Nos gustaría agradecer al Dr. Xiaowen Yang (servicio de clonación Protex) para la preparación de las construcciones de expresión utilizados para este trabajo y de la Universidad de Leicester Core Services Biotecnología. Este trabajo fue apoyado por una beca BBSRC, el Programa de Wellcome Trust y subvenciones investigador principal WT085408 y WT100237 y BBSRC conceden RM31G0224.

NOTA: El protocolo es adecuado para cualquier escala de expresión, por lo tanto, los volúmenes y cantidades de los reactivos deben ser escalados proporcionalmente. Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí se utilizó un vector de expresión pcDNA 3.1 modificado que permite convenientemente la inclusión o exclusión de una etiqueta de afinidad dependiendo de la elección de las enzimas de restricción utilizados en la clonación (Figura 1). El siguiente protocolo describe un transfección a gran escala. 1. Gran Escala Cultura / La transfección en 1 L Botellas de rodillos Crecer y mantener las células en suspensión adaptadas HEK293F de acuerdo con protocolos estándar. Típicamente cultivos iniciadores de entre 30 y 100 ml se cultivan en matraces de 250 ml de cultivo de células cónicas. <ol><li> Se siembran las células a 0,5 x 10 6 células / ml en un volumen final de 300 ml en cada frasco rotatorio 1 L. NOTA: botellas de rodillos acomodar un mínimo de 150 ml a un máximo de300 ml de cultivo en suspensión. Para las transfecciones de mayor escala utilizar varias botellas. </li><li> Incubar durante 24 horas en un incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, y 5% de CO 2 hasta que las células alcanzan una densidad de 1,0 x 10 6 células / ml (células deben dividir aproximadamente cada 24 h). </li><li> Pipetear un total de 300 g de ADN esterilizada por filtración (ver método suplementario) en 30 ml de PBS y agitar vigorosamente durante 3 seg. NOTA: Use un total de 1 g de ADN por cada millón de células transfectadas. Si dos o más plásmidos son para ser co-transfectada reducir la cantidad de cada uno de modo que la relación de ADN a las células permanece constante. </li><li> Añadir 1,2 ml de 0,5 mg / ml esterilizada por filtración PEI a la solución de PBS / ADN y agitar vigorosamente durante 3 seg. </li><li> Incubar la mezcla a TA durante 20 min. </li><li> Añadir el ADN / PEI mezclar a las células - que debe estar a una densidad de 1 x 10 6 células / ml (paso 1.3). </li><li> Después de co-transfección, se incuban las célulasen un incubador agitador orbital durante un 48 horas más a 37 ° C, 120 rpm, y 5% de CO 2. </li><li> Proteínas intracelulares de la cosecha por centrifugación las células a 3000 xg durante 5 min y almacenar el sedimento a -80 ° C. NOTA: También puede utilizar un estándar (no-CO 2) agitación incubadora, si la atmósfera por encima de la cultura se sustituye con 5% de CO 2 y la tapa de la botella está sellada. Tendrá que ser reemplazado en cada paso (normalmente cada 2 días) la atmósfera. </li></ol> 2.-proteína compleja Purificación de extracto de células enteras Este protocolo se ha optimizado para la purificación de complejos de proteínas nucleares utilizando marcado con FLAG. <ol><li> Descongelar sedimento celular en 40 ~ ml de tampón de lisis enfriado previamente (acetato de potasio 100 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% de Triton X-100, inhibidores de la proteasa) por l de cultivo. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado pipeteando arriba y abajo varias veces (para evitar la formación de espuma, no hacer vórtice). </lyo&gt; <li> Completamente volver a suspender las células usando un homogeneizador de vidrio. Sonicar durante 3 ciclos (15 segundos, 15 segundos en off). Se centrifuga a 30.000 xg durante 25 min a 4 ° C y retener sobrenadante. </li><li> Equilibrar 1,25 ml de anti-flag lleno de resina de agarosa por litro de cultivo por lavado tres veces con tampón de equilibrado resina (acetato de potasio 100 mM, Tris 50 mM pH 7,5). </li><li> Incubar el extracto celular de la etapa 2.3 con la resina de afinidad en uno o más tubos de 50 ml de centrífuga y gire suavemente la muestra durante 30-120 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 3000 xg durante 1 min a 4 ° C, el sobrenadante de descarte. </li><li> Lavar la resina con 45 ml de tampón de pre-refrigerada 1 (acetato de potasio 100 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% de Triton X-100). Se centrifuga a 3.000 g durante 1 min y desechar el