This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Nota: Este protocolo contiene instrucciones sobre cómo utilizar una columna de fibras discontinuas de poliéster en un sistema HPLC junto con múltiples detectores para la detección de multiplexado. El protocolo se ha escrito asumiendo que el lector tiene conocimientos básicos y experiencia en cromatografía y diversos métodos de detección de HPLC. Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) para todos los materiales y los reactivos antes de su uso (es decir, Pedidos de metanol). Asegúrese de que el uso de todas las prácticas apropiadas de seguridad al manejar disolventes y High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluyente. Asegurar el uso apropiado de los controles de ingeniería de HPLC, el equilibrio y el detector de la instrumentación analítica, y asegurar el uso de equipos de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados). 1. Configuración de HPLC Instrumento <ol><li> Preparar el instrumento HPLC con agua ultrapura (por ejemplo, el 100% de agua Milli-Q) para line A y 100% de metanol para la línea B como fase móvil y purgar las bombas según el requisito del fabricante. Si uno de los detectores usados ​​es MS, ya que es aquí, añadir ácido fórmico 0,1% a ambas fases móviles A y B. </li><li> Configurar el HPLC componentes instrumentales y detectores como se ilustra en la Figura 2. Esto requiere la colocación conveniente de detectores relativos a la columna para minimizar el volumen muerto entre el detector y la columna. La flexibilidad en la configuración del sistema HPLC es deseable. </li></ol> 2. Configuración de la radiación UV-Vis y MS Detectores <ol><li> Ajuste el detector de UV-Vis a la longitud de onda deseada depende de la muestra de interés (por ejemplo, 280 nm). </li><li> Ajuste el detector de MS en modo positivo para el conde de iones totales (TIC) análisis según el método de detección de Análisis completo. También ajustar los siguientes parámetros de MS en consecuencia: temperatura del vaporizador 500 ° C, temperatura del capilar 350 ° C, gas vaina fijado en una tasa de 60 unidades, el flujo de gas auxiliar40 y barrer el flujo de gas a 5 unidades, y el voltaje de pulverización 3,5 kV. Estos ajustes se pueden ajustar más adelante para conocer los requisitos específicos de usuarios que dependen de la muestra que se está analizando. </li></ol> 3. Preparación de 2,2-difenil-1-Radical picrilhidrazil (DPPH •) Reactivo de configuración de DPPH • Detector System <ol><li> Pesar 25 mg de DPPH • y disolver en 250 ml de metanol en un matraz aforado. </li><li> Añadir 250 ml de ácido fórmico al DPPH • reactivo. Tapar el matraz en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. </li><li> Sonicar el matraz que contiene el reactivo para DPPH • 10 min. </li><li> Purgar la bomba de DPPH • con el preparado DPPH • reactivo según el requisito del fabricante. </li><li> Configurar el sistema de DPPH • acuerdo con la Figura 2 conectando la línea de la bomba a la entrada de una pieza en T. </li><li> Adjunte una bobina de reacción de l 100 a the salida de la pieza en T y conectar el otro extremo de la bobina de reacción al detector. </li><li> Encajona en el serpentín de reacción en un calentador de columna y ajustar la temperatura del calentador de la columna a 60 ° C. </li><li> Ajuste el DPPH • UV-Vis detector a 520 nm. </li></ol> 4. Configuración de Columna PSF <ol><li> Conectar la entrada de la columna de la PSF al instrumento HPLC. </li><li> Conectar el puerto central al detector MS, utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID. </li><li> Conectar un puerto periférico al detector de UV-Vis utilizando una longitud de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID. </li><li> Conecte otro puerto de periféricos de la pieza en T del sistema de detección de DPPH • utilizando una longitud de 15 cm de tubo Identificación del 0,13 mm. </li><li> Bloquear el puerto de periféricos no utilizados usando un tapón de columna. </li><li> Llevar la velocidad de flujo de la bomba de HPLC a 1 ml min -1 a 100% de la línea B - 100% de metanol (ácido fórmico al 0,1%). </li><li> Equilibrar la columna con el pH móvil metanol 100%ase durante 20 min para una columna mm de longitud 4,6 mm de diámetro x 250. Esta vez se escala de acuerdo a las dimensiones de otras columnas el usuario puede emplear. </li></ol> 5. Ajuste la Columna PSF para la detección multiplexada <ol><li> Medir la masa de al menos dos recipientes de recogida vacíos (uno para el puerto conectado al detector de UV-Vis y uno para el detector de DPPH •) utilizando una balanza analítica. </li><li> Recoger la fase móvil desde el UV-Vis y los puertos de DPPH • en dos recipientes de recogida, pesadas previamente separadas (5.1). Anote el período de tiempo para la colección. Recoge al menos 500 mg de disolvente en cada buque. </li><li> Sopesar los recipientes de recogida y determinar la masa de la fase móvil. Teniendo en cuenta la densidad del metanol es 0,791 g ml -1, determinar el volumen de fase móvil recogido de cada puerto. </li><li> Por diferencia, es decir, conjunto de caudal de la bomba nominal menos la tasa de flujo a través del DPPH • y UV-Vis Detectopuertos de flujo r, determinan la velocidad de flujo al detector MS. Expresar cada proporción de flujo como un porcentaje del flujo total. Nota: Idealmente, los porcentajes de flujo son: para la MS es 18% de la velocidad de flujo total, a la UV-Vis 22%, a la DPPH • detector 60%. </li><li> Si no es así, ajustar los porcentajes de flujo cambiando la presión de nuevo en el detector UV-Vis. Por ejemplo, si el flujo a la UV-Vis es demasiado alta, disminuir la proporción mediante la adición de añadir una sección de 15 cm de tubo de 0,13 mm ID a la salida del detector de UV-Vis. A continuación, repita los pasos 5.1 a 5.5. </li></ol> 6. Condiciones de instalación Finales <ol><li> Ajuste el caudal de la bomba de DPPH • reactivo a la misma velocidad de flujo que sale del puerto de salida conectado al detector DPPH •. Nota: La columna PSF multiplexado con UV-Vis, DPPH • y MS ahora está listo para su análisis. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este estudio consiste en la caracterización y perfiles de café usando HPLC con detección multiplexado empleando una columna paralela flujo segmentado (PSF). Multiplexado HPLC utilizando columnas de PSF permite la caracterización y la identificación de entidades químicas clave mediante la reducción de la complejidad de los datos de la muestra, mientras que la obtención de un mayor grado de información molécula específica dentro de una fracción del tiempo que tarda el uso de procesos convencionales multi-detec...

