El glaucoma es la principal causa de ceguera irreversible, caracterizada por la muerte de células ganglionares de la retina y la opto-neurodegeneración. La elevación de la presión intraocular, también llamada hipertensión ocular, es el factor de riesgo más reconocido para el glaucoma. Un modelo de hipertensión ocular simple pero eficaz en animales experimentales como ratones es importante para investigar los glaucómetros en neurodegeneración y probar el tratamiento para la neuroprotección.
Así, con resultados, desarrollamos un modelo de hipertensión ocular de ratón que imita de cerca el glaucoma secundario observado en pacientes humanos. Este modelo replica fielmente el glaucoma secundario causado por el aceite de silicona inducido para el bloqueo pupilar. El procedimiento es simple la elevación de la PIO es estable, y si la neurodegeneración asociada con la hipertensión ocular es grave en los ojos del ratón, lo más importante, la hipertensión ocular es reversible porque el aceite de silicona se puede quitar fácilmente de los ojos del ratón.
Fang Fang, un tipo postoperatorio de mi laboratorio. Para empezar, haga una micropipeta de vidrio para la inyección de aceite de silicona intracameral tirando de un capilar de vidrio con un tirador de pipeta. Corte una abertura en la punta de la micropipeta y afile la punta con una máquina de biselado micro-grinder para hacer un bisel de 35 a 40 grados.
Pulir los bordes del bisel y lavarlo con agua para eliminar todos los residuos. Autoclave la micropipeta antes de su uso. Para preparar la aguja de paracentesis para la entrada corneal, coloque una aguja de calibre 32 en una jeringa de cinco mililitros en un bloqueo de señuelo y asegúrela aún más con cinta adhesiva.
Doblar la punta del bisel de la aguja, boca arriba, a 30 grados. Para preparar el inyector de aceite de silicona, acople y asegure una aguja de calibre 18 de extremo romo en una jeringa de 10 mililitros. A continuación, coloque un tubo de plástico con la aguja del calibre 18 en un extremo y llénúselo con aceite de silicona según sea necesario a través del otro extremo.
Después de anestesiar un ratón C57 negro 6J de nueve a 10 semanas, compruebe la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo con la falta de movimiento de los bigotes o la cola. Coloque el ratón en una posición lateral sobre una plataforma quirúrgica. Aplicar una gota de 5%clorhidrato de proparacaína a la córnea antes de la inyección para reducir su sensibilidad durante el procedimiento.
Utilice la aguja de paracentesis de calibre 32 para hacer una incisión de entrada en el cuadrante super temporal a unos 5 milímetros del limbo. Túnel a través de las capas de la córnea durante unos 3 milímetros antes de perforar en la cámara anterior, teniendo cuidado de no tocar la lente o el iris. Retire la aguja lentamente para liberar alrededor de uno a dos microlitros de humor acuoso de la cámara anterior a través del túnel y espere unos ocho minutos para disminuir aún más la presión intraocular.
Mida el ojo de control contralateral para determinar la presión. Inserte la micropipeta de vidrio precargada con aceite de silicona a través del túnel corneal en la cámara anterior con el bisel hacia abajo en la superficie del iris. Empuje lentamente el émbolo de la jeringa para inyectar aceite de silicona en la cámara anterior hasta que la gota de aceite cubra la mayor parte de la superficie del iris, de aproximadamente 2,3 a 2,4 milímetros de diámetro.
Deje la micropipeta en la cámara anterior durante 10 segundos adicionales antes de retirarla lentamente. Empuje suavemente el párpado superior para cerrar la incisión de la córnea para minimizar la fuga de aceite de silicona. Y luego aplicar ung mento antibiótico en la superficie del ojo.
Mantenga el ratón en la almohadilla calefactora hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Para eliminar el aceite de silicona de la cámara anterior, anestesiar el ratón y luego comprobar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie para determinar la fuerza anestésica y la falta de movimiento de los bigotes o la cola. Coloque el ratón sobre una plataforma de cirugía y fíjelo en la posición lateral con cinta adhesiva.
Aplicar una gota de 5%clorhidrato de proparacaína a la córnea para reducir su sensibilidad. Usando la aguja de paracentesis de calibre 32 pre-hecha, haga dos incisiones en el cuadrante temporal de la córnea entre aproximadamente dos y cinco en el borde de la gota de aceite de silicona. Inserte una aguja de riego de calibre 33 conectada a la solución de riego a través de una incisión corneal a la máxima velocidad.
Inserte otra aguja de drenaje de calibre 33 unida a la jeringa sin un émbolo a través de la otra incisión corneal para permitir que la gota de aceite de silicona salga de la cámara anterior mientras se riega con solución de riego. Retire la aguja de drenaje y luego la aguja de riego. Utilice una micropipeta de vidrio conectada a una jeringa de Hamilton para inyectar una burbuja de aire en la cámara anterior para mantener su profundidad normal y presione para cerrar la incisión corneal.
Aplique un pomada antibiótica en ambos ojos y mantenga el ratón en la almohadilla de recuperación de calefacción hasta que se recupere completamente de la anestesia. Coloque el ratón en una cámara de inducción. Anesthetizar como se describe en el manuscrito y mantener su córnea húmeda mediante la aplicación de lágrimas artificiales durante todo el procedimiento.
Espere unos 15 minutos para permitir que la pupila se dilate por completo. Mida el IOP de ambos ojos utilizando un tonómetro de acuerdo con las instrucciones del producto. Lleve el tonómetro cerca del ojo del ratón, manteniendo la distancia desde la punta de la sonda hasta la córnea del ratón en unos tres a cuatro milímetros.
Pulse el botón de medición seis veces para generar una lectura y obtener tres lecturas generadas por la máquina de cada ojo para adquirir el IOP medio. Realizar inmunohistoquímica de células ganglias de retina de montaje integral contando secciones semifinas del nervio óptico y cuantificación de axones sobrevivientes en los animales sacrificados a las ocho semanas después de la inyección de aceite de silicona. La presión intraocular de los ojos del ratón con gotas de aceite de silicona de más de 1,6 milímetros se midió una vez a la semana durante ocho semanas, después de una sola inyección de aceite de silicona.
La presión del ojo que recibía el aceite se mantuvo alta, principalmente el doble de la presión del ojo de control contralateral que indica un bloqueo eficaz de la pupila. En otro grupo de ratones, el aceite de silicona se expulsó de la cámara anterior dos semanas después de la inyección. Después de esperar una semana para permitir que la córnea se recupere, la presión intraocular volvió a la normalidad, lo mismo que el ojo de control.
Para determinar los efectos de la hipotensión ocular inducida por aceite de silicona en las células ganglionares de la retina, los somatas sobrevivientes en las regiones periféricas de los soportes enteros de la retina se cuantificaron mediante tinción RBPMS que muestra la muerte dramática de las células ganglionares de la retina después de la inyección de aceite de silicona. Los axones sobrevivientes en las secciones transversales semidelgadas del nervio óptico se cuantificaron mediante tinción de PBD ocho semanas después de la inyección. Hubo una gran degeneración del axón en la hipertensión ocular inducida por aceite de silicona.
Los animales pueden ser imágenes con SLOOCT para determinar el cambio en la retina. La función visual de los animales también puede ser ensayada por el patrón ERG y OKR. Este modelo de hipertensión ocular facilitará la investigación de la neurodegeneración de los glaucómetros inducidos por la PIO alta.
También se puede utilizar para probar terapias neuroprotectoras prometedoras preclímicamente.
