Name: light-driven enzymatic decarboxylation
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
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R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind akut toxisch und krebserregend. Alle Schritte schädlichen organischen Lösungsmitteln beteiligt, insbesondere die Extraktion der Reaktionsprodukte und die Derivatisierung von Fettsäuren müssen mit persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe unter einem Abzug durchgeführt werden ). Alle Transaktionen im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Organismen in dieser Arbeit erfordern Anlagen, die für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen der Sicherheitsstufe S1 zugelassen sind. 1. Expression des rekombinanten Decarboxylase OLET JE in E. coli <ol><li> Vorbereitung des Produktionsstammes <ol><li> Vorbereiten eines synthetischen Gens von OLET JE aus Jeotgalicoccus und kloniert in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus wie beschrieben. 8 </sup&gt; ANMERKUNG: Um den Abbau von Fettsäuren durch Enzyme , die aus den bakteriellen Stoffwechsel vermeiden, E. coli - Stamm JW5020 von der Keio - Sammlung mit einer dysfunktionalen Weg für den Abbau Fettsäure verwendet wurde. </li></ol></li><li> Der Anbau und die Induktion der Enzymexpression <ol><li> Bereiten Sie eine Vorkultur von der E. Impfen coli JW5020 OLET Mutante von einer LB-Platte (mit 100 ug ml -1 Ampicillin) in zwei 3 ml LB-Medium in Reagenzgläser. Pipette Ampicillin (100 ug ml - 1) aus einer Stammlösung in das Medium für die Selektion und inkubieren bei 37 ° C für 15 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 180 UpM. </li><li> 2 ml der Vorkulturen auf zwei 200 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 ug ml - 1), in 1 l Schüttelkolben. Inkubation schreitet bei 37 ° C und 180 rpm. </li><li> Überwachen Sie die Änderung in der OD 600nm nach der Inokulation. Wenn die OD 600 erreicht einen Wert zwischen 0,6 eind 0,8 induzieren die Expression von Tetracyclin Zugabe (0,2 ug ml -1). Inkubieren der Kulturen 15 Stunden lang bei 20 ° C und 180 rpm. HINWEIS: Da OLET JE einen Häm - Cofaktor enthält, Zugabe von δ-Aminolävulinsäure (0,5 mM) vor der Induktion benötigt wird, die Kultur mit einem Vorläufer für die Cofaktor - Synthese bereitzustellen. </li></ol></li><li> Zelllyse <ol><li> Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis. Übertragen Sie die Kulturen durch Abgießen oder Pipettieren in Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Skala gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Zentrifugation der Kulturen für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Sorgfältig den Überstand verworfen und die Pellets in 50 ml Puffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) durch Pipettieren resuspendieren und die Suspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. </li><li> Nach Zentrifugation für 15 min bei 4.000 × g bei 4 ° C Überstand verwerfen, jedes Pellet in 3 ml Puffer durch Pipettieren resuspendieren. </li><li> Führen Sie die Zelllyse durch sokation, die Lösungen auf Eis (drei Zyklen x 30 sec) eine 1 Minute Pause zwischen den Zyklen zu verlassen. Zentrifuge die Lösungen für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand in ein konisches Zentrifugenröhrchen übertragen, ohne das Pellet durch Pipettieren zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. HINWEIS: Ein Lösungsmittelanteil wird direkt für die Biokatalyse verwendet werden, nachdem kleine Moleküle entfernt werden. Die zweite Fraktion wird zur Reinigung des His-tagged OLET JE verwendet werden. </li></ol></li><li> Entfernung von kleinen Molekülen von Zellextrakten <ol><li> Vor der Verwendung der Rohextrakt in Biokatalyse kleine Moleküle zu entfernen, die mit Wasserstoffperoxid-Bildung oder Elektronenübertragung stören könnten durch Pipettieren von 3 ml zellfreien Extrakts in ein Zentrifugenfiltereinheit mit einer 10 kDa Membran und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C. Resuspendieren verbleibende Protein in 3 ml Tris-HCl-Puffer. </li></ol></li><li> Reinigung von OLET </strong&gt; <ol><li> Anwenden 3 ml der zweiten Zellextrakt His Pur Ni-NTA Spin-Säulen, die vorher mit Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) equilibriert wurden. </li><li> Verschließen Sie die Spalten mit den unteren Stopfen und oberen Schraubverschlüsse und schütteln Sie sie leicht, bis das Harz verteilt ist ebenso mit dem zellfreien Extrakt. Inkubiere die geladenen Spalten für 30 min in einem Überkopfschüttler bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Säulen mit 1 ml Waschpuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 20 mM Imidazol, pH 7,4) von bei 700 × g für 2 min zentrifugiert. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Legen Sie die Spalten in eine frische konische Zentrifugenröhrchen und 1 ml Elutionspuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Zentrifuge bei 700 xg für 2 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. HINWEIS: Imidazole an Nickel binden und somit OLET JE aus der Säule zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Elution in ein Zentrifugenfiltereinheit (10 kDa membran) und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C Imidazol zu entfernen. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit des Enzyms durch eine SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 ul der Elution mit einem SDS-Puffer (Endkonzentration 1x) und Inkubieren der Lösung bei 95 ° C für 5 Minuten zur Denaturierung. Anschließend gelten die Gesamtmenge auf einem SDS-PAGE. Führen Sie das Gel bei 35 mA Kommerzielle Protein-Standard. Erkennt das Protein bei 50 kDa. </li><li> die Proteinkonzentration verwenden, um einen kommerziell erhältlichen BSA-Kit zu bestimmen. Pipettieren von 50 &amp; mgr; l des verdünnten Proteinproben (1: 100, 1: 200, 1: 500) und BSA - Standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in einer 96-Well - Platte . In 200 ul Bradford-Reagenz, messen die Absorption bei 595 nm nach 15 Minuten mit einem Fluorimeter und berechnen die Konzentrationen der Standardkurve. </li></ol></li></ol> 2. Licht-katalysierte Biotransformation <ol><li> Biokatalytischen Reaktionen ohne Wasserstoffperoxid zusätzlich<ol><li> Bereiten Sie eine 10 ml Stammlösung von 10 mM Stearinsäure (M r 284,5 g mol -1) durch Zugabe von 10% (v / v) Tergitol und 0,0284 g Stearinsäure zu destilliertem Wasser. Die Lösung wird in einer Heizkammer auf 60 ° C bis die Fettsäure vollständig gelöst ist. </li><li> Biokatalyse und Probenahme <ol><li> Bereiten zwei 2 ml Reaktionsmischungen enthaltend 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM Stearinsäure in Tris-HCl-Puffer. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab für eine ausreichende Sauerstoffversorgung und legen Sie die Glasrohre in einem Wasserbad erhitzt auf 25 ° C. </li><li> In 200 ug ml -1 von gereinigtem Enzym oder 10% (v / v) zellfreien Extrakt zu jedem der Reaktionsgemische und beleuchten sie mit einem klaren Glas Glühbirne (120 W) in 15 cm Abstand der Reaktionsrohre. </li><li> Nehmen Sie 200 ul-Proben zu bestimmten Zeitpunkten (0, 10, 30, 60 und 120 min und über Nacht) Stoppen der Reaktion mit 20 &amp; mgr; l 37% HCl. In 5 ul Myristinsäure (10 mM Lager, solution) als interner Standard. </li></ol></li></ol></li><li> Analyse der Reaktionsprodukte <ol><li> Für die Extraktion 500 ul Ethylacetat zu den Proben zweimal hinzufügen, kehren die Rohre und Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g. </li><li> Nehmen Sie 400 ul des Überstandes und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig verdampfen. </li><li> Derivatisierung der Carbonsäuren in trimethylsilylcarboxylic Säure durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l N - Methyl - N - (trimethylsilyl) acetamid Trifluor (MSTFA). Inkubieren der Lösung bei 60 ° C für 30 min, um Hydroxylgruppen zu konvertieren Ethern Trimethylsilyl. </li><li> Bestimmung der Umwandlung durch GC / FID HINWEIS: Bestimmen der Bildung von 1-Heptadecen (RT: 8,34 min), α- und β-Hydroxystearinsäure (RT: 12,05 und 12,1 min) und die Abnahme des Substrats (RT: 11,15 min) unter Verwendung von GC / FID. <ol><li> Stellen Sie das Temperaturprofil unter Set die Einspritztemperatur auf 340 ° C beschrieben. Haltendie anfängliche Ofentemperatur bei 90 ° C für 3,5 min und anschließend mit 45 ° C min -1 erhöhen. Bei 220 ° C, halten Sie die Temperatur für 2 min. Nach einer wiederholten Anstieg von 45 ° C min -1, für 2 min die Temperatur