Columnas Tecnología Flow Activo Tecnología de flujo activo (AFT) columnas de cromatografía fueron desarrollados recientemente para superar la ineficiencia en las separaciones asociados a la heterogeneidad del flujo 1-6 y también para permitir la detección de multiplexado. En esta comunicación detalle que en particular el proceso operativo del paralelo segmentado flujo (PSF) columna con detección de multiplexado. Las ventajas funcionales clave de la columna de la PSF son: (1) el flujo desde la región central radial del lecho de la columna está aislada de la región periférica o la pared del flujo, (2) el volumen de fase móvil que debe ser procesada por una detección fuente se reduce, y las fuentes (3) de detección puede ser multiplexada para expandir información de la muestra sin infundir retrasos de detección a través de cada proceso de detección, o posteriormente que requiere la división de una corriente de flujo post-columna 7,8. La característica clave en el diseño de la columna de fibras discontinuas de poliéster que permite que la unaVentaja de la detección multiplexada es la novela de salida montaje de empalme y frita. La figura 1 es una fotografía de la columna AFT en comparación con una columna convencional. Es importante entender que el proceso de división obtuvo utilizando columnas de flujo segmentado paralelo no es la misma que la división de corriente de flujo post-columna. En una corriente de flujo post-columna dividir toda la banda de muestra desde el borde de ataque a las extremidades de la cola es igualmente incluidos en la muestra (es decir, axialmente), de ese modo, cada corriente de flujo es igual con respecto a la eficiencia y sensibilidad; la magnitud de la sensibilidad de este modo se divide por las divisiones de números. En PSF, sin embargo, las muestras de proceso de división de la banda radialmente, no axialmente. Como tal, las muestras de puertos centrales del vértice del pico - la región más concentrada del pico. Por lo tanto, la sensibilidad es más alta aquí como el pico no se diluye por la región difusa tizón. La muestra se eluye de los puertos periféricos no es tan eficiente como en el Centrazona l, pero, ya que la banda se muestrea radialmente, en lugar de axialmente, la anchura del pico es más estrecha que sería el caso para un proceso de muestreo que divide el pico en la dirección axial, es decir, una fracción de post-columna. Por lo tanto la sensibilidad de un detector dependiente de la concentración no se reduce. En la columna de la PSF, el racor de salida comprende múltiples puertos de salida y en el interior de esta final apropiado se aloja una frita anular. La porción interior de este anulares canales de frita fluya hacia fuera de la columna a través del puerto de salida radial central, mientras que la porción radial exterior de los canales de frita de salida fluya hacia fuera de la columna a través de los puertos de flujo de salida periféricas o región de la pared. Las porciones interior y exterior de la frita de salida están separados por una barrera impermeable que impide el flujo transversal entre estas regiones de flujo 2. Como consecuencia de este diseño, la corriente de flujo radial central a través del lecho de la columna se separa de los ins de flujo región de paredide la columna. La porción relativa de flujo de estas dos regiones puede ser variada para casi cualquier relación deseada mediante la gestión de la presión con el fin de optimizar varios aspectos funcionales de la tecnología de la columna, como la eficiencia de separación o sensibilidad de detección. En esencia, este diseño establece con eficacia dentro de la columna de la mayor formato de una columna &quot;virtual&quot;, que tiene un diámetro interno más estrecho, y por lo tanto las funciones de columna como una columna verdadera pared de menos, la superación de la columna heterogeneidad de cama y los efectos de pared 9,10. Los principales beneficios de columnas PSF son mejoras en la eficiencia de la columna, la minimización del procesamiento disolvente para la fuente (s) de detección y que permite la detección multiplexada. Sin embargo, una ventaja añadida es que desde el tizón y regiones al frente de cualquier banda se eliminan de la elución global perfil del soluto en la elución o detección está presente en una concentración mayor que de lo contrario se observa para los mismos solute inyección y la carga de la concentración en una columna convencional, dependiendo de la relación de segmentación empleada. Como consecuencia de ello, se observa a menudo una ganancia en la intensidad de la señal para separaciones realizadas en columnas PSF 2. De hecho, si la relación de segmentación se ajusta de tal manera que 25% de las salidas de flujo de cada uno de los cuatro puertos de salida, la intensidad de la señal que se observa usando violeta (UV) de detección Ultra muestra prácticamente la misma intensidad de la señal exacta como aparente utilizando una convencional columna donde se analiza la totalidad (100%) de la fase móvil 7. Por otra parte, el ajuste fino de la relación entre la toma de las regiones del centro y de la pared de flujo permite que la eficiencia de la columna que se ha optimizado. Las ganancias en eficiencia de la columna observaron utilizando columnas AFT no se puede afirmar a un solo valor, ya que estos aumentos de la eficiencia son una función de tres factores: (1) la velocidad de flujo, (2) la relación de