Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. Los macrófagos derivados de médula ósea El cultivo y la polarización de hueso <ol><li> Día 0: Aislar fémur y la tibia huesos de 6-10 semanas de edad ratones de interés (C57BL / 6 en este ensayo). </li><li> Retire el tejido muscular de los huesos y colocar los huesos en un 9 cm petri plato lleno de helado de PBS. </li><li> La transferencia de los huesos a un plato de Petri de 9 cm llena de etanol al 70% y agitar suavemente la placa durante 30 segundos. </li><li> La transferencia de los huesos a un nuevo máximo 9 cm placa de Petri llena de PBS estéril enfriado con hielo. </li><li> Cortar el fémur y la tibia en ambos extremos con tijeras estériles. </li><li> Lavar los huesos con 10 ml de PBS estéril enfriado con hielo utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Recoger la médula ósea en un tubo de 50 ml. </li><li> Transferencia de las células de médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml utilizando una aguja de 23 G. </li><li> Repita este paso con una aguja de 25 G. Nota: Se necesitan estos pasos para eliminar grupos de células y restos óseos. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Deseche el supernatant y resuspender las células en medio de 40 ml de células de cultivo (RPMI-1640 más 2 mM L-glutamina, 10% de FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y 15% filtrada L-929 celular ( ATCC, CCL-1) medio -conditioned que contiene M-CSF (o alternativamente 10 ng ml M-CSF / recombinante en lugar de L-929 medio celular acondicionado). Nota: La generación de medio celular acondicionado L-929 se detalló anteriormente en esta revista en 2013. 11 </li><li> Cultura de las células de un ratón en dos 15 cm placas de Petri (no utilice placas de cultivo tratadas con células desde los macrófagos no se separará de este plástico) en 20 ml de medio de cultivo por la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Añadir 10 ml medio de cultivo celular fresco en días 3, sin la eliminación de los 20 ml de medio de cultivo celular mayor. </li><li> Sustituir el viejo medio de cada placa con 20 ml de medio de cultivo fresco en el día 6. Hacer esto, también se eliminarán las células no adherentes. </li><li> Día 8: <ol><li> Separe las células incubándolas 5 men por lo 37 ° C en 10 ml de solución salina de citrato (cloruro de potasio 135 mM más citrato de sodio 15 mM en H 2 O, autoclave) y se lava con 10 ml de PBS. Cuente macrófagos óseas maduras derivadas de la médula (BMDM) el día 8 usando un contador de células. </li><li> Verificar la formación de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante inspección visual o por citometría de flujo. Bloque 10 5 células con anti-CD16 centésima / CD32 en PBS durante 20 minutos en 100 l de PBS, se incuban con 1/200 anti-CD11b-FITC además 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a TA, lavado y analizar por citometría de flujo. Nota: los macrófagos derivados de médula ósea de ratón El cultivo se ha publicado en detalle anteriormente en esta revista por Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Sembrar las células 50.000 (recuentos de células óptimas necesitan ser optimizados) por pocillo en una microplaca de cultivo de células en 100 l de medio de cultivo. No sembrar células en los pozos de corrección de fondo (A1, A12, H1, H12) y poner medio solamente (sin células) en estos pozos. Sugerencia: Mantenga la pipeta en un ángulo uncombate de la mitad del lado de los pozos para la capa celular más homogénea. </li><li> Permita que las células se asienten a temperatura ambiente en una campana de cultivo de células durante 1 hora. Esto promoverá la distribución uniforme de células y reducir los efectos de borde. Supervisar el cumplimiento con un microscopio y la cultura en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tres horas después de la siembra, estimular las células durante 24 horas con 10 ng / ml de LPS, o 20 ng / ml recombinante de ratón IL-4 para generar M1 o M2 macrófagos, respectivamente. Incluir los macrófagos no tratados naïve (M0) como control. Evaluar adecuada M1 y M2 macrófagos polarización mediante la medición de la secreción de IL-6, IL-12 inducida por LPS, TNF (ELISA) y IL-4 inducida por la arginasa-1 actividad y / o MMR (CD206) y MGL (CD301) expresión en la superficie (citometría de flujo) como se describió anteriormente 3,11. Nota: En este punto, las células pueden ser (pre) tratados con compuestos con farmacológicas de interés o macrófagos pueden ser estimulados con otros factores. Dado que, la variación entre pocillos separados podría ser substantial, es recomendable usar al menos 4 e idealmente 6 pocillos por condición. </li></ol> 2. Preparación del ensayo extracelular Flux <ol><li> Hidratar el cartucho del sensor un día antes de realizar el ensayo: <ol><li> Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. </li><li> Llenar cada pocillo de la placa de utilidad con 200 l de solución de calibrante y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad sumergiendo los sensores en la solución calibrante. </li><li> Verifique el nivel de solución calibrador es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos y lugar en un no-CO 2 incubadora a 37ºC O / N. </li></ol></li><li> Preparar medio de ensayo en el día del ensayo como sigue: <ol><li> Cálido medio 50 ml de base XF a 37 ° C. </li><li> Añadir 500 l 200 mM de L-glutamina para obtener una mM concentración final 2. </li><li> Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar con un filtro de 0,2 M y mantener el medio de ensayo a 37 ° C. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el medio de cultivo celular de los macrófagos polarizadas y almacenarla a -20 ° C para su uso futuro (por ejemplo, ELISA para examinar la polarización de macrófagos adecuada). Lavar las células con medio de ensayo 100 l, añadir 180 l de medio de ensayo por pocillo y verificar bajo el microscopio que las células no se lavaron de distancia. Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37ºC sin CO 2 durante 1 hora antes de realizar la prueba. </li><li> Prepare 10 x compuesto inyección de mezclas de A hasta D tal como se describe en la Tabla 1, se calienta a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y esterilizar filtro. <ol><li> Hacer todos los compuestos en estas mezclas a 10x la concentración final en los pocillos de cultivo celular y optimizar estas concentraciones para cada tipo de célula. </li></ol></li><li> Cargue el cartucho del sensor usando las guías de carga provistos de volúmenes indicados (Tabla 1) de los preparados 10x mezclas de compuestos de la inyección en los puertos A, B, C y D, respectively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Mezcla / Inyección </td><td> Compuestos </td><td> El volumen agregado de conseguir 10x mezcla de (l) </td><td> Volumen medio de ensayo (ml) </td><td> Volumen inyectado durante la marcha (l) </td><td> La concentración final en el ensayo </td></tr><tr><td> LA </td><td> 2,5 M (45%) de glucosa </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> segundo </td><td> 5 mM oligomicina A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td> do </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Solución 100 mM de piruvato sódico </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> re </td><td> 5 mM antimicina A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Rotenona 5 mM (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 M </td></tr></tbody></table> Tabla 1. mezclas de inyección. 3. Caracterización Bioenergético de polarizado M1 y M2 BMDM utilizando un extracelular Flux Analizador <ol><li> Crear una plantilla de ensayo con el asistente de ensayo con MIX 2 minutos y 3 veces minutos medir y (al menos) 3 mediciones de mezcla y de tipos de bucles antes de cada una de las 4 inyecciones (Tabla 1) y después de la última inyección. Nota: Estas concentraciones son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos, pero deben ser optimizados para cada tipo de célula. Se necesita Adición de piruvato en la mezcla de FCCP para alimentar la respiración máxima. </li><li> Empieza la carrera empujando la parte inferior de inicio y siga las instrucciones del aparato. Primera carga el cocheplaca de cartucho con las sondas hidratados para permitir la calibración de aparatos y próxima carga la placa celular. </li><li> Después del ensayo, desechar cuidadosamente todo medio de ensayo y almacenar la cultura de microplacas celulares analizadas a -20 ° C para una futura normalización de células usando el kit de ensayo de proliferación celular como se describe en detalle por el proveedor. <ol><li> Brevemente, preparar un tampón de lisis celular 1x diluyendo el componente B de 20 veces en agua destilada y diluir el compuesto A 400 veces en el tampón de lisis celular 1x. Añadir 200 l por pocillo, incubar 5 minutos a temperatura ambiente y medir la fluorescencia con ~ 180 nm de excitación y de ~ 520 nm máximos de emisión. Nota: Cuando se trabaja con las células no adherentes o si la mala adherencia es una preocupación, el kit de proliferación celular directa se puede utilizar como una alternativa ya que este protocolo no requiere desechar todo medio de ensayo. Sin embargo, este protocolo directa es ligeramente menos sensible en comparación con el protocolo utilizado en este laboratorio. </li></ol></li><li> Después de la medición de la fluorescencia, normalizarel recuento de células en cada pocillo como una relación en la que el recuento de células promedio de todos los pocillos de macrófagos no tratados previamente se ha fijado en 1. Nota: La cuantificación de proteínas (por ejemplo, usando un ensayo de BCA) podría ser utilizado como una forma alternativa para normalizar los recuentos de células. Sin embargo, en nuestras manos este ensayo fue menos sensible en comparación con el kit de ensayo de proliferación celular. </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. 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H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Hoeksema, M. 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El libre acceso a este artículo es patrocinado por Seahorse Bioscience.

