Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
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R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son muy tóxico y cancerígeno. Todas las etapas que implican disolventes orgánicos nocivos, en particular la extracción de los productos de reacción y la derivatización de los ácidos grasos deben llevarse a cabo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados ). Todas las operaciones que implican organismos modificados genéticamente en este trabajo requieren instalaciones que están aprobados para el manejo de organismos modificados genéticamente del nivel de seguridad S1. 1. Expresión de la descarboxilasa recombinante en E. OLET JE coli <ol><li> Preparación de la cepa de producción <ol><li> Preparar un gen sintético de OLET JE de Jeotgalicoccus y se clonó en el vector de expresión pASK-IBA37plus como se describe. 8 </sup&gt; NOTA: Para evitar la degradación de los ácidos grasos por las enzimas del metabolismo bacteriano, E. se utilizó coli cepa JW5020 de la colección de Keio con una vía disfuncional para la degradación de ácidos grasos. </li></ol></li><li> El cultivo y la inducción de la expresión de la enzima <ol><li> Preparar un precultivo inoculando la E. coli JW5020 OLET mutante de una placa de LB-(que contiene 100 mg ml -1 ampicilina) en dos de 3 ml de medio LB en tubos de ensayo. Ampicilina pipeta (100 mg ml -1) de una solución madre en el medio de selección y se incuba a 37 ° C durante 15 horas en una incubadora de agitación a 180 rpm. </li><li> Añadir 2 ml de las culturas pre-dos 200 ml de medio LB, que contenía ampicilina (100 mg ml -1), en 1 L de frascos de agitación. La incubación tiene lugar a 37 ° C y 180 rpm. </li><li> Monitorear el cambio en OD 600nm después de la inoculación. Cuando el OD 600 alcanza un valor entre 0.6 unad 0,8 inducir la expresión mediante la adición de tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubar los cultivos durante 15 horas a 20 ° C y 180 rpm. NOTA: Como OLET JE contiene un cofactor hemo, es necesaria la adición de ácido levulínico δ-amino (0,5 mM) antes de la inducción para proporcionar el cultivo con un precursor para la síntesis de cofactor. </li></ol></li><li> La lisis celular <ol><li> Llevar a cabo los siguientes pasos en el hielo. La transferencia de las culturas por decantación o pipeteo en tubos de centrífuga y el uso de una escala para garantizar la igualdad de distribución. Centrifugar los cultivos durante 20 minutos a 12.000 xga 4 ° C. </li><li> desechar con cuidado el sobrenadante y volver a suspender los pelets en 50 ml de tampón (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) mediante pipeteo y la transferencia de la suspensión en un tubo de centrífuga cónico. </li><li> Después de la centrifugación durante 15 minutos a 4000 xga 4 ° C descartar el sobrenadante, resuspender cada sedimento en 3 ml de tampón por pipeteado. </li><li> Realizar la lisis celular por lonicating las soluciones en hielo (tres ciclos x 30 seg), dejando una pausa de 1 minuto entre los ciclos. Centrifugar las soluciones durante 20 min a 15.000 xg a 4 ° C para eliminar los desechos de células y transferir el sobrenadante a un tubo de centrifugación cónico sin perturbar el sedimento por pipeteado. Se desecha el precipitado. NOTA: Una fracción de disolvente se puede utilizar directamente para la biocatálisis después de moléculas pequeñas se eliminan. La segunda fracción será utilizado para la purificación de la Su-etiquetados OLET JE. </li></ol></li><li> La eliminación de pequeñas moléculas de celulares extractos <ol><li> Antes de usar el extracto crudo en la biocatálisis eliminar pequeñas moléculas que podrían interferir con la formación de peróxido de hidrógeno o de transferencia de electrones con la pipeta 3 ml de extracto libre de células en una unidad de filtro de centrífuga con una membrana y se centrifuga 10 kDa a 4000 xga 4 ° C. Resuspender la proteína restante en 3 ml de Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> La purificación del OLET </strong&gt; <ol><li> Aplicar 3 ml de la segunda extracto celular a sus columnas de centrifugación Pur Ni-NTA, que han sido equilibrada con tampón de equilibrio antes de (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). </li><li> Sellar