auf 280 ° C zu halten und dann mit 60 ° C min -1 erhöht. HINWEIS: Die maximale Temperatur von 330 ° C für 1,44 min gehalten. </li><li> Injizieren 4 &amp; mgr; l der Probe, mit einem Teilungsverhältnis von 5 schnelle Verflüchtigung und homogene Vermischung mit dem Trägergas Helium zu erhalten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der das Substrat und Produkte geben Sie die Gasphase steigender Temperatur. Die Substanzen werden durch das GC / FID-Detektor detektiert, nachdem die Säule an bestimmten Retentionszeiten vorbei und werden als Spitzen auf dem Bildschirm angezeigt. Beachten Sie die Spitzenbildung auf dem Monitor. </li><li> Berechnen der Konzentration des gebildeten Produkts mit der folgenden Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; HINWEIS: Der Kalibrierungsfaktor durch Berechnung der Standardkurve, die speziell für diese Spalte für jedes Substrat und Produkt aus bekannten Mengen der derivatisierten Substanzen und ihrer entsprechenden Peakfläche bestimmt wurde. </li></ol></li><li> Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. <ol><li> Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Stellen Sie das Temperaturprofil. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 250 ° C. Halten Sie die Ofentemperatur auf 100 ° C für 5 min und anschließend mit 20 ° C min -1 erhöhen. HINWEIS: Die maximale Temperatur wird für 7,5 min gehalten. </li><li> Stellen Sie das Massenspektrometer Detektortemperatur auf 250 ° C und Scan bei 50 bis 500 m / z in Elektronenstoßmodus. HINWEIS: Elektronenstoß-Ionisation entfernt ein einzelnes Elektron, was zur Bildung eines Radikalkations, die für die Massenanalyse weitergeleitet Vorwärts wird. Aufgrund der hohen intramolar Energie kovalente Bindungen innerhalb derMolekül Bruchfragmente niedriger m / z zu schaffen. Diese Fragmente bilden einen Fingerabdruck spezifisch für eine Substanz ist. </li><li> Injizieren 1 &amp; mgr; l der Probe. Erfassen 1-Heptadecen nach 11,4 min Retentionszeit durch den entsprechenden Fingerabdruck (Abbildung 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid kann für eine Reihe Redox - Transformationen angewendet werden, einschließlich peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 und P450 Monooxygenasen 5. Es ist eine einfache und praktikable Ansatz. Auf lange Sicht, öffnet sich die Verwendung von sichtbarem Licht, die Perspektive auf Sonnenlicht für chemische Umwandlungen zu verwenden, die eine nachhaltige Alternative für energiereiche Reaktionen ist. Das Verfahren ist anwendbar mit gereinigtem Enzym oder mit zellfreien Extrakt. Während letztere weniger Kosten und Arbeit erfordert, sollte es, dass kleine Moleküle in dem Rohextrakt zu beachten, mit dem Licht katalysierte Umsetzung stören können. Eine praktikable Ansatz ist es, diese kleine Bauteile mit einem Mikro (dh durch Zentrifugation in einer Filterzentrifuge Einheit oder durch Dialyse) zu entfernen. Die Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN bestimmt die Konzentration des Wasserstoffperoxids. Je nach affinity der Oxidoreduktase ist diese Konzentration entscheidend für die Enzymaktivität. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Konzentration des Elektronendonors EDTA. Der wichtigste Parameter ist jedoch die Betriebsstabilität und Aktivität des Enzyms. Die Olefinierung von Fettsäuren ist eine elegante Reaktion zur Umwandlung von biobasiertem Fettsäuren in Olefine, die für die chemische Industrie zu den wichtigsten Rohstoffe gehören. Die lichtgetriebene biokatalytische Decarboxylierung kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und bei neutralem pH-Wert, die klare Vorteile in Bezug auf Nachhaltigkeit bietet. Unsere Ergebnisse zeigen , dass die in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid eine Strategie ist es, den Cofaktor ohne Beeinträchtigung der Enzymstabilität, was zu einer hohen Umwandlung zu liefern. Gegenwärtige Verfahren für Cofactorregenerierung landwirtschaftliche Erzeugnisse oder Benzin-basierten Chemikalien. Lichtgetriebene Reaktionen sind, sich als erneuerbare Alternative. ZukunftForschung wird für die Substitution des Opferreagenz EDTA durch billigere Moleküle und zur Verringerung der Menge der lichtsammelnden Molekül FMN Methoden gewidmet.

