La optogenética se ha utilizado para lograr títulos más altos de varios productos químicos y proteínas en comparación con los inductores típicos. Usando este protocolo, otros pueden mejorar sus propios procesos con control basado en la luz. El control de la optogenética no es invasivo, altamente sintonizable y reversible.
Estas cualidades permiten una optimización optimizada de los procesos microbianos e incluso abren oportunidades únicas, como fermentaciones trifásicas y control multicromático. Para cualquier producto químico nuevo, las condiciones óptimas de luz diferirán. Por lo tanto, si se observa una baja producción utilizando los parámetros de este protocolo, se deben probar diferentes condiciones de luz.
Comience por obtener una cepa de Saccharomyces cerevisiae con oxiotafia HIS3, un marcador necesario para los plásmidos OptoINVRT. Si se busca controlar un gen nativo de Saccharomyces cerevisiae, asegúrese de que la copia endógena del gen se elimine antes de continuar. Para comenzar la construcción de la deformación, linealice el plásmido que contiene el circuito OptoINVRT7, como EZL439.
Si utiliza EZL439, que contiene los componentes para reprimir el promotor PIGA en la luz y activarlo en la oscuridad, linealice en el sitio de restricción Pme1. Utilizando métodos estándar de transformación de acetato de litio, integre el plásmido en una cepa auxotrófica HIS3. Después de la transformación, centrífuga las células a 150 G durante un minuto.
Resuspender suavemente las células en 200 microlitros de medio SC-HIS fresco. Coloque todo el volumen celular en una placa de agar SC-HIS e incube a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan las colonias. Prepare células competentes utilizando protocolos estándar de transformación de acetato de litio.
Transforme las células con el plásmido que contiene los genes que desea controlar optogenéticamente aguas abajo de los promotores PIGA1M o PIGA1S. Después de la transformación, centrifugue el cultivo a 150 G durante un minuto y resuspenda suavemente el pellet celular en 200 microlitros de medio de abandono DE SC fresco. Placa todo el volumen celular en una placa de agar de peptona dextrosa de extracto de levadura, si se integra en sitios Delta o una placa de abandono SC si se transforma con un plásmido que contiene un marcador de selección.
Incubar las células a 30 grados Celsius durante 16 horas bajo luz azul constante para mantener el gen controlado optogenéticamente reprimido. Utilice cualquier fuente de luz de la longitud de onda de 465 nanómetros y coloque un panel LED aproximadamente 40 centímetros por encima de la placa de modo que la intensidad de la luz sea de aproximadamente 80 a 110 micromoles por metro cuadrado por segundo. Mide la intensidad usando un medidor cuántico.
Si se integra en los sitios Delta, replique la placa en placas de peptona dextrosa de extracto de levadura que contengan un rango de concentraciones de zeocina entre 400 microgramos por mililitro y 1, 200 microgramos por mililitro para seleccionar una variedad de números de copia de integración. Incubar las placas réplica a 30 grados Celsius bajo luz azul constante o pulsada durante dos o tres días hasta que aparezcan las colonias. Para realizar el cribado preliminar, seleccione ocho colonias de cada placa y utilícelas para inocular un mililitro de medio SC-HIS suplementado con 2% de glucosa en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
Cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius temblando a 200 revoluciones por minuto bajo una iluminación constante de luz azul. Al día siguiente, diluir cada cultivo en un medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa para obtener los valores de densidad óptica que van desde 0,01 a 0,3 a 600 nanómetros y hacer crecer los cultivos en estado de agitación 200 revoluciones por minuto bajo luz constante o pulsada a 30 grados centígrados hasta que la densidad óptica alcance entre dos y nueve. Luego, envuelva las placas con papel de aluminio, apague el panel de luz e incube las placas en la oscuridad durante cuatro horas a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto.
Centrifugar los cultivos en la placa de 24 pocillos a 234 G durante cinco minutos y resuspender las células en un mililitro de medio de abandono completo sintético fresco con 2% de glucosa. Selle las placas para evitar la evaporación del producto deseado utilizando cinta de sellado de microplacas estéril. Fermenta las placas selladas en la oscuridad durante 48 horas a 30 grados Centígrados agitando a 200 revoluciones por minuto.
Para cosechar las fermentaciones, centrífuga las placas durante cinco minutos a 234 G y transfiera 800 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Dependiendo del producto químico de interés, analice utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas por cromatografía de gases u otro método analítico utilizando la técnica de preparación de muestras más adecuada para el instrumento utilizado. Seleccione ocho colonias de cada placa y utilícelas para inocular un mililitro de medio SC-HIS con 2% de glucosa en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
Cultive las células durante la noche en la oscuridad a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando. A la mañana siguiente, diluya cada cultivo en un medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa a 0.1 densidad óptica. Envuelva las placas en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz y haga crecer el cultivo en la oscuridad a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando hasta que alcancen una densidad óptica de tres.
Luego, incuba las placas bajo luz pulsada durante 12 horas a 30 grados centígrados con 200 revoluciones por minuto agitando. Centrifugar los cultivos a 234 G's durante cinco minutos y resuspender en medio SC-HIS fresco con 2% de glucosa. Selle las placas para evitar la evaporación del producto deseado utilizando cinta de sellado de microplacas estéril.
Fermenta las placas selladas a la luz durante 48 horas a 30 grados centígrados agitando a 200 revoluciones por minuto. Después de realizar fermentaciones optogenéticas, la producción química se probó en un rango de densidades celulares en el momento de la inducción con dos circuitos. El circuito OptoINVRT7 demostró altos títulos de ácido láctico e isobutanol con una densidad celular óptima de valor de inducción de 7.0 y 8.75 en comparación con los circuitos OptoINVRT1 y 2.
Las fermentaciones utilizando los circuitos OptoAMP se estudiaron en tres fases definidas por diferentes ciclos de trabajo ligeros. La producción de ácido láctico se puede optimizar utilizando una fase de crecimiento pulsado y fases de inducción y producción totalmente iluminadas. La producción de isobutanol se optimizó utilizando una fase de crecimiento pulsado, una fase de inducción totalmente iluminada y una fase de producción pulsada.
Mientras que la biosíntesis de naringenina se optimizó mejor utilizando una inducción de crecimiento pulsado totalmente iluminada y una fase de producción oscura. El sistema OptoLAC se ha utilizado en E.Coli para producir factor de transcripción FDER en títulos que son comparables o superiores a los logrados mediante inducción química con IPDG. Los circuitos OptoLAC se han aplicado para producir mevalonato y la producción supera los títulos logrados mediante inducción IPDG.
La producción de mevalonato a nivel de biorreactor demuestra la escalabilidad y la capacidad de ajuste de la regulación optogenética para la producción química y de proteínas en bacterias más allá de los niveles de microplacas. Es importante asegurarse de que la intensidad de la luz esté en el rango adecuado para los pasos iluminados y que se evite la contaminación lumínica para los pasos que requieren oscuridad. Esta técnica allanó el camino para lograr títulos récord de isobutanol en levaduras, estabilizar poblaciones de consorcios con luz e incluso controlar el flujo metabólico utilizando orgánulos controlados por luz sintética.