las columnas con los tapones inferiores y superiores tapones de rosca y agitar ligeramente hasta que la resina se distribuye por igual con el extracto libre de células. Incubar las columnas cargadas de 30 min en un agitador de cabeza a 4 ° C. </li><li> Lavar las columnas con 1 ml de tampón de lavado (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) por centrifugación a 700 xg durante 2 min. Repita este paso dos veces. </li><li> Colocar las columnas en un tubo de centrifugación cónico fresco y añadir 1 ml de tampón de elución (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Centrifugar a 700 xg durante 2 minutos y repetir este paso dos veces. NOTA: El imidazol se unirá a níquel y por lo tanto eliminar OLET JE de la columna. </li><li> La transferencia de la elución de una unidad de filtro de centrífuga (10 kDa membrana) y centrifugar a 4000 xg a 4 ° C para eliminar el imidazol. </li><li> Comprobar la pureza de la enzima por una SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 l de la elución con un tampón de SDS-(1x concentración final) e incubar la solución a 95 ° C durante 5 min para la desnaturalización. Posteriormente aplicar la cantidad total en una SDS-PAGE. Correr el gel a 35 mA usando un patrón de proteína comercial. Detectar la proteína a 50 kDa. </li><li> Para determinar la concentración de proteína disponible utilizar un BSA-kit comercial. Pipeta de 50 l de proteína de las muestras diluidas (1: 100, 1: 200, 1: 500) y patrón de BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) en una placa de 96 pocillos . Añadir 200 l de reactivo de Bradford, medir la absorbancia a 595 nm después de 15 min con un fluorímetro y calcular las concentraciones usando la curva estándar. </li></ol></li></ol> 2. Biotransformación-Light catalizada <ol><li> Reacciones biocatalíticas sin adición de peróxido de hidrógeno<ol><li> Preparar una solución de 10 ml de stock de 10 mM de ácido esteárico (M r 284,5 g mol -1) mediante la adición de 10% (v / v) Tergitol y 0,0284 g de ácido esteárico a agua destilada. Calentar la solución en una cámara de calentamiento a 60 ° C hasta que el ácido graso está completamente disuelto. </li><li> Biocatálisis y toma de muestras <ol><li> Preparar dos 2 ml de mezclas de reacción que contienen mM EDTA 50, FMN 0,01 mM, ácido esteárico 0,5 en Tris-HCl-buffer. Añadir una barra de agitación magnética para el suministro de oxígeno suficiente y colocar los tubos de vidrio en un baño de agua, se calentó a 25 ° C. </li><li> Añadir 200 g ml-1 de enzima purificada o 10% (v / v) de extracto libre de células a cada uno de las mezclas de reacción y iluminarlos con una bombilla de vidrio transparente (120 W) en 15 cm de distancia de los tubos de reacción. </li><li> Tomar muestras de 200 l en puntos de tiempo específicos (0, 10, 30, 60 y 120 min y durante la noche) detener la reacción con HCl 20 l 37%. Añadir 5 l de ácido mirístico (10 mM de modolución) como estándar interno. </li></ol></li></ol></li><li> Análisis de productos de la reacción <ol><li> Para la extracción de añadir 500 l de acetato de etilo a las muestras dos veces, invertir los tubos y centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. </li><li> Despegue 400 l del sobrenadante y dejar que el disolvente se evapore por completo. </li><li> Derivatizar los ácidos carboxílicos en ácido trimethylsilylcarboxylic mediante la adición de 200 l N -metil- N - (trimetilsilil) trifluoro acetamida (MSTFA). Incubar la solución a 60 ° C durante 30 min con el fin de convertir los grupos hidroxilo para trimetilsilil éteres. </li><li> Determinación de la conversión mediante GC / FID NOTA: Determinar la formación de 1-heptadeceno (RT: 8,34 min), ácido esteárico α- y β-hidroxi (RT: 12,05 y 12,1 min) y la disminución del sustrato (RT: 11,15 min) utilizando GC / FID. <ol><li> Establecer el perfil de temperatura se describe a continuación Configurar la temperatura de inyección de 340 ° C. Sostenerla temperatura inicial de la estufa es a 90 ° C durante 3,5 min y posteriormente se incrementa con 45 ° C min-1. A 220 ° C, mantener la temperatura durante 2 minutos. Después de un aumento repetido de 45 ° C min-1, mantenga la temperatura a 280 ° C durante 2 minutos y luego aumentar con 60 ° C min-1. NOTA: La temperatura máxima de 