El objetivo de nuestro laboratorio es entender cómo la polarización y la función de los macrófagos pueden ser influenciados con el objetivo final de mejorar el resultado de la aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias 12. Para evaluar la polarización de macrófagos, se mide típicamente los LPS (+ IFN) inducida por IL-4 y-inducidos de expresión génica de los genes marcadores M1 y M2 (qPCR), determina IL-6, IL-12, TNF y secreción de NO (por ELISA y Griess reacción) y examina inducida por IL-4 CD71, CD206, CD273 y CD301 expresión en la superficie (por citometría de flujo) y la actividad arginasa 3,13. Adicionalmente, ensayos de apoptosis (por Anexina-V / tinción PI), ensayos de fagocitosis (con perlas fluorescentes de látex y / o pHrodo E. coli) y ensayos de formación de células espumosas (por captación de Dil-oxLDL, la tinción de lípido neutro LipidTOX) se pueden realizar para evaluar la funcionalidad de los macrófagos 14. Además, el análisis de flujo extracelular se puede realizar para medir la bioenergética perfiles de mac polarizadorophages como una lectura funcional nuevo y alternativo. Este manuscrito muestra que la polarización de macrófagos induce la reprogramación metabólica con macrófagos inducida por LPS de conmutación a un aumento de la glucólisis como su fuente de energía. Por el contrario, los macrófagos M2 inducida por IL-4 utilizan la fosforilación oxidativa mitocondrial como la principal fuente de ATP. Es importante destacar que la reprogramación metabólica no sólo proporciona la energía para las necesidades particulares de M1 y M2 macrófagos polarizadas. De hecho, los cambios metabólicos afectan las concentraciones de metabolitos que son reguladores directos del fenotipo de los macrófagos 10,15,16. Por lo tanto, el metabolismo de los macrófagos no sólo es una característica (como se muestra aquí en la Figura 2), sino también un conductor de distintos estados de polarización de macrófagos y este nuevo conocimiento apoya el rápido crecimiento del área de investigación immunometabolism durante el último par de años. Sin embargo, las mediciones robustas de perfiles metabólicos en macrofagos seguido siendo difícil y tenían sus limitaciones. En este estudio, un analizador de flujo extracelular se aplica para medir la firmeza glucólisis, reserva glucolítica, la capacidad glucolítica máxima, la acidificación no glucolítica, basal y la respiración máxima, la producción de ATP, la capacidad respiratoria repuesto, fuga de protones y la respiración no mitocondrial en tiempo real en una cantidad mínima de los macrófagos. Por lo tanto, hemos modificado y mejorado los protocolos del fabricante de la siguiente manera. La Prueba de Estrés Mito estándar (# 103015-100) sugiere el uso de medio con glucosa y piruvato y un protocolo con 3 inyecciones (OM, FCCP, AA / Rot). Optamos para iniciar el ensayo con glucosa / medio-piruvato libre, añadir la glucosa como una primera inyección en el puerto A (como en el glucólisis Estrés Prueba # 103020-100) y añadir piruvato junto con el desacoplador FCCP en el puerto C. De esta manera , todos los parámetros relevantes glucólisis se derivan de las mediciones ECAR 1-9 y toda la información relevante acerca de mitochondrial partir de mediciones de la función OCR 4-15. Tenga en cuenta que es fundamental para inyectar piruvato junto con FCCP para alimentar la respiración máxima sobre desacoplamiento. Antes de utilizar este protocolo combinado, también hay que verificar que 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) disminuye los niveles de ECAR después del ensayo a los valores basales (1-3) y que las tasas de ECAR grabadas 4-6 son de hecho debido a la glucólisis. Además, se debe comprender que las concentraciones de los productos y el número de células utilizadas en este manuscrito son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos y deben ser optimizados para otros tipos de células. Por otra parte, hay que señalar que M-CSF que se usa para generar los macrófagos derivados de médula ósea promueve un fenotipo anti-inflamatoria M2-similares. Los resultados presentados a partir de macrófagos derivados de médula ósea pueden ser, por tanto, no ser totalmente comparables a las mediciones con los macrófagos residentes tejido primario o macrófagos líneas celulares que no requieren M-CSF durante Culturi celularng. En comparación con los métodos existentes, este protocolo requiere cantidades mínimas de los macrófagos y rápidamente ofrece prácticamente todas las características fundamentales de células metabólicas. Esto resulta