sobrenadante. </li><li> Repita el paso 2.7 utilizando tampón de alta concentración de sal (acetato de potasio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol al 5%), seguido por tampón de baja salinidad (acetato potásico 50 mM, Tris 50 mM pH 70,5, 5% de glicerol) y TEV división Buffer (50 mM de acetato de potasio, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). NOTA: Asegúrese de cada lavado es breve, es decir, suficiente para resuspender completamente la resina y no más. </li><li> Se recoge una muestra de 10 l de resina y diluir a 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis (control a proteínas). No utilice agentes reductores para evitar la liberación del anticuerpo de la resina. </li><li> Vuelva a suspender la resina en 8-10 ml de tampón enfriado previamente y la transferencia de escisión TEV a un tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Añadir ~ 40 g de la proteasa TEV (de existencias a 1 mg / ml) por litro de cultivo original y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Reemplace atmósfera tubo con 100% gas N2 para evitar la oxidación de proteínas. </li><li> Gire suavemente O / N a 4 ° C. </li><li> Se centrifuga a 3.000 g durante 10 min. Transferir el sobrenadante en un filtro centrífugo de ultra con un peso molecular de corte apropiadas y concentrarhasta 500 l. </li><li> Se recoge una muestra de 10 l de la proteína concentrada y diluir a 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis. (TEV eluir control). </li><li> Recoger una muestra de 10 l de la resina y se diluye en 1 volumen de 2x tampón de carga de proteínas para el análisis. No utilice agentes de reducción con el fin de evitar la liberación de grandes cantidades de anticuerpos a partir de la resina. (Control de resina Post-VET). </li><li> Equilibrar la columna de cromatografía de exclusión de tamaño con tampón de filtración en gel (acetato de potasio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). </li><li> Se filtra la proteína a través de un filtro de 0,22 micras </li><li> Cargar la muestra en la columna y recoger las fracciones. </li><li> Ejecutar muestras de los pasos 2.9, 2.15 y 2.16 y las fracciones de filtración en gel de la etapa 2.19 en una SDS-PAGE y tinción de Coomassie para su análisis. NOTA: Es recomendable ejecutar un SDS-PAGE de muestras de los pasos 2.9, 2.15 y 2.16 antes de la filtración en gel para confirmar la expresión de la proteína diana.</li>
</ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Hemos desarrollado un método sencillo y eficaz de costes (PEI cuesta mucho menos que los reactivos de transfección disponibles comercialmente lipófilos) para expresar y purificar grandes cantidades de proteínas recombinantes y los complejos de múltiples subunidades a partir de células de mamíferos. Transfección óptima y eficacia de la expresión pueden ser alcanzados si el ADN plásmido de alta pureza (260/280 entre 1,8 y 2,0) se utiliza en combinación con PEI como se describe en la sección de protocolo. Las células deben cultivarse en medios sin suero y libres de antibióticos, por lo tanto, una técnica estéril es estrictamente necesario para los pases y transfectar células con el fin de evitar infecciones costosos y que consumen tiempo. La viabilidad celular debe ser de 90% o superior y culturas no deben sembrarse a densidades superiores a 2,5 x 10 6 células / ml inmediatamente antes de una transfección, ya que al hacerlo reducirá la producción de proteína. Para una transfección exitosa, sólo cultivos deben contener células individuales o en división. Los grupos pueden ser disueltas por el vigorvórtex ous de 20 a 30 segundos (Figura 5). La relación de cada plásmido utilizado en la co-transfección se puede variar por el usuario de acuerdo con la estequiometría de la ser complejo estudiado. Eficacia de la expresión puede ser optimizado para la proteína de interés, por lo que un tiempo de expresión adecuado puede ser establecida. La purificación debe realizarse manteniendo el frío muestra de proteína en todo momento para reducir el riesgo de la degradación proteolítica no deseada. La elección de las etiquetas y tampones de purificación es crítica, ya que pueden interferir con los elementos estructurales o de los sitios activos de ciertas proteínas, a menudo resultando en una reducción de la solubilidad y / o la pérdida de la actividad enzimática. Transfecciones a pequeña escala son particularmente útiles para el ensayo de