bakterium, um Wirtsabwehr zu entkommen, sondern dient auch als Reservoir für künftige Re-Infektion als auch verändert die Wirtszelle. Untersuchungen der molekularen Mechanismen der Adhäsion und Internalisierung des Bakteriums durch Wirtszellen beteiligt sind, erforderlich ist. Forschung in mehreren Laboratorien wird auf das Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Internalisierung von P. assoziiert konzentriert gingivalis durch die Wirtszellensowie die verwendet werden, um zu unterdrücken und zu entführen, die Immunantwort und zu überleben, die feindlichen Abwehrmechanismen Mechanismen. Es gibt viele Tests, die die Identifizierung und Charakterisierung von Krankheitserregern, die in der Lage ist eindringenden Wirtszellen sind. In vitro-Studien mit anaerobe Pathogene Jedoch stellen viele experimentelle Probleme für die Forscher vor allem, weil es schwierig ist, Untersuchungen mit sperrigen Instrumente in Abwesenheit von Sauerstoff zu bauen. Dies wird durch die Tatsache, dass eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, zu wachsen und müssen somit separat in Gewebekultur-Inkubatoren hergestellt werden verstärkt. Ein Weg, um solche Hindernisse zu vermeiden, wäre es, die Untersuchungen unter atmosphärischem Sauerstoff durchzuführen, aber das würde das Wachstum von anaeroben Bakterien unmöglich machen. Ein weiteres Verfahren wäre die durch Wärme abgetöteten Bakterien zu verwenden, um zu infizieren und zu studieren Host-Zell-Interaktionen. Zwischen Hitze abgetöteten und lebensfähigen Bakterien, die die Relevanz der Wirt-Pathogen interacti verringern bestehen jedoch Unterschiedeam 16. Es ist von zentraler Bedeutung für lebensfähige Bakterien mit unveränderter Expression Interaktion mit Wirtszellen zu studieren; Daher sind Verfahren zur Züchtung von P. gingivalis in einer anaeroben Umgebung gegeben. Auch sind zwei einfache kosteneffektive Protokolle zur Bewertung der Fähigkeit von P. zeigten gingivalis durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) internalisiert werden. Das erste Protokoll basiert auf dem beliebten Antibiotikum-Schutz-Assay basiert. Obwohl der Test ist einfach, sind Überlegungen bei der Verwendung von anaeroben Mikroorganismen gegeben. Das zweite Protokoll erfordert die Verwendung eines fluoreszierenden Scanning-Mikroskop zur Visualisierung Interaktion und verinnerlicht P. gingivalis. Jeder Test hat seine Grenzen und Vorteile, die diskutiert werden, den Forscher eine Gliederung für die Untersuchung der Invasivität von anaeroben Bakterien bereitzustellen. Obwohl die aktuelle Manuskript studiert P. gingivalis und HUVECs können diese Protokolle für viele andere anaerobe Bakterien ebenso verwendet werdenwie für andere Arten von Wirtszellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Anaerobe Bakterien weit zahlenmäßig überlegen Aerobier in vielen menschlichen Nischen wie dem Darm, Mund und Vagina. Darüber hinaus sind anaerobe Infektionen häufig und oft indigener Herkunft. Die Fähigkeit einiger anaerobe Erreger an menschliche Zellen einzudringen gibt ihnen adaptive Maßnahmen zur angeborenen Immunität zu entfliehen sowie Wirtszelle Verhalten zu modulieren. Jedoch sicherzustellen, dass die anaeroben Bakterien sind im experimentellen Untersuchung der Ereignisse kann Herausforderungen mit sich bringen zu Hause sind. Porphyromonas gingivalis, ein Gram-negative anaerobe, ist in der Lage eine Vielzahl von eindringenden eukaryotischen Nicht-Fresszellen. Dieser Artikel beschreibt, wie man erfolgreich Kultur und Beurteilung der Fähigkeit von P. gingivalis die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) einzudringen. Zwei Protokolle wurden entwickelt: ein, um Bakterien, die erfolgreich eindringen kann und zu überleben, in dem Wirt, und der andere, um Bakterien Interaktion mit Wirtszellen sichtbar zu messen. Diese Techniken erfordern die Verwendung eines anaeRobic Kammer P. liefern gingivalis mit einer anaeroben Umgebung für ein optimales Wachstum. Das erste Protokoll ist auf der antibiotischen Schutz-Assay, die weitgehend verwendet wird, um die Invasion von Wirtszellen, die durch Bakterien Studie. Jedoch ist die Antibiotikum-Schutzassay beschränkt; nur intrazelluläre Bakterien, die nach Behandlung mit Antibiotika und Host-Zell-Lyse kultivierbar sind, werden gemessen. Um alle Bakterien, die Interaktion mit Wirtszellen, sowohl lebenden und toten beurteilen wir ein Protokoll, das Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktion untersuchen entwickelt. Bakterien fluoreszent mit 2 &#39;bezeichnet, 7&#39;-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein-acetoxymethylester (BCECF-AM) und verwendet, um eukaryotische Zellen unter anaeroben Bedingungen zu infizieren. Folgende Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit 0,2% Triton X-100, werden Wirtszellen mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert, um den Zellkern und Cytoskelett beschriften sind. Mehrere images zu verschiedenen Schwerpunkten (Z-Stack) getroffen werden für zeitlich-räumliche Visualisierung von Bakterien erhalten. Verfahren in dieser Studie verwendet wird, kann auf jede kultivierbare anaerobe und jegliche eukaryotische Zelltyp angewendet werden.

Protokolle oben umrissen wurden bei der Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen P. verwendet gingivalis und Endothelzellen. P. gingivalis W83 und P. gingivalis V3150, welches eine Deletion des PG0228 wurden in der Studie verwendet. Das PG0228 vorhergesagt wird, ein Protein, das die Pegel der RNA und Proteinen verändern können, was sich letztlich auf eine Wechselwirkung von P. kodieren gingivalis mit Wirtszellen. Um die Wirkung der PG0228 auf P. unt...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

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Serie: Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...