en suficientes células excedentes para llevar a cabo otros ensayos inmunológicos e incluso las células usadas para la bioenergética de perfiles todavía podría ser utilizado para otros propuesto después del ensayo. Además, el formato de placa de 96 pozo en particular permite la evaluación de múltiples condiciones en tiempo real al mismo tiempo. Sin embargo, la variación entre los pozos individuales puede ser considerable y por lo tanto a menudo se desea el uso de al menos 4 pocillos por condición. Tomado en cuenta esta limitación, el análisis de flujo extracelular descrito todavía permite ejecutar más de 10 condiciones experimentales (n = 6) a la vez, lo que es mucho más que las técnicas tradicionales. En general, este artículo proporciona un ensayo funcional fácil y reproducible que permite medir toda la glucólisis relevante y param mitocondrialetros en subconjuntos de macrófagos polarizadas. Esta técnica puede servir como una aplicación futura para evaluar la función de los macrófagos y para evaluar el efecto de manipulaciones distintas (por ejemplo, genes derribar, nuevos productos farmacéuticos, etc.) en (metabólica) fenotipo de los macrófagos. Como tal, los datos de flujo extracelulares pueden ser utilizados en conjunción con otros ensayos para permitir la caracterización en profundidad de el estado de activación de los macrófagos.

Mientras que los macrófagos juegan un papel central en prácticamente todas las enfermedades, los mecanismos moleculares que regulan su fenotipo todavía no están totalmente desenredado. Los macrófagos muestran gran heterogeneidad y en respuesta a la microambiente adoptan diferentes fenotipos 1. LPS (+ IFN) inducida clásicamente activados M1 o M (LPS) macrófagos promueven la inflamación y protegen al huésped frente a diferentes tipos de amenazas microbianas 2. Otros utilizan IFN solo o en combinación con TNF como estímulos para provocar M1 polarización. IL-4 y / o IL-13 induce la activación de macrófagos alternativa y estos M2 o células M (IL-4) son potentes supresores y reguladores de la respuesta inmune en curso 3. Macrófagos polarizadas muestran una regulación distinta del metabolismo celular con macrófagos M1 activados con LPS de someterse a un cambio metabólico para mejorar la glucólisis 4-6. Oxidación de ácidos grasos contrario, mejorado (FAO) y oxidativ mitocondriale fosforilación (fosforilación oxidativa) proporciona energía sostenida en los macrófagos M2 inducidas por IL-4 7-9. Por lo tanto, el metabolismo alterado no sólo es una característica de los subconjuntos de macrófagos polarizadas, también es un requisito previo para la polarización adecuada y la regulación inflamatoria. Es importante destacar que la inhibición de la glicólisis o la fosforilación oxidativa / FAO se ha demostrado que la activación deteriorar M1 o M2, respectivamente 8,10. Como tal, la identificación de los cambios metabólicos en los macrófagos podrían aplicarse como una herramienta para evaluar su estado de polarización y potencial inflamatorio. Por consiguiente, un ensayo consistente que mide el metabolismo de macrófagos podría ser utilizado para predecir si un fármaco, gen derribar u otro tratamiento afecta a la polarización y la función de los macrófagos. En este video, un analizador de flujo extracelular se utiliza para caracterizar los perfiles bioenergética de ingenuos, M1 y M2 macrófagos. Este manuscrito detalla un protocolo optimizado que permite la mediciónde todos los parámetros relevantes glucólisis (glucólisis, glucólisis máxima y reserva glucolítica) y características de la función mitocondrial (respiración total, la respiración mitocondrial basal, la producción de ATP, de fugas de protones, la respiración máxima y capacidad respiratoria repuesto) en un solo ensayo. El uso de este sistema experimental, bioenergética se pueden comparar entre el control y &#39;alterado&#39; (por ejemplo, gen tumbar, la sobreexpresión transgénica o tratamiento farmacológico) células.