diferentes construcciones para la purificación de complejos de proteínas grandes. Hoy en día, una gran variedad de metodologías alternativas están disponibles para la expresión de proteínas eucarióticas recombinantes (Tabla 2). Por ejemplo, Baculovirus expresión en células de insecto es ampliamente utilizado debido a su alta eficacia de transducción y su falta de citotoxicidad en comparación con otras especies virales 6. Sin embargo, el proceso de hacer el virus es mucho tiempo y su inestabilidad no permite que el virus se puede almacenar durante largos períodos. Por otro lado, los sistemas de expresión de levadura ofrecen la posibilidad de crecer las células a densidades muy altas en cultivos de fermentación, resultando en altos rendimientos de proteína 7. Pero todavía carecen de la variedad completa de modificaciones post-traduccionales requeridas para proteínas eucarióticas para plegar correctamente e interactuar con sus compañeros de la proteína. HDAC3, por ejemplo, se expresa pero no se pliega en E. coli. Sin embargo, cuando se expresa en células 293F, hemos sido capaces de purificar una enzima activa en el complejo con su co-represor (SMRT) y una molécula de inositol tetrafosfato (IP4) 8, que no se encuentra en las células procariotas. Este método también nos ha permitido depurar y resolver el cristal structure de HDAC1 interactuar con MTA1 en el complejo NuRD, que se activa de manera similar por IP4 9. Idealmente, quisiéramos siempre para expresar proteínas eucariotas en su entorno natural, fisiológico. Sistemas de expresión de mamíferos que emplean células HEK 293-EBNA1 en biorreactores 10-12 se han descrito y producir niveles muy altos de proteína, pero estos pueden ser difíciles de usar. Nuestro método es una alternativa sencilla y accesible para los sistemas de expresión en bacterias, levaduras y biorreactor. El método de expresión es rápido y no requiere el uso de equipo costoso, particularmente si la atmósfera botella rodillo o matraz se reemplazó con 5% de CO 2 y se utilizan incubadoras sacuden estándar. Hemos utilizado estos protocolos para co-transfectar múltiples plásmidos y purificar complejos con hasta cinco proteínas con rendimientos de&gt; 1 mg / l de cultivo. Curiosamente, el sistema ayuda a la identificación de los complejos de buen comportamiento estables. Por ejemplo, excompresión del complejo binario de HDAC1 y Sin3A dio rendimientos limitadas de proteínas, sin embargo, además de SDS3 dio lugar a 5 veces mayores cantidades y por lo tanto dirige el biólogo estructural en la elección de construcciones adecuadas y complejos estables para la cristalización.

El rápido progreso de la biología molecular de las células y la necesidad constante de mejorar los medicamentos en la medicina ha creado la necesidad de biólogos estructurales para observar las estructuras de proteínas cada vez más complejos. Estos a menudo puede requerir determinadas modificaciones posteriores a la traducción, chaperones moleculares y co-factores para apoyar su elaborada plegamiento y la actividad enzimática. Mientras que la gran mayoría de las estructuras presentes en el Protein Data Bank han sido obtenidos usando sistemas de expresión bacterianos, los procariotas son incapaces de realizar un gran número de estas modificaciones y carecen de muchos co-factores esenciales eucariotas. Esto puede ser un problema para el estudio de complejos de múltiples subunidades grandes que son activados por pequeñas moléculas de señalización, así como para nuclear, superficie celular y proteínas secretadas que requieren mecanismos de plegado elaborados. Un número de E. cepas de E. coli han sido diseñados para superar algunas de estas limitaciones 1. En los últimos años, sin embargo, el uso de msistemas de expresión ammalian ha ido en aumento, ya que producen confiablemente proteínas eucarióticas que son de otra manera problemática de expresar en otros sistemas 2. Hoy en día es posible obtener líneas celulares de expresión de mamífero estables y transitorios a través de una variedad de técnicas que van desde la transducción viral de la transfección mediada por productos químicos, gen-transferencia física tales como la electroporación y la inyección directa 3. Aunque todos estos métodos tienen su propio conjunto de ventajas y desventajas, sólo unos pocos de ellos son adecuados para estudios estructurales son demasiado caros y / o tiempo. Aquí se describe un método muy simple, rápido, de