330 ° C se mantuvo durante 1,44 minutos. </li><li> Inyectar 4 l de la muestra, con una relación de división de 5 para obtener la volatilización rápida y mezcla homogénea con el helio gas portador. NOTA: En función de la temperatura creciente del sustrato y los productos entrarán en la fase de gas. Las sustancias son detectadas por el detector / FID GC después de pasar a la columna en tiempos de retención específicos y se muestran como los picos en la pantalla. Observar la formación de pico en el monitor. </li><li> Calcular la concentración de producto formado por la siguiente fórmula: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; NOTA: El factor de calibración se ha determinado específicamente para este columna para cada sustrato y el producto mediante el cálculo de la curva estándar de cantidades conocidas de las sustancias derivatizadas y su área del pico correspondiente. </li></ol></li><li> Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS. <ol><li> Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS. Establecer el perfil de temperatura. Ajuste la temperatura de inyección de 250 ° C. Mantenga la temperatura del horno a 100 ° C durante 5 minutos y posteriormente se incrementará con 20 ° C min-1. NOTA: La temperatura máxima se mantiene durante 7,5 min. </li><li> Ajuste la temperatura del detector espectrómetro de masas a 250 ° C y escanear de 50 a 500 m / z en el modo de impacto electrónico. NOTA: Electron ionización de impacto elimina un solo electrón como resultado la formación de un catión radical que se hace pasar hacia adelante para el análisis de masas. Debido a los altos enlaces covalentes de energía dentro de la intramolarruptura molécula de la creación de fragmentos de menor m / z. Estos fragmentos forman una huella digital específica para una sustancia. </li><li> Se inyecta 1 l de la muestra. Detectar 1-heptadeceno después de 11,4 min Tiempo de retención por la huella digital correspondiente (Figura 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La generación impulsada por la luz de peróxido de hidrógeno se puede aplicar para un rango de transformaciones redox, incluyendo peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 y P450 monooxigenasas 5. Es un enfoque sencillo y factible. A largo plazo, el uso de la luz visible se abre la perspectiva de utilizar la luz solar para las transformaciones químicas, que es una alternativa sostenible para las reacciones ricos en energía. El método es aplicable con la enzima purificada o con extracto libre de células. Mientras que este último requiere menos coste y el trabajo, hay que señalar que las pequeñas moléculas en el extracto crudo pueden interferir con la conversión de la luz catalizada. Un enfoque posible es eliminar estos componentes pequeños con una micromembrana (es decir, por centrifugación en una unidad de filtro centrífugo o por diálisis). La concentración de la molécula captador de luz FMN determina la concentración del peróxido de hidrógeno. Dependiendo de la Affinity de la oxidorreductasa, esta concentración es determinante para la actividad enzimática. Otro factor importante es la concentración del EDTA sacrificial donante de electrones. El parámetro más importante, sin embargo, es la estabilidad de funcionamiento y la actividad de la enzima. El olefinization de ácidos grasos es una reacción elegante para la conversión de ácidos grasos de origen biológico en olefinas que pertenecen a las principales materias primas para la industria química. La descarboxilación biocatalıtica luz impulsada se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a pH neutro, que ofrece claras ventajas en términos de sostenibilidad. Nuestros resultados muestran que la generación in situ de peróxido de hidrógeno es una estrategia para suministrar el cofactor sin perjudicar la estabilidad de la enzima, lo que lleva a una conversión alta. Los métodos actuales para la regeneración del cofactor utilizan productos agrícolas o productos químicos derivados del petróleo. reacciones impulsada por la luz están surgiendo como alternativa renovable. Futurola investigación estará dedicada a los métodos para la sustitución del reactivo EDTA sacrificio por moléculas más baratos y para reducir la cantidad de la molécula de FMN captador de luz.

