Name: a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice at JoVE.com

The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Syst&#232;me Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.

El siguiente procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales para el Uso de Animales Experimentales y de la Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visual de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). 1. Preparación de la microaguja para anterior intracameral Inyección <ol><li> Con un extractor, generar una microaguja a partir de un capilar de vidrio de borosilicato </li><li> Bajo el microscopio, utilizar una hoja afilada cuidadosamente para crear una abertura en la punta de la microaguja. La apertura resultante debe tener una forma elíptica con un diámetro mayor y eje menor de aproximadamente 190 micras y 70 micras, respectivamente. Medir el área de la abertura de microagujas preparado por primeras imágenes que adquieren con una regla colocada bajo el microscopio seguido por la cuantificación usando software de análisis de imágenes. </li><li> En el sistema de biselado micropipeta, coloque la microaguja en un 20 degree ángulo respecto a la placa de biselado de manera que la abertura de microagujas está en contacto con la placa. Bevel durante aproximadamente 10 min hasta que los bordes son plana y lisa. Añadir unas cuantas gotas de agua destilada para ayudar en el proceso. </li><li> Girar la microaguja para biselar los dos bordes que rodean la abertura hasta que la punta está afilada. </li><li> Limpiar toda la suciedad y el agua de la abertura de la punta de microagujas usando un plumero de aerosol. </li><li> Examine cuidadosamente la microaguja acabada con un microscopio. microagujas de descarte con fracturas para reducir al mínimo el riesgo de que se rompa durante la cirugía de microagujas. </li><li> Esterilizar la microaguja enjuagando primero con etanol, luego con solución salina equilibrada estéril (BSS). </li></ol> 2. Preparación de la solución Microbead Magnética Nota: Las microperlas magnéticas utilizadas en este estudio se recubren con grupos epoxi. Para evitar los efectos adversos, tales como la aglutinación de las perlas y las interacciones moleculares deseados, estos grupos epoxi debeprimero ser retirado de las microperlas antes de proceder con la cirugía de la inyección. <ol><li> La eliminación de los grupos epoxi de perlas magnéticas <ol><li> Preparar una solución de hidróxido de sodio 0,02 M (NaOH, MW 39.997 g / mol) en 10x tampón Tris (MW 121.14 g / mol). </li><li> Vórtice suavemente el stock de solución microbead magnética (4,5 m de diámetro, 4 x 10 8 perlas / ml) hasta que las perlas se suspendieron de manera uniforme en la solución. </li><li> pipetear rápidamente 1 ml de solución de perlas magnéticas en 50 ml de NaOH 0,02 M en tampón 10x Tris. </li><li> Rotar durante 24 horas a RT para eliminar los grupos epoxi de las perlas. </li><li> Recoger las perlas asegurando un imán a la parte inferior del tubo. Oriente el tubo horizontalmente para asegurar que todos los granos son atraídos por el imán. Gire durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento de perlas. </li><li> vórtice suavemente el sedimento en 50 ml de 10x Tris tampón hasta que las cuentas están bien suspendidos. </li><li> Repita los pasos 2.1.4 a 2.1.6. </li></ol></li><li> La concentración y la resuspensión de las microperlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril </li></ol> Nota: Es necesario concentrar el stock de solución de perlas magnéticas en solución salina equilibrada estéril (BSS) para alcanzar una concentración final de 1,6 x 10 6 perlas / l de modo que 2,4 x 10 6 perlas pueden ser inyectados en la cámara anterior en una volumen final de 1,5 l, que es apropiado para el ojo pequeño ratón. <ol><li> Lavar las perlas en 5 ml de agua ultra pura de grado de laboratorio mediante agitación suave durante 2 min. </li><li> Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el agua sin alterar el sedimento de perlas. </li><li> Repita los pasos 2.2.1 a 2.2.3 tres veces más. </li><li> En una campana de flujo laminar, lavar las perlas con 500 l de NBS por pipetting arriba y hacia abajo. Realice los pasos restantes de esta sección en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. </li><li> Recoger las perlas por atraer a la parte inferior del tubo con un imán. </li><li> Con una micropipeta, retirar con cuidado el BSS sin perturbar el sedimento de perlas. </li><li> Repita los pasos 2.2.5 a 2.2.7 tres veces más. </li><li> Volver a suspender pipeteando las cuentas arriba y hacia abajo en 250 l de BSS. </li><li> Asegúrese de que la solución de bolas está bien homogeneizada. Entonces, rápidamente alícuota de 25 l de la suspensión en recipientes estériles de tubos de 0,5 ml. La concentración final de la solución madre de perlas es de 1,6 x 10 6 perlas / l. </li><li> Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 3. La inducción de la hipertensión ocular Nota: La sección 3 es una operación de dos personas. En el caso de que una acción específica debe ser realizada por una persona específica, se identifica a la persona adecuada. En general, la Persona 1 maneja el ratón bajo el microscopio, mientras que la Persona 2 es responsable para manipular la bomba microjeringa. La duración total del procedimiento quirúrgico debe ser inferior a 10 min (pasos 3.9 a 3.17). <ol><li> Realizar procedimientos en ratones C57BL / 6 adultos. Los ratones domésticos en un entorno estándar con acceso a comida y agua ad libitum. En este papel, utilice la hembra C57BL / 6 ratones de entre 3 y 4,5 meses de edad. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a los machos y ratones de diferentes edades, así como otras cepas de ratón, incluyendo ratones transgénicos y knockout. </li><li> Medir la PIO basal en ratones despiertos antes de la inyección de anestesia y microbead utilizando un tonómetro de rebote calibrado. Aplicar una gota de clorhidrato de proparacaína en la córnea. <ol><li> frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la piel entre las orejas. Coloque el ratón en la mesa de trabajo de modo que el animal está cómodo y los ojos son accesibles. Mantenga el tonómetro perpendicular a la superficie de la córnea y tomar al menos tres series de diez lecturas consecutivas por cada ojo para obtener unala media de la PIO. Se prefiere la medición de la PIO en ratones despiertos para eludir los efectos relacionados con la anestesia en la PIO. Alternativamente, se puede medir IOP en ratones anestesiada después de la etapa 3.4. </li></ol></li><li> Preparar una mezcla de anestesia cóctel stock ratón compuesta de 20 mg / ml de ketamina, 2 mg / ml de xilazina y 0,4 mg / ml de acepromazina. </li><li> Inducir la anestesia en el ratón mediante la administración intraperitoneal de la mezcla de cóctel (1 l / g de peso corporal). El uso de un cóctel anestésico inyectable se prefiere sobre los anestésicos de gas (por ejemplo, isoflurano), ya que permite flexibilidad al manipular la cabeza de ratón como el animal no está conectado a una máscara de inhalación. Además, el periodo de recuperación más largo requerido con un anestésico inyectable se asegura de que las microperlas se depositan en el ángulo iridocorneal sin desplazar de nuevo en la cámara anterior. </li><li> Administrar 0,05 mg por kg de peso corporal por vía subcutánea de buprenorfina. </li><li> Tratar el ojo con una ey tropicamidae soltar para inducir dilatación de la pupila. Debido al tamaño pequeño de la cámara anterior murino, el alumno debe ser dilatado para visualizar fácilmente el posicionamiento y el avance de la microaguja durante la inyección. </li><li> Aplicar la pomada tópica en el ojo contralateral (no operada) para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento. </li><li> Adjuntar una microaguja limpia para el conjunto de inyección de la bomba microjeringa. Vuelva a colocar la microaguja después de cada operación para evitar la contaminación cruzada de los animales. </li><li> Persona 1: Transferir el ratón anestesiado a la plataforma operativa. Bajo el microscopio, asegúrese de que la pupila está completamente dilatado y que los músculos oculares están relajados de modo que no hay movimiento del ojo. La ausencia de movimientos oculares asegura la estabilidad durante la inyección. limpie con cuidado el colirio de tropicamida del ojo utilizando hisopos absorbentes. </li><li> Persona 2: Mezclar la solución microbead magnética pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> El uso de la bomba microjeringa, cargar inmediatamente el microneedle (preparado en el apartado 1) con 1,5 l de la solución homogeneizada microbead magnética (2,4 x 10 6 bolas). Asegurarse de que las burbujas de aire están ausentes en la punta de la microaguja. Una vez cargado el microagujas, realice los pasos 3.12 a 3.13 lo más rápido posible para que la solución microbead magnética permanece en una suspensión homogénea. </li><li> Coloque la microaguja cargado en un ángulo de 45 °, colocado en sentido anterior con relación al limbo. Persona 1: apoyar el ojo con unas pinzas de plástico. Asegúrese de que el ángulo entre la microaguja y las pinzas de plástico es de aproximadamente 90 °. </li><li> Persona 2: Con la microaguja cargado, perfore suavemente la córnea de modo que la punta de la microaguja penetra en la cámara anterior. Asegúrese de que la microaguja cargado se mantiene en un ángulo de 45 ° con relación al limbo durante la punción. Evitar cualquier contacto con la lente o el iris. Asegúrese de que la microaguja no entra en la cámara posterior. Persona 1: continúan apoyando el ojoutilizando pinzas de plástico. </li><li> Persona 1: Sin mover la cabeza de ratón, coloque el imán al lado del ojo, frente a la punta de microagujas, para atraer a las perlas magnéticas en la cámara anterior y minimizar el contacto de las perlas con la superficie interior de la córnea. Persona 2: El uso de la bomba Inyectar 1,5 l de la solución de perlas magnéticas en la cámara anterior. La solución de microperlas se inyecta durante un periodo de 15 a 30 seg. Persona 1: Continúe sujetando el imán opuesto a la punta de microagujas durante toda la duración de la inyección. </li><li> Persona 2: Una vez que se ha inyectado el volumen total de cuentas, retirar lentamente la microaguja del ojo. Persona 1: Para evitar el reflujo de las microperlas, siguen atrayendo a las perlas magnéticas hacia la cámara anterior manteniendo el imán al lado del ojo de un adicional de 30 a 60 seg. </li><li> Persona 1: Usando el imán, atrae a las cuentas del ángulo iridocorneal. Asegúrese de que los granos forman un anillo uniformemente distribuidaalrededor de la circunferencia de la cámara anterior. Durante este paso, evitar atraer perlas a la córnea, ya que tienen una tendencia a pegarse a la superficie interior de la córnea tras el contacto. </li><li> Se trata el ojo operado con un colirio antibiótico para minimizar el riesgo de infección. </li><li> Deje que el ratón para recuperarse de una almohadilla de calor hasta que esté completamente despierto (~ 3 a 4 horas). Coloque el ratón de modo que el ojo operado esté orientado hacia arriba. Este posicionamiento evitará la acumulación de las perlas inyectados a la superficie interior de la córnea por fuerza de gravedad. Además, esta posición disminuirá el potencial de infección como el ojo operado no estará en contacto con la ropa de cama y / o de otros materiales que pueden estar presentes en la jaula. En el caso de que un animal muestra ningún signo de sufrimiento, administrar dosis adicionales de buprenorfina, según sea necesario. </li><li> Permitir a los ratones para recuperarse del procedimiento durante al menos 2 días antes de tomar mediciones de la PIO. Medir la PIO como se describe en 3.2. monitor IOP al menos una vez a la semana o con mayor frecuencia, según sea necesario, y, al mismo momento del día para minimizar las fluctuaciones relacionadas con circadianos. </li><li> Para mediciones de la PIO, utilizar el ojo