segmentación, y (3) el factor de retención de soluto . Sin embargo, las ganancias en eficiencia en comparación con convcolumnas entional casi siempre se observaron, y, a veces estas ganancias son más de 100% en el número de platos teóricos 1,2. La capacidad de ajustar la relación de segmentación permite que el analista para adaptar efectivamente el diámetro de la columna &quot;virtual&quot;, y esto es un factor importante en relación con el proceso de detección. Por ejemplo, un 2,1 mm de diámetro (id) la columna virtual interna se establece a partir de una columna ID física 4,6 mm cuando la relación de segmentación es 21% de la fase móvil, eluyendo desde el puerto de salida radial central. En estas condiciones, la columna ID de 2,1 mm virtual realiza con una eficiencia que puede ser más de 70% mayor que la columna ID de 2,1 mm convencional, dependiendo de la tasa de flujo, y el factor de retención de soluto 10. El diseño de la columna PSF actual que se utiliza para la detección multiplexada incorpora un 4-puerto de salida apropiado, pero la columna se puede equipar con un 2-puerto de herraje final también, sin embargo, esto limita la detección to sólo dos detectores. El funcionamiento básico de estas columnas es, sin embargo, la misma, excepto que los cuatro detectores se pueden acoplar simultáneamente a la columna de fibras discontinuas de poliéster de 4 orificio de salida de ampliar el alcance para la detección multiplexada. Aparte de tubo conectivo columna antes y después, los únicos requisitos adicionales para operar una columna de fibras discontinuas de poliéster se tubería que se puede conectar a los puertos de salida periféricos, y un medio por el cual la cantidad de fase móvil pasa a través de cada tubo se puede medir, típicamente una medición de la masa o una medición volumétrica. Para facilitar la afinación, el diámetro interno de todos los tubos de flujo de salida debe ser el mismo. La relación de flujo entre los puertos de salida centrales periféricas y radiales se varía entonces a través de la utilización de gestión de la presión, simplemente cambiando la longitud de la tubería se encuentra en la salida periférica ajustada, o la longitud del detector de post tubo en el puerto radial salida central. Detección multiplexado utilizando columnas PSF </strong&gt; Una ventaja importante de columnas PSF es que cada uno de los puertos de salida de salida se puede conectar directamente a una fuente de detección, permitiendo así la detección multiplexada. En un sistema de detección bien diseñado un solo análisis con detección multiplexada puede proporcionar información sustancial en lo que respecta a la naturaleza de los componentes dentro de la muestra. Es importante destacar que, ensayos destructivos y no destructivos pueden llevarse a cabo exactamente en el mismo momento, sin retardo de detección. Esto permite la asignación absoluta de, por ejemplo, anti-oxidantes utilizando DPPH • reactivo, con componentes observaron para eluir con UV y / o espectrometría de masas (MS) las respuestas de detección de 7,11. Por lo tanto, cuatro detectores independientes pueden ser operados simultáneamente con porciones apropiadas de flujo dirigido a cada detector a través de cualquiera de los cuatro puertos de salida. Puesto que el flujo a través de estos puertos se puede ajustar fácilmente la cantidad de soluto de alcanzar cualquiera de los detectores se pueden ajustar para adaptarsela sensibilidad del detector de fuente dada. Cabe señalar, sin embargo, que la migración de soluto más eficiente se observa a través del puerto de salida radial central. Cada uno de los puertos periféricos ofrecen eficiencia de separación equivalente, que cuando se establece en 25% a través de cada puerto, es sólo ligeramente menos eficiente que una columna convencional. Como tal, es importante que el detector cuantitativo configurarse para analizar la muestra desde el puerto de salida radial central. Cuando la creación de una columna de fibras discontinuas de poliéster con el propósito de detección de multiplexado hay un número de consideraciones que deben hacerse para lograr resultados eficientes y de alta calidad; es decir dimensiones de los tubos para cada puerto, la elección de qué puerto para un tipo de detector y el ajuste de flujo. Tubo Dimensiones para cada puerto En la cromatografía de la longitud del tubo de la columna posterior juega un papel crucial en la eficiencia y el rendimiento de la separación. Gran dead-volumen como resultado de un largo o ancho tubo de salida de la columna ID de detector se traducirá en una pérdida de eficiencia, resolución y sensibilidad. Por lo tanto, las dimensiones de tubos apropiados deben ser utilizados al configurar la columna de la PSF para alcanzar el máximo potencial en el suministro de separación eficiente al tiempo que proporciona los beneficios de multiplexación. Puerto de detector La figura 2 es una ilustración de una configuración de ejemplo de detección de multiplexado (Violet-Visible Ultra (U-Vis), espectrómetro de masas (MS) y 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detección). La ilustración muestra el puerto central está unido al detector MS, mientras que el DPPH • y detectores de UV-Vis se adjuntan a los puertos periféricos. Puesto que la MS es el detector más sensible de los tres, fluir a este detector fue dirigido desde el orificio de salida central. Como DPPH • Detección es selectivo a la