El protocolo ha sido desarrollado para la producción de variantes de huntingin de longitud completa a una escala de miligramos bajos. Permite una proteína consistente de alta calidad esencial para los investigadores de la EH. Demostrando el procedimiento estará Michael Harris, un científico investigador del Laboratorio de la Curia.
Comience agregando un gramo de polietileneimina 25 K a un litro de agua libre de endotoxinas y revuelva bien. Ajuste el pH a 2.0 usando ácido clorhídrico 100 milimolar y revuelva hasta que toda la polietilenimina se disuelva. Luego ajuste el pH a 7.0 usando una solución de hidróxido de sodio de 100 milimolares y pase la solución a través de un filtro de 0.2 micrómetros.
Haga alícuotas de la solución filtrada y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Propague células HEK293 en el medio de crecimiento suplementado con estreptomicina penicilina en una incubadora agitadora humidificada a 37 grados centígrados, 90 RPM, 5% de dióxido de carbono durante 18 a 24 horas. Un día antes de la transfección, diluir las células a una densidad de aproximadamente 1,2 x 10 a la sexta células de potencia por mililitro en dos litros de medio de crecimiento en un erlenmeyer de cinco litros e incubar durante 18 a 24 horas.
Al final de la incubación, mida la densidad y viabilidad de la celda utilizando un contador automático de células siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de calcular la cantidad de polietilenoimina y plásmido requerida para la transfección, diluya la polietileneimina y el plásmido individualmente en 100 mililitros de PBS e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, mezcle el plásmido diluido y la polietileneimina girando suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Agregue la mezcla al cultivo celular y mezcle girando suavemente. Ahora, permita que las células crezcan durante 24 horas. Al día siguiente, agregue la solución de butirato de sodio a una concentración final de agente antiaglutinante y antiespumante de dos milimolares en una proporción de volumen de 1: 1, 000 al cultivo e incube las células en la incubadora del agitador humidificado durante 48 horas.
Después de medir la viabilidad y densidad celular, recolecte las células por centrifugación a 2, 000 G durante 30 minutos y almacene el pellet de celda a menos 80 grados centígrados antes de la purificación. Para la purificación anti-FLAG usando FPLC, empaque de 12 a 25 mililitros de resina anti-FLAG en una columna vacía a una velocidad de flujo de cuatro mililitros por minuto usando el tampón A y ajuste la altura del émbolo para eliminar el espacio entre el extremo del émbolo y el lecho de resina. A continuación, suspenda el gránulo de celda descongelado en tampón de lisis en frío y pase la suspensión celular una vez a través de un homogeneizador de alto cizallamiento a una presión de 1, 000 libras por pulgada cuadrada.
Usando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo compatible, aclare el lisado a 20, 000 G durante una hora. Programe FPLC en la ventana Método, cargue el lisado clarificado a través de la bomba de muestra y lave la columna con los volúmenes de columna deseados de tampón A, B, C, D y tampón de elución como se describe en el manuscrito de texto. Una vez finalizada la carrera, analice 10 microlitros de las fracciones pico utilizando SDS-PAGE.
Combine las fracciones máximas con la pureza deseada y ahorre aproximadamente 50 microlitros de los eluidos combinados para un análisis SDS-PAGE adicional. Comience a equilibrar la columna SEC usando el FPLC y cargue el eluido anti-FLAG a través de un superloop de 50 mililitros. Después de ejecutar el búfer SEC, permita que la separación SEC ocurra durante la noche a cuatro grados centígrados.
Compare el perfil de elución con el perfil de elución HTT estándar para distinguir los picos de monómero, dímero y oligomérico de orden superior. Agrupe las fracciones monoméricas de HTT en función del perfil de elución de la columna SEC y, si lo desea, agrupe las fracciones HTT oligoméricas y diméricas de orden superior por separado. Concentrar la proteína HTT combinada utilizando un concentrador centrífugo de 100 kilodalton a cuatro grados centígrados.
Después de calcular la concentración de proteína, alícuota menos de 100 microlitros de la proteína HTT purificada en un tubo de microcentrífuga crioseguro. Congele rápidamente las alícuotas con nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Realice todos los análisis SEC-MALS a cuatro grados centígrados en el sistema HPLC, junto con un detector UV, un detector de dispersión de luz multiángulo, un detector de índice de refracción diferencial y use 0.185 como incremento del índice de refracción para HTT.
Purgue la bomba y los detectores con agua filtrada de grado HPLC y conecte la columna UHPLC al sistema. Equilibre la columna con agua filtrada y luego amortigue SEC-MALS hasta que todas las señales del detector alcancen la línea de base. Inyecte dos microlitros de solución de BSA a un caudal de 0,3 mililitros por minuto durante 15 minutos por inyección.
Inspeccione la calidad de los datos, realice la normalización, la alineación de picos y la corrección de ampliación de banda en función del perfil BSA y cree una plantilla para las siguientes ejecuciones de muestra de HTT. Descongele rápidamente un vial de la muestra FL Q23-HTT en un baño de agua a temperatura ambiente utilizando un flotador. Filtre el HTT a través de un filtro de centrifugado de 0,1 micrómetros.
Inyecte de dos a cuatro microlitros de la muestra HTT y funcione durante 15 minutos a cuatro grados centígrados a un caudal de 0,3 mililitros por minuto. Analice los datos cromatográficos y de dispersión de luz utilizando el software que lo acompaña y genere un diagrama Zimm para determinar la masa molecular promediada en peso para cada pico. En el presente estudio, utilizando un proceso de columna de dos pasos, se obtuvo más del 95% de pureza para HTT y el principal contaminante fue la chaperona Hsp70, que se eliminó mediante un lavado extensivo con cloruro de magnesio y ATP durante el paso de purificación de afinidad anti-FLAG. La sobreexpresión de FL HTT puede resultar en la fragmentación de la proteína, pero FL Q23-HTT producida por el método resuelto como una sola banda con el peso molecular correcto de 350 kilodaltons indica que no fragmentación.
El análisis de Western blot después de la reacción de anticuerpos con FL Q23-HTT demostró que la proteína se aisló sin truncamientos detectables significativos, ya que no se observaron bandas adicionales relacionadas con fragmentos. La varianza de longitud de FL HTT poly-Q, Q23, Q48 y Q73 reaccionaron como se esperaba en Western blot, mostrando una señal progresivamente más fuerte para el anticuerpo monoclonal dirigido a poli-Q MW1, correlacionándose con el aumento de la longitud Q. Entre las columnas de HPLC probadas, la columna SEC mostró una resolución suficiente entre el monómero HTT y el dímero, de modo que se pudieran distinguir masas molares.
El FL HTT purificado de SEC mostró múltiples bandas correspondientes a los estados de oligomerización, lo que podría deberse a la presencia de varios parches hidrófobos que contribuyen a la formación de oligómeros de orden superior durante la migración dentro del gel. El HTT purificado mostró tres bandas principales en PAGE nativa azul con un peso molecular estimado de 643, 927 y 1.070 kilodaltons que probablemente representan las especies monoméricas, diméricas y triméricas de HTT, respectivamente. El manejo adecuado de la huntingtina purificada es esencial para evitar la generación de oligómeros de alto orden en agregados solubles.
Es imperativo que el usuario final trabaje rápidamente para dispensar la muestra en tubos preenfriados antes de la congelación rápida. Las pruebas de estabilidad a largo plazo se pueden realizar en muestras almacenadas en períodos prolongados a menos 80 grados centígrados. Los análisis HPLC SEC-MALS confirmarán si ha habido algún cambio en el contenido monomérico de la muestra.