contralateral desde el ratón operado como un control interno. Como alternativa, se emplean mediciones de controles intactos, que no son operados o ratones con operación simulada como ingenuos. </li></ol> 4. Evaluación de la célula retiniana de Soma y Axon Supervivencia <ol><li> Perfundir ratones sometidos a la hipertensión ocular por inyección intracardiaca de la solución de 0,1 M de tampón de fosfato (PBS), seguido inmediatamente por el frío de hielo 4% de paraformaldehído (PFA). </li><li> Perfundir ratones intactos, no operados como se describe en 4.1 y utilizarlos como controles no lesionados. No se recomienda el uso de los ojos contralaterales de ratones operados para evaluar la supervivencia de CGR, porque los cambios en los ojos contralaterales después de la lesión se ha informado de 15,16 y pueden confundir la interpretación de los datos. Por otra parte, el uso de los ojos con operación simulada inyectados con 1.5 L de BSS como controles. </li><li> El uso de micro tijeras, corte con cuidado el tejido conectivo alrededor del ojo para aislarlo de la cuenca del ojo. Separar el nervio óptico del ojo mediante la reducción en el nivel de la cabeza del nervio óptico. </li><li> Usando una aguja G 30, hacer un agujero en la córnea para permitir la penetración de la solución de fijación en el ojo. Coloque el ojo en 4% PFA y se incuba durante 1 hora a 4 ° C para la fijación adicional. </li><li> Coloque el nervio óptico en una solución que contiene 2% PFA y 2,5% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,1 M (MW: 214 g / mol) y se incuba O / N a 4 ° C para la fijación adicional. </li></ol> 5. Las retinas La cuantificación de las CGR Soma densidad sobre el Flat-montados Nota: El siguiente procedimiento es una adaptación de un protocolo por el Nadal-Nicolas et al 17 y describe la cuantificación de la CGR utilizando un anticuerpo contra el homeobox / POU dominio de la proteína 3A-específica del cerebro (Brn3a) en montajes planos de la retina.. met alternativaSAO para CGR etiquetado también se puede utilizar incluyendo inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la proteína de unión al ARN con empalme múltiple (RBPMS) o el etiquetado retrógrada con Fluorogold o DiI. <ol><li> Bajo un microscopio de disección, retirar la parte anterior del ojo mediante una incisión a lo largo de todo el limbo hasta la córnea se separa fácilmente. Retire la córnea y el cristalino. separar cuidadosamente la retina del ojo, mediante cortes a lo largo de la ora serrata y el nervio óptico. </li><li> Preparar un montaje plana de la retina al hacer cuatro pequeñas incisiones equidistantes de la periferia de la retina hacia el nervio óptico para delimitar claramente los cuatro cuadrantes de la retina. El uso de un cepillo pequeño, retire con cuidado vítreo restante de la retina. La extirpación de tanto humor vítreo como sea posible es crucial para obtener una señal de inmunohistoquímica limpia y fuerte. </li><li> transferir cuidadosamente la retina a una placa de cultivo de fondo de 48 pocillos plana que contiene 0,5% de Triton X-100 en PBS de manera que la retina esde libre flotación. Asegúrese de que la capa de células ganglionares está orientado hacia arriba. </li><li> Coloque la placa de cultivo a -70 ° C durante 15 min. Después de descongelar las retinas, más permeabilizar por lavado dos veces en fresco 2% de Triton X-100 en PBS. </li><li> Diluir el anticuerpo Brn3a a 0,3 a 0,5 g / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y 2% de suero normal de burro. Incubar la retina en la solución de anticuerpo primario Brn3a agitando suavemente O / N a 4 ° C. Las retinas deben estar completamente inmersos en 150 a 200 l de solución en todo momento. </li><li> Diluir el anti-anticuerpo secundario de cabra IgG de burro a 2 mg / ml con PBS que contenía 2% de Triton X-100 y se incuba la retina en esta solución durante 2 horas a RT con agitación suave. La retina debe estar completamente sumergido en la solución de anticuerpo en todo momento. Cubrir la placa de cultivo con papel de aluminio para el resto de pasos para evitar photobleaching. </li><li> Usando un cepillo, transferir cuidadosamente la retina a un portaobjetos de modo que el tejido se encuentra tan plano como possible. Deje secar al aire durante 10 minutos. Montar utilizando medio de montaje anti-fade. </li><li> Examinar los montajes planos de la retina bajo un microscopio de fluorescencia. Cuantificar el número de CGR Brn3a positivos en tres áreas que no se solapan por cuadrante retiniano como se describe. 18 </li></ol> 6. Cuantificación de las CGR axones en el nervio óptico Secciones representativas <ol><li> Recoger el nervio óptico desde el paso 4.5 y se incuban en un 2% tetróxido de osmio (OsO4, MW 254.23 g / mol) durante 2 horas. Precaución: Debido a su alta toxicidad, tetróxido de osmio debe ser manejado en una campana extractora con traje de laboratorio adecuada. </li><li> Deshidratar el nervio óptico sumergiéndolo en concentraciones de etanol creciente (50%, 70%, 90%, 95% y 100%) durante 15 minutos cada uno. </li><li> Mezclar la resina epoxi usando la siguiente receta: 15.72 ml Insertar-812, 6,45 ml dodecenilo anhídrido succínico, 7,83 ml de anhídrido nádico de metilo, 0,45 ml DMP-30. </li><li> Secuencialmente incubar el nervio óptico en soluciones compuestasde las siguientes proporciones de resina epoxi a óxido de propileno (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25, y 1: 0. Se incuba el nervio óptico en cada solución a TA durante una O / N período. </li><li> Incubar nervios ópticos embebidos en resina 100% epoxi (último paso de 6,4) a 60 ° C durante una 48 h adicionales. </li><li> Generar secciones transversales del nervio óptico semi-delgadas (0,75 m) utilizando un microtomo. </li><li> Teñir secciones transversales del nervio óptico con 1% de azul de toluidina. </li><li> Cuantificar los axones de CGR en cinco áreas no superpuestas de cada sección del nervio óptico como se ha descrito 19. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