presence de antioxidantes, y la menos sensible y más tolerante al ensanchamiento de las bandas, el flujo a este detector fue dirigido desde un puerto periférico. El UV-Vis era un detector secundario &quot;genérico&quot;, por lo que fluya a este detector fue dirigido desde un segundo puerto de periféricos. Ajuste de Flujo Una vez que el tubo apropiado se ha unido desde un puerto de detector, el flujo que sale de cada uno de los detectores se puede ajustar a la cantidad requerida. Una forma sencilla de medir la cantidad de la salida de cada detector de flujo es pesar la cantidad de fase móvil que eluye a través de cada puerto durante un período determinado de tiempo. El flujo de porcentaje de este modo se puede determinar, y las relaciones de flujo se puede ajustar por cualquiera acortando o alargando el tubo conectado a la línea de toma de corriente de los detectores en consecuencia para adaptarse a los requisitos de los detectores de elección. Diferentes detectores tienen diferentes requisitos de flujo, por ejemplo, la celda de flujo deun detector de fluorescencia (FLD) no es la tasa de flujo limitada, pero se debe tener cuidado para evitar la sobre-presurización de la celda de flujo. Por lo tanto el control de flujo a través del FLD generalmente se logra mediante el ajuste de la caída de presión a través de los otros detectores y el resto del flujo entonces pasa a través de la FLD. Un detector que es sensible a la cantidad de flujo que se entrega es la MS. Generalmente, espectrómetros de masas actuales de gama alta pueden procesar fácilmente alrededor de 1 a 1,5 ml / min de fase móvil acuosa moderadamente. Por encima de esta velocidad de flujo, inundación de la fuente puede hacer que los MS inoperable. Sin embargo, la sensibilidad de detección en la mayoría de los espectrómetros de masas se benefició con caudales inferiores; por lo tanto, la capacidad de división de flujo PSF son extremadamente útiles para aplicaciones que implican la detección MS. Caudales volumétricos de alta de la columna se pueden utilizar, pero con cargas de bajo volumen transportado al detector MS. Afinación del flujo al detector MS, sin embargo, se debe hacer mediante el ajuste de la caída de presión antes de laDetector de MS, en lugar de colocar la EM. Aquí, el uso de mangueras de diámetro interior estrecho (0,1 mm id) es muy útil, ya que la presión se puede ajustar fácilmente sin añadir volumen muerto apropiado. Dependiendo del tipo de detector el ajuste de la relación de segmentación puede hacerse detector ya sea pre o post. Si un detector no destructivo, como se usa UV-Vis, el porcentaje de flujo sería medido y ajustado detector de correos. Si un solo detector destructiva se utiliza en el multiplex establecer el porcentaje de flujo se determina por el cálculo de la espalda con respecto a otros porcentajes de flujo de puerto. Si un detector basado reactivo se utiliza como DPPH •, el porcentaje de flujo se mide detector puesto de trabajo sin la adición de reactivo; y si se utilizan dos o más destructivas detectores, entonces la relación de flujo se mide pre-detector. Sistemas que pueden requerir instrumentación adicional, tales DPPH • Detección, tendrá la presión del sistema adicional que puede alterar el flujoporcentaje una vez conectado al sistema de detección. Por lo tanto, la consideración cuidadosa se debe prestar a la presión del sistema de un detector destructiva, al ajustar el porcentaje de flujo pre-detector. Independientemente de la relación de flujo que se establece a través de cualquiera de los puertos, la información cuantitativa se debe obtener mediante la normalización adecuada. Una vez que las relaciones de flujo se establecen, sin embargo, son robustos, y no cambian incluso bajo condiciones de elución de gradiente de 7, El protocolo de vídeo detallado que acompaña este manuscrito tiene la intención de mostrar cómo usar y ajustar un funcionamiento columna de fibras discontinuas de poliéster en un modo multiplexado de detección.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC instrument</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:185px;">Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parallel Segmented Flow HPLC column</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Not Defined</td>
			<td>Soon to be commercialised</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEEK tubing</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Various lengths and i.d.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Column stoppers</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blocking unused peripheral ports.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEEK tube cutter</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analytical Scale Balance</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stop watch</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eluent collection vessels</td>
			<td style="width:167px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Un análisis de HPLC multiplexada se llevó a cabo utilizando una columna de AFT en el modo de PSF (Figura 1) y configurar como se ilustra en la Figura 2. Este tipo de configuración permite una muestra de café que va a analizarse simultáneamente usando UV-Vis, DPPH • y MS en total Contador de Ion modo (TIC). Los compuestos de la muestra de café que respondió a DPPH • podrían entonces ser fácilmente emparejados a los UV-Vis y MS - respues...