Der Klimawandel und die absehbare Erschöpfung der erneuerbaren Ressourcen stellt eine ernsthafte Bedrohung für unsere Gesellschaft. In diesem Zusammenhang stellt der Enzymkatalyse eine noch nicht voll ausgeschöpft Potenzial für die Entwicklung nachhaltiger und &quot;grüner&quot; Chemie 1. Oxidoreduktasen haben die Fähigkeit , die Einführung und Modifizierung von funktionellen Gruppen unter milden Reaktionsbedingungen zu katalysieren und 2 zu den wichtigsten Biokatalysatoren gehören. Die meisten redox Transformationen erfordern die Zufuhr von externer von Cofaktoren wie NAD (P) H. Verfahren zur Cofaktor-Regenerierung wurden in der industriellen Maßstab angewendet. Allerdings führen sie immer noch in hohen Prozesskosten, die ihre Anwendung vor allem auf hochwertige Produkte begrenzt. Interessanterweise akzeptieren mehrere Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5 Elektronen von Wasserstoffperoxid über den so genannten Peroxid - Shunt. Während H 2 O 2 eine günstige Co-Reagenz ist, ist es angeblich harmful für viele Enzyme. Eine stetige in - situ - Bildung von niedrigen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ist eine praktikable Vorgehensweise, die Reaktion anzutreiben, ohne die Betriebsstabilität des Enzyms zu beeinträchtigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsaufbau der photobiocatalytic Decarboxylierung von Fettsäuren durch OLET JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Verwendung von Licht als Energiequelle für die chemische und biologische Prozesse erhalten hat zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren 6. Lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid wurde als einfache und robuste Methode entstanden zu Wasserstoffperoxid für Redox - Transformationen (Abbildung 1) liefern. Ein photokatalytischer wie Flavin-Adenin-mononucleotide (FMN) ermöglicht die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid, das dann als Cofaktor für die enzymatische Oxyfunktionalisierung Reaktion verwendet wird. Mögliche Elektronendonoren sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ascorbat oder die preiswerte Formiat. Das Verfahren ist allgemein anwendbar für die H 2 O 2 -abhängige Enzyme, einschließlich Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5. Wir haben untersucht , kürzlich die Anwendung einer neuen bakteriellen Decarboxylase 7 für die Transformation von natürlichen Fetten in Olefine 8. Dies wäre eine nachhaltige Weg zur Synthese von weit verbreiteten Plattform Chemikalien aus einem bio-basierte Quelle sein. Die Decarboxylase OLET JE aus dem gram-positiven Bakterium Jeotgalicoccus sp. katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Fettsäuren und bildet 1-Alkenen als Produkte. OLET JE ist eng mit bakteriellen P450 Monooxygenasen bezogen und muss Elektronen from Wasserstoffperoxid für die Reaktion. Leider führte die Zugabe von H 2 O 2 zu einer Lösung von Substrat und Enzym in geringen Umsätze und eine schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, vermutlich aufgrund einer schädlichen Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die Stabilität von OLET JE. Die Erzeugung eines Fusionsproteins mit der NADPH-Reduktase RhFred machte eine NADPH-abhängige Decarboxylierung möglich. 9 Dennoch ist der hohe Preis von NADPH und der derzeit begrenzten Möglichkeiten für eine kosteneffiziente Regeneration veranlasste uns , billiger Elektronendonoren zu untersuchen. Inspiriert durch die Ähnlichkeit der OLET JE mit P450 Monooxygenasen, haben wir das Licht katalysierte Erzeugung von H 2 O 2. Wir waren sehr zufrieden hohe Umsätze zu erhalten (bis zu&gt; 95%) unter Verwendung von zellfreien Extrakten oder gereinigten Enzymlösungen. Am Beispiel der Fettsäure Decarboxylierung präsentieren wir ein allgemeines Protokoll für die lichtgetriebene enzymTransformationen atic redox Verwendung FMN als Photokatalysator und Wasserstoffperoxid als Cofaktor. Die vorgestellten Verfahren umfassen die Herstellung des Enzyms in einer rekombinanten Zelle von E. coli, Reinigung des Enzyms, die Anwendung für die Synthese von 1-Alkenen und die Analyse der Reaktionsprodukte.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxidoreduktasen gehören zu den am häufigsten angewandten industriellen Enzymen. Dennoch müssen sie externe Elektronen, deren Versorgung ist oft teuer und schwierig. Recycling der Elektronendonoren NADH oder NADPH erfordert die Verwendung von zusätzlichen Enzymen und Opfersubstraten. Interessanterweise akzeptieren mehrere Oxidoreduktasen Wasserstoffperoxid als Elektronendonor. Während kostengünstig sind, reduziert dieses Reagenz oft die Stabilität von Enzymen. Eine Lösung dieses Problems ist die in situ Erzeugung des Cofaktors. Die kontinuierliche Zufuhr des Cofaktors bei niedriger Konzentration treibt die Reaktion ohne die Enzymstabilität zu beeinträchtigen. Dieses Papier zeigt ein Verfahren für die Licht-katalysierten in situ - Erzeugung von Wasserstoffperoxid mit dem Beispiel des Häm-abhängigen Fettsäure Decarboxylase OLET JE. Die Fettsäure-Decarboxylase OLET JE wurde aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , entdeckt zu langkettigen 1-Alkene aus Fettsäuren produzieren, eine bisher unbekannte enzymatischeReaktion. 1-Alkene sind weit Additive für Weichmacher und Gleitmittel verwendet. OLET JE hat sich gezeigt , Elektronen von Wasserstoffperoxid zum oxidativen Decarboxylierung zu akzeptieren. Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid schädigt das Enzym und führt zu geringen Ausbeuten, umgeht in situ - Erzeugung des Cofaktors dieses Problem. Das photobiocatalytic System zeigt deutliche Vorteile in Bezug auf die Enzymaktivität und Ausbeute, was zu einer einfachen und effizienten System für die Fettsäure Decarboxylierung.

Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu dem Reaktionsgemisch in niedrigen Umwandlungen führte zu moderieren (&lt;10%), erhöht in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid die Umwandlung bis zu 80% Umsatz. Die Analyse durch GC / MS zeigt die Bildung von Olefinen aus Fettsäuren (Abbildung 2). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Abbildung 2 (A) Temperaturprofil für die GC / MS - Messungen. (B) Fingerabdruck des 1-Heptadecen eluierenden nach 11,4 min. (C) Charakteristische sekundären C n H 2n-1 Fragment - Ionen von Terminal exemplarischen Olefinen für 1-Heptadecen gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> E. coli. Eine gereinigte Enzymlösung zeigte eine klare Korrelation zwischen Enzymkonzentration und Umwandlung. Eine Erhöhung der Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN führen zu höheren Umsätzen. Jedoch die Erhöhung der Konzentration von mehr als 10 mM nicht weiter um die Reaktionen zu beschleunigen, was darauf hinweist, dass die Menge an Wasserstoffperoxid ausreichend vorhanden ist und nicht mehr der begrenzende Faktor. Zusätzlich zu der Decarboxylierung von Fettsäuren, OLET JE katalysiert auch eine Hydroxylierung in β-Position. Bei der Umwandlung von Stearinsäure, ist die Decarboxylierung etwa dreimal schneller als die Hydroxylierung. In einem typischen Experiment wurde eine Lösung von 0,5 mM Stearinsäure und 10 &amp; mgr; M FMN, 99% des Substrats unter Verwendung wurden zu einer Mischung aus 1-Heptadecen umgewandelt und 2-Hydroxystearinsäure mit einem Verhältnis von8 1 (3): 3.3. Eine Untersuchung des Substratspektrums der Biokatalyse lichtgetriebenen zeigte , dass Fettsäuren mit längeren Acylketten, OLET JE bevorzugt die Decarboxylierung katalysiert, während die relative Menge an Hydroxyl-Fettsäuren in der Produktmischung mit kürzerer Kettenlänge erhöht. Fettsäuren kürzer als Myristinsäure (C14) hat unterzogen werden nicht Decarboxylierung. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die gaschromatographische Analyse OLET JE -vermittelten Decarboxylierung von Stearinsäure (11.15 min) in 1-Heptadecen (8,4 min), α-Hydroxystearinsäure (12,04 min) β-Hydroxystearinsäure (12,1 min). Die Veränderung der Peakflächen von Proben über einen zeitlichen Verlauf von 2 h genommen wird angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">um</a> die <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">vie</a>wa größere Version dieser Figur. Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen ungesättigten Säuren Ölsäure (C18: 1D9 cis) und Linolsäure (C18: 2d9d12) wurden nicht als Substrate akzeptiert, was darauf hinweist , dass die verdrillten Konfiguration cis - Doppelbindungen nicht in einem produktiven Bindungsmodus in dem Enzym untergebracht werden. Zugabe von Ölsäure (10%) verhindert auch die Umwandlung von Stearinsäure. Interessanterweise Stearinsäure: wurde (C18 1D9 trans) durch OLET JE umgewandelt, doch mit etwas geringeren Aktivität dann Stearinsäure.

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Wir beschreiben ein Protokoll für die Licht-katalysierte Erzeugung von Wasserstoffperoxid - einen Cofaktor für oxidative Umwandlungen.

Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

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Carboxylic Acids

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Serie: Light-driven Enzymatic Decarboxylation

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Ein Toolkit zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in wässrigen Umgebungen aktivieren

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Forschung

Biotechnik

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biochemie

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Chemie

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologie

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Immunologie und Infektion

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

Verlust der Carboxygruppe als CO2: Decarboxylierung von β-Ketosäuren

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...