La técnica de video presentado aquí proporciona instrucciones detalladas paso a paso sobre cómo realizar la inyección intracameral de microperlas magnéticas para inducir de manera eficaz y reproducible aumento de la PIO en ratones. Este procedimiento resulta en aumento de la PIO sostenida que no requiere inyecciones adicionales y promueve detectable soma RGC y la pérdida de axones dentro de las primeras 3 semanas de la hipertensión ocular induction.Elevated PIO es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma en los seres humanos. Por lo tanto, este es un valioso modelo de glaucoma hipertensión dependiente ocular murino que tiene el potencial para una amplia gama de aplicaciones. Un inconveniente común asociado con la inyección de microperlas en la cámara anterior se refiere a talón de reflujo a través del sitio de la inyección cuando se retira la aguja, que a menudo resulta en solamente una obstrucción parcial del flujo de salida acuoso y aumento de la variabilidad. Para abordar esta cuestión, se llevaron a cabo varias modificaciones importantes. abetos<html> t, la cuidadosa preparación de una, de microagujas de vidrio limpio y afilado con un bisel facetado es esencial para la inyección con éxito de las microperlas. Una microaguja adecuadamente preparado permite la penetración controlada y suave de la córnea con una mínima aplicación de presión a la superficie ocular delicada. La pequeña punción corneal evita el reflujo de microperlas. Además, la multa de microagujas reduce el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y el cristalino, lo que podría dar lugar a la inflamación no relacionados con la enfermedad. En segundo lugar, la aplicación de un imán de mano a las zonas oculares estratégicos durante y después de la inyección es otro aspecto crítico de esta técnica. Durante la inyección, el imán se utiliza para dibujar las microperlas magnéticas para la cámara de prevención de reflujo anterior de las microperlas cuando se retira la microaguja. Después de la inyección, el imán se utiliza para dirigir las microperlas al ángulo iridocorneal de bloquear la salida del humor acuoso. tienda &quot;&gt; Otro problema frecuente en los modelos de oclusión de microesferas es que las inyecciones repetidas de talón a menudo son necesarias para lograr un desarrollo sostenido elevación de la PIO 10,11. Esto podría ser el resultado de microperlas desalojando a partir del ángulo iridocorneal con el tiempo. La combinación de un imán de mano, como se describió anteriormente, y el posicionamiento del ratón después de la operación mejora en gran medida el resultado. el uso de los anestésicos inyectables, que permiten flexibilidad para mover la cabeza durante el procedimiento y requiere un periodo de recuperación más largo después de la operación, se ve favorecida. la colocación de la ratón con el ojo operado hacia arriba durante un par de horas después de la cirugía contribuye a la solución de microperlas en el ángulo iridocorneal y disminuye el riesgo de desalojar de nuevo en la cámara anterior. Asegurarse de que el número de cuentas inyectadas es relativamente consistente es un paso fundamental para minimizar las variaciones entre animales. Dado que las microperlas se depositan en el bottom del tubo, es necesario para homogeneizar completamente la solución de microperlas y retirar el volumen apropiado en la microaguja en una manera oportuna. La inyección de un menor número de granos en la cámara anterior podría resultar en la obstrucción incompleta de las estructuras de drenaje acuosas humor, que es probable que resulte en pobres o variable elevación de la PIO. Es de destacar que, aunque el fin último de la inyección microbead es elevar la PIO, se debe tener cuidado cuando las mediciones de la PIO de los ratones despiertos son más altos que los valores máximos reportados en este estudio (~ 25 mm Hg). Extremadamente altas IOP aumentan el riesgo de daño isquémico y también pueden causar dolor al animal. La elevación de la PIO debe ser considerada como uno de los muchos factores para evaluar el éxito de la cirugía. Como tal, el resultado del procedimiento debe ser calibrada en función de varios parámetros, incluyendo la elevación de la PIO, RGC muerte soma, y ​​la pérdida de axón. Aunque el protocolo descrito aquí resulta en la mayoría de las microperlas de éxitoLy sedimentación en el ángulo, una limitación potencial de este modelo es que los granos que permanecen flotando en la cámara anterior podrían interferir con la imagen de la retina en vivo a través de la córnea, así como ensayos electrofisiológicos y de comportamiento que requieren el paso eficaz de la luz. Otro aspecto importante a considerar cuando se utiliza este modelo de oclusión microbead es que el grado de elevación de la PIO y la posterior degeneración de RGC varía con la edad y los antecedentes genéticos del ratón operado [4]. Por lo tanto, tendrá que ser determinado para cada línea específica de ratón transgénico y / o rango de edad el grado de elevación de la PIO y la línea de tiempo de la degeneración de las CGR. Una característica de este modelo es que los resultados de la PIO elevada en la pérdida gradual de la muerte de CGR durante las primeras tres semanas después de la inyección microbead y significativa la muerte de CGR se detecta a las 3 semanas después del procedimiento. Por lo tanto, este modelo permite el examen de los cambios tempranos y / o sutiles que se producen en este dNFERMEDAD, antes de la RGC abierta soma y la pérdida axonal. Un aumento significativo en la muerte de CGR no se observó entre 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. De hecho, RGC soma y axón pérdida se mantuvo estable en ~ 22 - 25% entre 3 y 6 semanas a pesar del éxito y sostenido aumento de la PIO en estos puntos de tiempo. Una mayor duración de la PIO sostenida puede ser necesario para la pérdida adicional RGC a ocurrir en ratones C57BL / 6, que parecen ser más resistentes a los daños RGC en comparación con otras cepas de ratón. 5 modificaciones adicionales al protocolo que se presenta aquí, incluyendo el ajuste de tamaño de las perlas y las inyecciones adicionales, podrían ser necesarias para estudiar la pérdida de RGC en puntos de tiempo posteriores. Por lo tanto, nuestro protocolo es ideal para estudios se centraron en los cambios fisiopatológicos primeros que se correlacionan con la neurodegeneración modesta RGC que son relevantes para inicio y la progresión temprana en el glaucoma humano.