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Puesta a punto del paralelo Columna de flujo segmentado y habilitación de detección de multiplexado

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K vistas.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

Video: Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Investigación

Química

Exploring the Radical Nature of a Carbon Surface by Electron Paramagnetic Resonance and a Calibrated Gas Flow

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date back to the early 1980s the focus of these early papers primarily characterized the changes to the structures under extremely harsh conditions (pH or temperature)1-3. It is also known that paramagnetic molecular oxygen undergoes a Heisenberg spin exchange interaction with stable radicals that extremely broadens the EPR signal4-6. Recently, we reported interesting results where this interaction of molecular oxygen with a certain part of the existing stable radical structure can be reversibly affected simply by flowing a diamagnetic gas through the carbon samples at STP7. As flows of He, CO2, and N2 had a similar effect these interactions occur at the surface area of the macropore system.
This manuscript highlights the experimental techniques, work-up, and analysis towards affecting the existing stable radical nature in the carbon structures. It is hoped that it will help towards further development and understanding of these interactions in the community at large.

Stable radicals that are present in carbon substrates interact with paramagnetic oxygen through a Heisenberg spin exchange. This interaction can be significantly reduced under STP conditions by flowing a diamagnetic gas over the carbon system. This manuscript describes a simple method to characterize the nature of those radicals.

Explorando la naturaleza radical de una superficie de carbono por resonancia paramagnética de electrones y un flujo de gas de calibrado

While the first Electron Paramagnetic Resonance (EPR) studies regarding the effects of oxidation on the structure and stability of carbon radicals date ...

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, electronics and biomedical applications. Due to their accelerating production and use, CNTs constitute a potential environmental risk if they are released to soil and groundwater systems. It is therefore essential to improve the current understanding of environmental fate and transport of CNTs. The transport and retention of CNTs in both natural and artificial media have been reported in literature, but the findings widely vary and are thus not conclusive. There are a number of physical and chemical parameters responsible for variation in retention and transport. In this study, a complete procedure of selected multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) is presented starting from their surface modification to a complete set of laboratory column experiments at critical physical and chemical scenarios. Results indicate that the stability of the commercially available MWCNTs are critical with their attached surface functional group which can also influence the transport and retention of MWCNT through the surrounding medium.

Surface properties of a nanoparticle are important for their interaction with the surrounding medium. Therefore the surface modification of carbon nanotubes can be critical for their transport and retention through porous media. Here, lab scale column experiments are used to understand the possible transport and retention of these nanoparticles.

Transporte de nanotubos de carbono modificado en la superficie a través de una columna de suelo

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Las polimerizaciones de etileno utilizando reactores de presión paralelas y un análisis cinético de la cadena de transferencia de polimerización

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Síntesis altamente estereoselectiva de 1,6-cetoésteres Mediada por líquidos iónicos: una reacción de tres componentes Habilitación de acceso rápido a una nueva clase de bajo peso molecular gelificantes

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Columna posterior derivatización usando la reacción en columnas de flujo Cromatografía Líquida de Alta

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Cortina Columna de flujo: optimización de la eficiencia y sensibilidad

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Protocol for Electrochemical Evaluations and State of Charge Diagnostics of a Symmetric Organic Redox Flow Battery