El cambio climático y el previsible agotamiento de los recursos renovables supone una seria amenaza para nuestra sociedad. En este contexto, la catálisis enzimática representa un potencial todavía no está completamente explotado para el desarrollo de la química sostenible y &quot;verde&quot; 1. Oxidorreductasas tienen la capacidad de catalizar la introducción y modificación de grupos funcionales bajo condiciones de reacción suaves y pertenecen a los biocatalizadores más importantes 2. La mayoría de las transformaciones redox requieren el suministro de externo de cofactores tales como NAD (P) H. Los métodos para la regeneración de cofactor se han aplicado en escala industrial. Sin embargo, todavía resultan en altos costos del proceso, lo que limita su aplicación sobre todo a los productos de alto valor. Curiosamente, varios peroxidasas 3,4 y monooxigenasas P450 5 aceptan electrones de peróxido de hidrógeno a través de la denominada shunt peróxido. Mientras que el H 2 O 2 es un co-reactivo barato, se informa harmful para muchas enzimas. Una constante en la formación in situ de bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno es un enfoque viable para conducir la reacción sin deteriorar la estabilidad operativa de la enzima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figura 1. Estructura de ensayo de la descarboxilación de los ácidos grasos photobiocatalytic por OLET JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> El uso de la luz como fuente de energía para los procesos químicos y biológicos ha estado recibiendo una atención creciente en los últimos años 6. Generación de luz impulsada de peróxido de hidrógeno se ha convertido en un método fácil y robusto para suministrar peróxido de hidrógeno para las transformaciones redox (Figura 1). Un fotocatalizador tal como flavina adenina lunonucleotide (FMN) permite la reducción de oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno, que se utiliza entonces como cofactor para la reacción enzimática oxyfunctionalization. donantes de electrones posibles son ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ascorbato o el formiato de bajo costo. El método es aplicable en general para el H 2 O 2 enzimas dependientes, incluyendo las peroxidasas 3,4 y monooxigenasas P450 5. Hemos investigado recientemente la aplicación de una novela descarboxilasa bacteriana 7 para la transformación de las grasas naturales en olefinas 8. Esto sería una vía sostenible para la síntesis de productos químicos plataforma ampliamente usadas de una fuente de base biológica. La descarboxilasa OLET JE de la bacteria Jeotgalicoccus sp gram-positiva. cataliza la descarboxilación oxidativa de los ácidos grasos y forma 1-alquenos como productos. OLET JE está estrechamente relacionado con monooxigenasas P450 bacterianas y necesita electrones fperóxido de hidrógeno rom para la reacción. Desafortunadamente, la adición de H 2 O 2 a una solución de sustrato y la enzima resultó en conversiones bajas y una mala reproducibilidad de los resultados, debido presumiblemente a un efecto perjudicial de peróxido de hidrógeno en la estabilidad de OLET JE. Generación de una proteína de fusión con la NADPH-reductasa RhFred realizó una descarboxilación dependiente de NADPH posible. 9 Sin embargo, el alto precio de NADPH y las limitadas posibilidades actuales para una regeneración rentable nos llevó a investigar donantes de electrones más baratos. Inspirado por la similitud de OLET JE con monooxigenasas P450, se utilizó la generación de luz catalizada por H 2 O 2. Tuvimos el placer de obtener altas conversiones (hasta&gt; 95%) utilizando extractos libres de células o soluciones de enzimas purificadas. Con el ejemplo de descarboxilación de ácidos grasos, se presenta un protocolo general para la enzima de la luz impulsadaATIC transformaciones redox utilizando FMN como el peróxido de hidrógeno como fotocatalizador y cofactor. Los métodos presentados incluyen la producción de la enzima en células recombinantes de E. coli, la purificación de la enzima, la aplicación para la síntesis de 1-alquenos y el análisis de los productos de reacción.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidorreductasas pertenecen a las enzimas industriales más aplicados. Sin embargo, necesitan electrones externos cuyo suministro es a menudo costoso y difícil. Reciclaje del NADH o NADPH donantes de electrones requiere el uso de enzimas adicionales y sustratos de sacrificio. Curiosamente, varios oxidorreductasas aceptan peróxido de hidrógeno como donante de electrones. A pesar de ser de bajo costo, este reactivo a menudo reduce la estabilidad de las enzimas. Una solución a este problema es la generación in situ del cofactor. El suministro continuo de la cofactor a baja concentración conduce la reacción sin deteriorar la estabilidad de la enzima. Este documento muestra un método para la luz catalizada por la generación in situ de peróxido de hidrógeno con el ejemplo de la descarboxilasa del ácido graso hemo-dependiente OLET JE. La decarboxilasa del ácido graso OLET JE fue descubierto debido a su capacidad única de producir de cadena larga 1-alquenos a partir de ácidos grasos, un enzimática hasta ahora desconocidoreacción. 1-alquenos son ampliamente utilizados para aditivos plastificantes y lubricantes. OLET JE se ha demostrado que aceptar electrones de peróxido de hidrógeno para la descarboxilación oxidativa. Mientras que la adición de peróxido de hidrógeno, la enzima daños y resulta en bajos rendimientos, la generación in situ del cofactor evita este problema. El sistema photobiocatalytic muestra claras ventajas con respecto a la actividad enzimática y el rendimiento, lo que resulta en un sistema simple y eficiente para la descarboxilación de ácidos grasos.