El glaucoma es una enfermedad progresiva e irreversible cegadora que afectará a un estimado de 80 millones de personas en todo el mundo para el año 2020 1. En los pacientes con glaucoma, pérdida de la visión es causada por la muerte selectiva de las células ganglionares de la retina (CGR), las neuronas de salida que transmiten la información visual del retina al cerebro. El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa asociada a la edad con muchos factores de riesgo de los cuales el más común es la presión intraocular (PIO) elevada. De hecho, la PIO es el único factor de riesgo modificable en el glaucoma y los tratamientos actuales se centran exclusivamente en la gestión de la presión ocular. Sin embargo, múltiples factores genéticos, celulares y ambientales afectan a la aparición y progresión de esta enfermedad. Por lo tanto, la comprensión de los diversos mecanismos que contribuyen en última instancia, a la muerte neuronal es esencial para desarrollar tratamientos efectivos para el glaucoma. Los modelos animales de glaucoma son esenciales para estudiar la fisiopatología de la enfermedad y para identificar y pruebaterapias prometedoras. La creciente disponibilidad de líneas de ratones transgénicos que incluyen cepas de ratones knock-out condicionales y que llevan los marcadores fluorescentes codificadas genéticamente ha impulsado la necesidad de modelos murinos con glaucoma inducibles. Varios modelos de roedores de glaucoma se han desarrollado durante los años (revisado en 2,3). En muchos de estos modelos, el glaucoma se induce mediante la interrupción de la dinámica del humor acuoso, lo que resulta en la elevación de la PIO. Modelos de oclusión, en el que se inyectan microperlas u otras sustancias en la cámara anterior del ojo para bloquear el drenaje acuoso, han ganado popularidad en los últimos años, en parte debido a su relativa facilidad para aumentar la IOP 4-14. El modelo de microperlas oclusión de glaucoma, llevado a cabo primero en primates 12, conejos y ratas 8, 4,9,11, fue adaptado recientemente para su uso en ratones 5,6,10. En estos estudios, la inyección intracameral de microperlas de poliestireno, solo o encombinación con un material viscoelástico, dio lugar a elevación de la PIO que conduce a la posterior muerte de CGR 6,10. Sin embargo, el reflujo cuando la aguja se retira del ojo y se salga de microperlas a partir del ángulo iridocorneal son problemas comunes que surgen durante el procedimiento. Para reducir al mínimo estos inconvenientes, los imanes se han utilizado para atraer las microperlas magnéticas para el ángulo iridocorneal del ojo 4,9. El protocolo se describe aquí es un procedimiento modificado basado en estudios previos 9,10 que utilizan microperlas magnéticas y un imán de mano adaptado para el ojo de ratón (Figura 1). Varias modificaciones importantes se han introducido en el protocolo para asegurar aumento de la PIO eficaz y reproducible en ratones. En primer lugar, la inyección de microperlas se hace usando una microaguja de vidrio cuidadosamente preparada con un bisel facetado. Las superficies lisas resultantes de la microaguja, así como su punta afilada se asegura de que un daño mínimo esinfligido ya que perfora la córnea. El uso de este microaguja de vidrio también se traduce en un mayor control cuando la punta de microagujas entra en la cámara anterior, reduciendo así el riesgo de las estructuras cercanas perjudiciales tales como el iris y la lente. Además, la pequeña lesión inyección facilita la auto-reparación de la córnea y reduce los efectos no deseados relacionados con la lesión. En segundo lugar, la inyección de microperlas magnéticas y el uso de un imán de mano permiten un control preciso para atraer a las perlas para el ángulo iridocorneal en el ojo pequeño ratón. microperlas magnéticas que son 4,5 m de diámetro se utilizaron porque este tamaño de microperlas no obstruye la abertura de microagujas preparado y lo más importante, una vez inyectado, estas microperlas bloquearon eficazmente el drenaje del humor acuoso. Este enfoque no sólo reduce el reflujo de las microperlas inyectados, pero también asegura que un número máximo de microperlas se acumula en el área de destino para bloquear efectivamente el drenaje del humor acuoso. Furthermore, esta estrategia también reduce el número de cuentas que flotan en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras, tales como el iris y la lente, y el paso de la prevención a la cámara posterior. En conjunto, estas modificaciones aseguran que la cirugía de inyección de microperlas se lleva a cabo con relativa facilidad y de una manera oportuna que resulta en una inducción altamente reproducible, eficaz y sostenida de la hipertensión ocular en ratones.