bajo costo pero altamente eficaz para la expresión de complejos de proteínas para la biología estructural en suspensión crecido células de mamíferos. El enfoque utiliza la co-transfección transitoria de un riñón embrionario humano (HEK) línea celular (por ejemplo, células HEK 293F Freestyle). Estas células se han derivado de la HEK 293 celínea ll, están adaptados para crecer en cultivos en suspensión, alcanzando altas densidades utilizando medios libres de suero (como FreeStyle 293 Expression Media). Después las células se transfectaron transitoriamente utilizando una versión ramificado de polietilenimina (PEI), un reactivo polimérico de bajo costo que se ha informado de funcionar por una amplia gama de células de mamífero 4 mediante la formación de complejos de ADN / PEI que entran en la célula huésped por endocitosis 5. Este método es adecuado tanto a pequeña escala (30 ml) y gran escala (hasta 300 ml) experimentos y puede producir altos niveles de complejos de proteínas purificadas. Es particularmente útil para el estudio de proteínas que requieren mecanismos de plegado complejos, co-factores particulares o modificaciones post-traduccionales que no pueden ser realizadas por bacterias, levaduras y células de insectos. En este protocolo se presenta la expresión y purificación de la central de andamio de tres proteínas de la Sin3A complejo de represión transcripcional. Este consta de histonaDeacetilasa 1 (HDAC1), supresor de silenciamiento defectuosa 3 (SDS3) y Switch-independiente 3 (Sin3A). El complejo purificado se utiliza para los ensayos de cristalización de alto rendimiento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Aquí mostramos un 2 L (culturas 8 x 250 ml) co-transfección transitoria y purificación de la HDAC1, SDS3, Sin3A complejo ternario. HDAC1 y SDS3 interactúan con Sin3A a través del dominio de HDAC-interacción (HID) de Sin3A. Un típico rendimientos de purificación de hasta 1 mg de complejo por litro de cultivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. esquemática del vector pcDNA 3.1 expresión modificada. El plásmido fue digerido con EcoRV y EcoRI para incluir la afinidad-etiqueta y TEV sitio de escisión en el extremo amino terminal de Sin3A. Para clonar versiones sin etiquetar de HDAC1 y SDS3, el vector se digirió con KpnI y EcoRI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. SDS-PAGE muestra la primera etapa de la purificación. El carril &quot;proteína unida&quot; muestra el complejo unido a la resina de afinidad. Después de la digestión TEV, la etiqueta presente en Sin3A-HID se escinde y el complejo se eluye de la resina como se muestra en las segunda y tercera carriles del gel. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Cromatograma de la utilización de cromatografía de exclusión por tamaño purificada-proteína compleja. Tenga en cuenta que el complejo puro se eluyó en el volumen vacío, ya que forma un dímero en solución. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. SDS-PAGE que muestra las fracciones de la filtración en gel se muestra en la Figura 3. Células HEK 293F teñidas de azul Figura 5. Trypan en 2.3x10 6 células / ml listos para ser transfectadas. Células sólo deben estar presentes como células individuales o en división, mientras que los grandes grupos pueden ser divididos por agitación vigorosa durante aproximadamente 25 segundos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Las causas posibles </td><td> Acción </td></tr><tr><td rowspan="4"> Rendimiento baja proteína. </td><td> Bajo número de células transfectadas. </td><td> Hacer una densidad celular seguro es de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes de añadir la mezcla de reacción de transfección a la cultura. </td></tr><tr><td> Las células podrían haber sido subcultivadas demasiadas veces. </td><td> Usar células madre nueva después de aproximadamente 90 paselas edades. </td></tr><tr><td> ADN puede ser degradado o tienen una alta cantidad de impurezas. </td><td> Asegúrese de que el ADN plásmido se está utilizando tiene una relación de 260/280 entre 1,8 y 2,0. Ejecución del ADN en un gel de agarosa es aconsejable para evaluar su calidad. </td></tr><tr><td> Proteína (s) que se expresa no son estables o bastante soluble. </td><td> Pruebe diferentes construcciones en pequeña escala antes de aumento de escala de las transfecciones. Asegúrese de que las etiquetas no interfieren con la estructura de la proteína (s) de interés. </td></tr><tr><td> Las células un aspecto turbio y tienen un color y / o el olor inusual. </td><td> Las células se infectan con bacterias o levadura. </td><td> Una buena técnica estéril debe ser utilizado en todo momento. La fumigación de las campanas de flujo laminar y UV-desinfección de la sala de cultivo celular en caso de infección ayuda a contener el problema. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Las células tienen una baja viabilidad. </td><td> PH incorrecto en los medios de comunicación. </td><td> Asegúrese de que las culturas se hacen crecer a 8.5% de CO 2en todo momento. </td></tr><tr><td> Las células se han cultivado hasta una densidad de más de 3,0x10 6 células / ml. </td><td> Las células no deben cultivarse hasta densidades por encima de 2,5 x 10 6 células / ml inmediatamente antes de una transfección y nunca por encima de 3,0 x 10 6 células / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> La purificación por afinidad no funcionaba </td><td> Proteína (s) no está siendo expresado. </td><td> Véase más arriba. </td></tr><tr><td> Condiciones de purificación pueden estar equivocados. </td><td> Ajuste condiciones de tampón (por ejemplo, alta concentración de sal, bajo en sal, pH.) </td></tr></tbody></table> Tabla 1 Solución de problemas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistema </td><td> Ventajas </td><td> Desventajas </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> Fastsistema de expresión </li><li> Rendimientos altos en proteína </li><li> Barato </li><li> Adecuado para la producción asequible de proteínas marcadas con isótopos </li></ul></td><td><ul><li> La falta de chaperones importantes que pueda ser necesaria para el plegamiento de proteínas </li><li> La falta de muchas modificaciones postraduccionales </li><li> Pueden carecer de co-factores que son importantes para la función de las proteínas y / o montaje complejo. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Se puede realizar la mayoría de translacional modificaciones posteriores </li><li> Barato </li></ul></td><td><ul><li> Falta algunas modificaciones después de la traducción </li><li> Pueden carecer de co-factores que son importantes para la función de las proteínas y / o montaje complejo. </li></ul></td></tr><tr><td> De expresión de baculovirus en células de insecto </td><td><ul><li> Puede realizar todas las modificaciones post traduccionales &lt;/ Li&gt; <li> Baculovirus es menos citotóxico que otras cepas virales </li></ul></td><td><ul><li> Preparación del virus para la transducción es mucho tiempo </li><li> El virus no es estable y no se puede almacenar durante largos períodos de tiempo </li><li> Las células de insecto pueden carecer de co-factores que son importantes para la función de la proteína y / o ensamblaje complejo. </li></ul></td></tr><tr><td> Biorreactores con sistemas de mamíferos </td><td><ul><li> Puede realizar todas las modificaciones post traduccionales </li><li> Puede proporcionar todos los co-factores necesarios para la función de las proteínas y complejo montaje </li><li> Can células de cultivo en densidades muy altas </li><li> Puede expresarse todas las proteínas de mamíferos que requieren maquinarias plegables complejas </li><li> Rendimientos muy altos de proteína </li></ul></td><td><ul><li> Requiere personal especializado utilizar el biorreactor. </li><li> Se requiere un equipo costoso. </li><li> Optimización de expresión de condicións puede llevar mucho tiempo. </li></ul></td></tr><tr><td> Células en suspensión HEK 293F </td><td><ul><li> Puede realizar todas las modificaciones post traduccionales </li><li> Puede proporcionar todos los co-factores necesarios para la función de las proteínas y complejo montaje </li><li> Puede expresarse todas las proteínas de mamíferos que requieren maquinaria de plegado complejo </li><li> Protocolo de transfección rápido e intuitivo </li><li> Relativamente barato en comparación con biorreactores y / u otros reactivos de transfección disponibles comercialmente. </li></ul></td><td><ul><li> Aunque asequible, no tan barato como la expresión en bacterias </li></ul></td></tr></tbody></table> Cuadro 2 Ventajas y desventajas de los sistemas de expresión principal.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Research

JoVE Journal

Biology

53.3K vistas.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Video: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...