Mientras que la adición de peróxido de hidrógeno a la mezcla de reacción produjo bajo las conversiones (&lt;10%) a moderada, la generación in situ de peróxido de hidrógeno aumentado la conversión hasta una conversión del 80%. El análisis por GC / MS muestra la formación de olefinas a partir de ácidos grasos (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Perfil de temperatura para las mediciones de GC / MS. (B) de la huella digital de la elución 1-heptadeceno después de 11,4 minutos. (C) característica secundaria iones CnH2n-1 fragmento de olefinas terminales ejemplar mostrada por 1-heptadeceno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> E. coli. Una solución de enzima purificada mostró una clara correlación entre la concentración de enzima y la conversión. El aumento de la concentración del captador de luz de plomo molécula de FMN a conversiones más altas. Sin embargo, el aumento de la concentración por encima de 10 mM no acelerar aún más las reacciones, lo que indica que la cantidad de peróxido de hidrógeno es suficientemente disponibles y ya no el factor limitante. Además de la descarboxilación de los ácidos grasos, OLET JE también cataliza una hidroxilación en β-posición. En la conversión de ácido esteárico, la descarboxilación es de aproximadamente tres veces más rápido que la hidroxilación. En un experimento típico utilizando una solución de ácido esteárico 0,5 mM y 10 mM FMN, 99% del sustrato se convierte en una mezcla de 1-heptadeceno y ácido 2-hidroxiesteárico con una relación de3.3: 1 (Figura 3) 8. Una investigación del espectro de sustrato de la biocatálisis impulsada por la luz mostró que para los ácidos grasos con cadenas de acilo más largos, OLET JE cataliza preferentemente la descarboxilación, mientras que la cantidad relativa de los ácidos grasos hidroxilo en la mezcla del producto aumentó con la menor longitud de cadena. Los ácidos grasos más cortos que el ácido mirístico (C14) no fueron sometidos a la descarboxilación. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figura 3. Gas análisis cromatográfico de OLET JE mediada por descarboxilación de ácido esteárico (11,15 min) en 1-heptadeceno (8,4 min), ácido esteárico (12,04 min) ácido esteárico β-hidroxi α-hidroxi (12,1 min). Se muestra el cambio de las áreas de los picos de las muestras tomadas durante un transcurso de tiempo de 2 horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para competir</a>wa versión más grande de esta figura. Sorprendentemente, el ácido ácidos insaturados oleico (C18: 1D9 cis) y ácido linoleico (C18: 2d9d12) no fueron aceptados como sustratos, lo que indica que la configuración de trenzado de dobles enlaces cis no pueden alojarse en un modo de unión productiva en la enzima. La adición de ácido oleico (10%) también impidió que la conversión de ácido esteárico. Curiosamente, el ácido esteárico (C18: 1D9 trans) fue convertido por OLET JE, sin embargo, con actividad ligeramente inferior a continuación, el ácido esteárico.

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Se describe un protocolo para la generación de luz catalizada de peróxido de hidrógeno - un cofactor para las transformaciones oxidativas.

Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

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Carboxylic Acids

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10.6K vistas.  Ruhr Universität Bochum.  Se describe un protocolo para la generación de luz catalizada de peróxido de hidrógeno - un cofactor para las transformaciones oxidativas. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigación

Bioingeniería

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Asignación de metabolismo: Supervisar la actividad de la deshidrogenasa del lactato directamente en el tejido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Bioquímica

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reacciones de la cascada enzimática para la síntesis de aminoalcoholes quirales de L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Química

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biología

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Mapeo metabólico: Citoquímica enzimática cuantitativa y la histoquímica para determinar la actividad de Deshidrogenasas en células y tejidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Inmunología e Infección

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

Pérdida del grupo carboxilo como CO2: descarboxilación de β-cetoácidos

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...