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid and deployment of renewable energy technologies. Among the many flow battery chemistries, non-aqueous flow batteries have the potential to achieve high energy density because of the broad voltage windows of non-aqueous electrolytes. However, significant technical hurdles exist currently limiting non-aqueous flow batteries to demonstrate their full potential, such as low redox concentrations, low operating currents, under-explored battery status monitoring, etc. In an attempt to address these limitations, we recently reported a non-aqueous flow battery based on a highly soluble, redox-active organic nitronyl nitroxide radical compound, 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (PTIO). This redox material exhibits an ambipolar electrochemical property, and therefore can serve as both anolyte and catholyte redox materials to form a symmetric flow battery chemistry. Moreover, we demonstrated that Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy could measure the PTIO concentrations during the PTIO flow battery cycling and offer reasonably accurate detection of the battery state of charge (SOC), as cross-validated by electron spin resonance (ESR) measurements. Herein we present a video protocol for the electrochemical evaluation and SOC diagnosis of the PTIO symmetric flow battery. With a detailed description, we experimentally demonstrated the route to achieve such purposes. This protocol aims to spark more interests and insights on the safety and reliability in the field of non-aqueous redox flow batteries.

We present the protocols for electrochemically evaluating a symmetric non-aqueous organic redox flow battery and for diagnosing its state of charge using FTIR.

Un protocolo para la electroquímicos Las evaluaciones y estado de carga de diagnóstico de una batería redox de flujo simétrico Orgánica

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid ...

A Continuous-flow Photocatalytic Reactor for the Precisely Controlled Deposition of Metallic Nanoparticles

In this work, a novel photocatalytic reactor for the pulsed and controlled excitation of the photocatalyst and the precise deposition of metallic nanoparticles is developed. Guidelines for the replication of the reactor and its operation are provided in detail. Three different composite systems (Pt/graphene, Pt/TiO2, and Au/TiO2) with monodisperse and uniformly distributed particles are produced by this reactor, and the photodeposition mechanism, as well as the synthesis optimization strategy, are discussed. The synthesis methods and their technical aspects are described comprehensively. The role of the ultraviolet (UV) dose (in each excitation pulse) on the photodeposition process is investigated and the optimum values for each composite system are provided.

For a continuous and scalable synthesis of noble-metal-based nanocomposites, a novel photocatalytic reactor is developed and its structure, operation principles, and product quality optimization strategies are described.

Un Reactor fotocatalítico de flujo continuo para la deposición precisamente controlada de nanopartículas metálicas

In this work, a novel photocatalytic reactor for the pulsed and controlled excitation of the photocatalyst and the precise deposition of metallic ...

Tuning the Acidity of Pt/ CNTs Catalysts for Hydrodeoxygenation of Diphenyl Ether

We herein present a method for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs. By varying the weight of various solid acid nanosheets, a series of Pt/xHMNO6/CNTs with different solid acid compositions (x = 5, 20 wt%; M = Nb, Ta; N = Mo, W) have been prepared by carbon nanotube pretreatment, protonic exchange, solid acid exfoliation, aggregation and finally Pt particles impregnation. The Pt/xHMNO6/CNTs are characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and NH3-temperature programmed desorption. The study revealed that HNbWO6 nanosheets were attached on CNTs, with some edges of the nanosheets being bent in shape. The acid strength of the supported Pt catalysts increases in the following order: Pt/CNTs &#60; Pt/5HNbWO6/CNTs &#60; Pt/20HNbMoO6/CNTs &#60; Pt/20HNbWO6/CNTs &#60; Pt/20HTaWO6/CNTs. In addition, the catalytic hydroconversion of lignin-derived model compound: diphenyl ether using the synthesized Pt/20HNbWO6 catalyst has been investigated.

A protocol for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs is presented.

Afinación de la acidez de los catalizadores Pt/ CNTs para la hidrodesoxigenación del éter de difenilo

We herein present a method for the synthesis of HNbWO6, HNbMoO6, HTaWO6 solid acid nanosheet modified Pt/CNTs. By varying the weight of various solid acid ...