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Después de terminar el ensayo y la cuantificación de células de flujo extracelular, los datos se pueden normalizar para el recuento de células y se analizaron. Normalmente, esto dará lugar a ECAR y OCR parcelas como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B. Después de la inyección de glucosa (A), el aumento de ECAR representa la tasa de glucólisis. El aumento adicional de la ECAR después de la inhibición ATP sintasa con oligomicina (B) proporciona información acerca de la reserva glicolítica y la capacidad (Figura 1A). Al analizar los valores de OCR, oligomicina inyección (B) permite el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis de ATP mitocondrial. FCCP (C) desacopla la respiración mitocondrial y las mediciones de OCR correspondientes dió datos sobre la máxima y la capacidad respiratoria de repuesto. Por último, la inyección de rotenona (Rot) y antimicina A (AA) bloquean mitocondrial complejo I y III y el OCR residual representa los contras de oxígeno no mitocondrialesumption (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figura 1: Parámetros metabólicos derivados de un ensayo de flujo de XF extracelular. (A) A raíz de los parámetros de la glucólisis celular se calcula a partir de los valores ECAR (en MPH / min): glucólisis, la máxima capacidad glucolítica y reserva glucolítica. Mediciones (B) OCR (en pmoles / min) se utilizan para calcular los siguientes parámetros fundamentales de la función mitocondrial: respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración y la máxima capacidad respiratoria de repuesto. Gluc = glucosa; OM = oligomicina A; FCCP = cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona; AA = antimicina A; Rot = rotenona <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de la carrera, ECAR y OCR mediciones 1 till 15 para cada pozo se puede exportar a Excel y los siguientes parámetros glucolíticas puede calcularse a partir de las mediciones ECAR de la siguiente manera: La acidificación no glucolítica = avg. ECAR (1,2,3) La glucólisis = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) Máxima capacidad glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Reserva glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) A partir de las tasas de OCR, los próximos características metabólicas se pueden determinar: La respiración para no mitocondrial = avg. OCR (13,14,15) Respiración basal = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) La producción de ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Protón fuga =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respiración máxima = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) = promedio. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figura 2:. Características metabólicas de naïve (M0), LPS (M1) y la IL-4- (M2) macrófagos polarizadas Para cada medición, la media y el error estándar de la media (SEM) de 8 pocillos individuales se presenta. (A) las tasas de acidificación extracelular (ECAR, en mph / min) y (b) Las tasas de consumo de oxígeno (OCR, en pmoles / min) se miden de manera diferencial polarizado (M1 y M2) y macrófagos ingenuos (M0). Todas las mediciones se normalizaron para el recuento de células (tal como se mide con CyQUANT) y el recuento de células promedio de los macrófagos no tratados previamente se fijó en 1. Eninyección A = glucosa; B = oligomicina; C = FCCP; D = antimicina A + rotenona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Como se muestra en la Figura 2A, la activación de macrófagos con LPS induce aumento del metabolismo glicolítico. Las diferencias entre LPS y macrófagos tratados con IL-4 son aún más evidente cuando se mira en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en la Figura 2B. En efecto, mientras que el metabolismo oxidativo máxima es altamente suprimida en M (LPS), IL-4 induce la respiración basal y especialmente máxima en los macrófagos M2. Hay que señalar que el aumento de glicolítica es bastante singular de M (LPS) macrófagos y no es necesariamente una característica de los macrófagos M1 desde M (IFN) macrófagos no se muestran a mejorar la glucólisis. En general, este análisis de flujo extracelular demuestra thainducida IL-4-t macrófagos M2 se caracterizan por el metabolismo oxidativo mejorado y sobre todo una gran capacidad respiratoria repuesto (SRC), mientras que la pantalla LPS-macrófagos activados mejora el metabolismo glucolítico y no posee ninguna capacidad respiratoria de repuesto.

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Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K vistas.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Video: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Investigación

Inmunología e Infección

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

Polarización de células y análisis de células y análisis derivados de monocitos humanos M1 y M2 con citometría de flujo sobre la infección por mycobacterium tuberculosis

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea para el estudio de la biología NO-redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...