<table><tbody><tr><td>Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Zeiss</td><td>MZ9.5</td><td>Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.</td></tr><tr><td>Footswitch</td><td>Linemaster</td><td>T-91-SE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Blade</td><td>Feather</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Science Products</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Duster</td><td>Fisher</td><td>23-022-523</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450 Epoxy</td><td>Life Technologies</td><td>14011</td><td>Magnetic beads are 4.5 &amp;micro;m in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; beads/ml. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotators</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr><tr><td>3 Handheld Magnets</td><td>Geomag</td><td></td><td>0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.</td></tr><tr><td>25 ml serological pipet</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Biological Containment Hood</td><td>Biostad</td><td>377355</td><td></td></tr><tr><td>Balanced salt solution (BSS)</td><td>Alcon</td><td>0065-0800-25</td><td></td></tr><tr><td>P1,000 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1.5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>P200 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR tube</td><td>Sarstedt</td><td>72737.002</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>Controlled substance</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Ohaus</td><td>CS 200</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>Controlled substance</td></tr><tr><td>Tropicamide ophthalmic solution</td><td>Alcon</td><td>0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl</td></tr><tr><td>Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Manual Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Platform</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-52</td><td>8 x 8 inch</td></tr><tr><td>Absorbent swabs</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>P20 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Plastic forcep</td><td>Euroband</td><td>1001</td><td>Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye</td></tr><tr><td>Fluoroquinolone ophthalmic solution</td><td>Alcon</td><td></td><td>Vigamox</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-834</td><td></td></tr><tr><td>Tonometer</td><td>iCare</td><td>TV02</td><td>TONOLAB rebound tonometer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, Para</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate, tryhydrate</td><td>Canemco and Marivec</td><td>124-65-2</td><td></td></tr><tr><td>Brn-3a antibody (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-31984</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate, 48 well</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Slow fade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 2% aqueous solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>3294949</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl succinic anhydride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Nadic methyl anhydride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold-Dykstra</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Porter-Blum ultra-microtome</td><td>Sorvall</td><td>MT-2</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue O (Certified Biological Stain)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>T161-25</td><td></td></tr></tbody></table>

a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice

El uso de modelos de roedores de glaucoma ha sido esencial para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la fisiopatología de esta enfermedad neurodegenerativa multifactorial. Con la llegada de numerosas líneas de ratones transgénicos, hay un creciente interés en modelos murinos inducible de la hipertensión ocular. A continuación, presentamos un modelo de oclusión de glaucoma basado en la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ojo usando una microaguja modificado con un bisel facetado. Las microperlas magnéticas son atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán de mano para bloquear el drenaje de humor acuoso de la cámara anterior. Esta alteración en la dinámica de resultados acuosas en una elevación constante de la presión intraocular, que posteriormente conduce a la pérdida de células ganglionares de la retina, como se observa en los pacientes con glaucoma humanos. El modelo microbead oclusión se presenta en este manuscrito es simple en comparación con otros modelos inducibles de glaucoma y también altamenteeficaz y reproducible. Es importante destacar que las modificaciones que se presentan aquí a minimizar los problemas comunes que surgen a menudo en los modelos de oclusión. En primer lugar, el uso de una microaguja de vidrio biselado evita el reflujo de microperlas y asegura que se produce el mínimo daño a la córnea durante la inyección, reduciendo así los efectos relacionados con la lesión. En segundo lugar, el uso de microperlas magnéticas asegura la capacidad de atraer la mayoría de perlas al ángulo iridocorneal, reduciendo efectivamente el número de perlas flotantes en la cámara anterior evitando el contacto con otras estructuras (por ejemplo., Iris, cristalino). Por último, el uso de un imán de mano permite flexibilidad al manipular el ojo pequeño ratón para dirigir eficientemente las microperlas magnéticas y asegurarse de que hay poco de reflujo de las microperlas de los ojos cuando se retira la microaguja. En resumen, la oclusión modelo de ratón de microperlas que aquí se presenta es una herramienta de investigación de gran alcance para estudiar los cambios neurodegenerativos que se producen durante el inicio y la progresión de glaucoma.

La inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior de ratones adultos descritos en este protocolo dio como resultado una elevación robusto y reproducible de la PIO. Una semana después del procedimiento, la PIO aumentó de 10 ± 0,6 mmHg (media ± SEM), la PIO promedio de referencia en los ojos contralaterales, a 19 ± 0,5 mmHg en los ojos hipertensos (prueba t de Student; *** p &lt;0,001, n = 12, Tabla 1, Figura 2). IOP estabilizado a partir de entonces y se mantuvo elevado en un promedio de 20 mm Hg durante al menos 6 semanas, el más largo de tiempo de punto examinado en este estudio. La PIO media de pico en los ojos de microesferas con inyección a los 2, 3, y 6 semanas después de la cirugía fue de 25 mm Hg. La gran mayoría de los ratones tratados desarrollaron una PIO elevada sostenida, por lo tanto, este protocolo no requiere una segunda inyección de microperlas. Para evaluar el curso de tiempo de la pérdida de RGC en este modelo, RGC soma eranprimera cuantificado por inmunotinción con Brn3a, un marcador de RGC-17 específica. El número de células positivas Brn3a se cuantificó en las retinas montadas en plano a 1, 2, 3 y 6 semanas después de la inducción de la hipertensión ocular. Aunque se detectó una elevación significativa de la PIO tan temprano como 1 semana después de la inyección de microperlas, no se observó pérdida significativa de RGC soma dentro de las primeras 2 semanas del procedimiento (Figura 3). La muerte de CGR sustancial (22%), sin embargo, fue evidente a las 3 semanas (2.430 ± 67 CGR / mm 2, media ± SEM, n = 12) y 6 semanas (2.350 ± 74 CGR / mm 2, n = 10) post- la inducción de la hipertensión ocular, en comparación con el control de los ojos intactos procedentes de ratones no operado (3.141 ± 49 CGR / mm 2, n = 23) (ANOVA, p &lt;0,001). Disfunción y degeneración de los axones de CGR es una característica cardinal del glaucoma. Por lo tanto, la pérdida axonal se examinó a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas porla cuantificación de los axones de CGR en nervio óptico secciones transversales teñidas con azul de toluidina (Figura 4). Se observó una pérdida sustancial de los axones de CGR (25%) a las 3 semanas (28,401 ± 702 axones / nervio, media ± SEM, n = 5) y 6 semanas (29,426 ± 948 axones / nervio, n = 6) después de la inyección de microperlas en comparación con los nervios ópticos de los ojos intactos no operado (39,467 ± 137 / axones del nervio, n = 4) (ANOVA, p &lt;0,001). En conjunto, estos datos demuestran que la inyección de microperlas magnéticas en la cámara anterior del ratón conduce a reproducible y elevación de la PIO que resulta en RGC soma y la degeneración axonal sostenida. <table><tbody><tr><td colspan="2"> Tiempo después de la cirugía OHT </td><td> norte </td><td colspan="3"> La media de la PIO (mmHg) ± SEM </td><td colspan="2"> Pico de la PIO (mmHg) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> contralateral </td><td> Glaucoma </td><td> diferenc </td><td> contralateral </td><td> Glaucoma </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 semana </td><td> 12 </td><td> 10 ± 0,4 </td><td> 19 ± 0,5 </td><td> 9 ± 0,6 </td><td> 12 ± 0,4 </td><td> 22 ± 0,6 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 semanas </td><td> 13 </td><td> 11 ± 0,5 </td><td> 20 ± 0,8 </td><td> 9 ± 0,5 </td><td> 12 ± 0,9 </td><td> 25 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 semanas </td><td> 10 </td><td> 11 ± 0,8 </td><td> 20 ± 0,7 </td><td> 10 ± 0,9 </td><td> 13 ± 0,2 </td><td> 25 ± 0,9 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 semanas </td><td> 12 </td><td> 12 ± 0,5 </td><td> 20 ± 0,6 </td><td> 9 ± 0,7 </td><td> 13 ± 0,5 </td><td> 24 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La elevación de la presión intraocular en el murino magnética Microbead Occlusien el modelo. En mujeres despierto / 6 ratones C57 BL, la PIO se midió utilizando un tonómetro de rebote calibrado. ojos operados muestran un aumento de la PIO se detecta en una semana después de la cirugía que se mantuvo elevado durante al menos seis semanas después del procedimiento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo de los pasos involucrados en el murino magnética Microbead Oclusión modelo de glaucoma. Esquema paso a paso de todos los procedimientos llevados a cabo antes, durante y después de la cirugía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" /> Figura 2. Aumento de la presión intraocular en el modelo murino magnética Microbead oclusión. En despiertohembra C57 BL / 6 ratones, la PIO se midió usando un tonómetro de rebote calibrado. Las OIA de ojos inyectados microesferas fueron significativamente elevados en una semana después de la cirugía (ANOVA, p &lt;0,001). Las OIA se mantuvieron significativamente elevados en relación con el ojo contralateral de los ratones inyectados durante al menos 6 semanas (ANOVA, p &lt;0,001). (Intacto: n = 12; 1 semana: n = 12, 2 semanas: n = 13, 3 semanas: n = 10, 6 semanas: n = 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" /> Figura 3. retiniana de la muerte celular en los murinos magnéticos Microbead oclusión del modelo. CGR se visualizaron mediante inmunotinción de retinas montadas planas usando Brn3a en las retinas intactas de control (A) y las retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección para inducir microbeadhipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 20 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas como resultado la pérdida significativa soma RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de CGR, en el soma C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 23; 1 semana: n = 6, 2 semanas: n = 6, 3 semanas: n = 12, 6 semanas: n = 10, ANOVA, *** p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" /> Figura 4. axonal degeneración en los murinos axones Magnetic Microbead Oclusión Model. RGC se visualizaron por tinción de nervio óptico secciones transversales con azul de toluidina ende control intacto (A) y retinas glaucomatosos a los 3 y 6 semanas después de la inyección de microperlas para inducir la hipertensión ocular (OHT) (B, C). Barras de escala: 10 m. (D) Análisis cuantitativo confirmó que la inyección de microperlas resultó en una pérdida significativa de axones RGC a los 3 y 6 semanas después del procedimiento en comparación con el control de los ojos. La densidad de los axones de CGR en C57 no glaucomatosa ratones intactos, / BL6 se muestra como referencia (barras blancas, 100% de supervivencia). Los valores se expresan como la media ± SEM (Intacto: n = 4; 3 semanas: n = 5, 6 semanas: n = 6, ANOVA, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a>

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A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

A Magnetic Microbead Oclusión Modelo para inducir hipertensión ocular dependiente de glaucoma en ratones

Aquí, se presenta un protocolo para inducir hipertensión ocular en el ojo murino que resulta en la pérdida de células ganglionares de la retina tal como se observa en el glaucoma. microperlas magnéticas se inyectan en la cámara anterior y atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán para bloquear el flujo de salida del humor acuoso.

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.3K vistas.  CRCHUM and University of Montreal.  Aquí, se presenta un protocolo para inducir hipertensión ocular en el ojo murino que resulta en la pérdida de células ganglionares de la retina tal como se observa en el glaucoma. microperlas magnéticas se inyectan en la cámara anterior y atraídos por el ángulo iridocorneal usando un imán para bloquear el flujo de salida del humor acuoso. 

Video: A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Investigación

Medicina

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

Un modelo de hipertensión ocular inducida por aceite de silicio reversible en ratones

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Neurociencias

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Biología

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.