Nos gustaría reconocer el apoyo del Programa de Gobierno de Victoria Operacional Apoyo a la Infraestructura, el proyectos de vinculación Esquema Consejo de Investigación Australiano (con Agilent Technologies), el Centro de Investigación Cooperativa del Consejo de Investigación Médica, el banco de cerebros de estilo victoriano, Nacional de Salud y de Australia para la Salud Mental y el Neuroproteomics instalaciones.

1. Preparación de tampones y muestras <ol><li> Preparar 500 ml de tampón, 200 mM de nitrato de amonio de pH 7.6 a 7.8 (pH ajustado con hidróxido de amonio (NH 4 OH)) con cesio (Cs) y antinomia (Sb) a una concentración final de 10 ppb. Utilice cesio y antinomia como patrones internos para controlar cualquier desviación en la respuesta de ICP-MS. tampón de filtro antes de su uso a través de un filtro de 0,22 micras. </li><li> Preparar la muestra en función del tipo de muestra: líquido, tejido o cultivo celular. <ol><li> Para las muestras que requieren la homogeneización (por ejemplo, tejido o células), asegurarse de que no contienen detergente. Utilizar tampones Tris para la preparación de la muestra. Como alternativa, utilizar tampones de fosfato pero pueden afectar negativamente a la metalloproteome con el tiempo o con los ciclos de congelación y descongelación 12. </li><li> Homogeneizar de tejido o cultivo de células de las muestras por Dounce manual o sonicación durante 5 min usando Tris solución salina tamponada (50 mM Tris pH 8,0, cloruro de sodio 150 mM(NaCl) + ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) inhibidores de la proteasa libres). </li><li> Aclarar homogeneizados por centrifugación a 16.000 xg durante 5 min. Recoger el sobrenadante resultante. Mantener las muestras a 4 ° C. Nota: Todas las muestras deben ser centrifugadas antes de cargar en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) viales para evitar que las partículas de bloquear la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). </li></ol></li><li> Normalizar la cantidad total de proteína cargada en la columna a través de las muestras. Determinar las concentraciones de proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV micro volumen 13. De carga entre 20 y 150 g de proteína. Utilice volúmenes de inyección típicos que van desde 2 hasta 80 l dependiendo de la concentración de la muestra. <ol><li> Limpiar el brazo de muestra del espectrofotómetro UV micro volumen con agua destilada antes de la carga de la muestra. El brazo de muestra es donde se cargan las muestras de proteínas. </li><li> En blanco el instrumento frente a 2 l de THtampón de muestra e. Entonces, la carga 2 l de cada muestra en el brazo y medir la absorbancia a 280 nm. </li><li> Determinar las concentraciones. Para las muestras de proteína cruda, utilizar un coeficiente de extinción de 1 Abs = 1 mg / ml. Para determinar la concentración de proteína en las muestras, utilizar la ley de Beer-Lambert, A = ε xlxc, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, l es la longitud de la trayectoria en centímetros y c es la concentración. </li></ol></li></ol> 2. Análisis de las Normas granel metalloprotein El uso de plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas <ol><li> Calentamiento y afinar el instrumento utilizando los protocolos del fabricante. </li><li> Una vez instrumento se calienta y afinado, realice mayor ICP-MS. Nota: Las soluciones madre de metaloproteínas purificados generalmente necesitan ser diluidas antes de la medición. La concentración de metal de la norma puede estimarse a partir de la proteína conocida: stochiometries de metal y la concentración de proteína estimadación. Esta información se puede utilizar para determinar la dilución que será apropiado para caer dentro del rango de la curva estándar generada. <ol><li> Diluir normas metaloproteínas, tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y vitamina B 12, para asegurar que caen dentro del rango de 0 - 500 g / L, usando ácido nítrico 1%. Para alcanzar los estándares dentro de este rango, no utilice diluciones superiores a 1 en 20. Realizar diluciones seriadas en agua para diluir las existencias antes de esto, si es necesario. </li><li> Configurar el orden de las inyecciones. En primer lugar, analizar los siete niveles de calibración, concentraciones que van desde 0 hasta 500 g / L, seguidos por los estándares de metaloproteínas. Los siete niveles de calibración son 0, 1, 5, 10, 50, 100 y 500 g / L. </li><li> Seleccionar elementos de interés. A continuación, utilice Fe, Cu, Zn, Co y yo, ya que son los elementos que los patrones de proteínas están obligados a. Seleccionar los elementos en el método de adquisición mediante la apertura de la pestaña selector de elementos y agregando el eleme<html> NTS y ​​sus respectivas masas de isótopos que se van a analizar. </li><li> Realizar análisis de la muestra con el instrumento y el software del instrumento crea automáticamente las curvas de calibración para cada uno de los elementos que se analiza. Las curvas de calibración son creados por el software mediante el trazado de la cuentas / s del metal detectado en contra de la cantidad de metal que la norma está destinado a contener, en mg / l. Usar las curvas de calibración para determinar la concentración de metal en las muestras desconocidas. Nota: El uso de la curva de calibración, el software determina la concentración de metal en cada una de las normas de metaloproteínas. </li><li> De los resultados del análisis a granel, generar normas metaloproteínas que incluyen los tres elementos traza más abundantes en los tejidos de mamíferos usando una mezcla de Cu, Zn superóxido dismutasa (SOD) se diluyó a 200 mg / L de cobre y zinc y ferritina (FTN) en una final concentración de 2,000 mg / L de hierro. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Configuración del sistema HPLC de exclusión por tamaños y cromatografía en columna de equilibrado Nota: Esta sección debe realizarse de forma paralela a la anterior, ya que ambos requieren cerca de 1 - 1,5 horas para completar. <ol><li> Bombas de purga HPLC con tampón realizada en el paso 1.1 y purgar las bombas para 5 min a una velocidad de flujo de 5 ml / min. </li><li> Una vez que el sistema se purga, establecer la velocidad de flujo de 0,1 ml / min y conectar la columna de exclusión de tamaño (4,6 x 300 mm, 3 m, 150 Å). Nota: Una conexión húmedo entre el tubo y la columna evita las burbujas de aire están atrapadas durante la conexión de la columna. </li><li> Conectar el extremo opuesto de la columna para el detector UV fijado para medir la absorbancia a 280 nm usando un tubo de PEEK. </li><li> Gradualmente aumentar la velocidad de flujo de la columna en incrementos de 0,05 a 0,1 ml / min hasta una velocidad de flujo final de 0,4 ml / min se alcanza. Mientras esto ocurre, compruebe las conexiones de la tubería a la columna que no haya fugas. Monitorear la presióndel sistema para asegurar que no supere los requisitos de columna mediante la observación de la traza de la presión en el cromatograma en el software. </li><li> Deja la columna equilibrar a la velocidad de flujo requerida de más de 5 - 10 volúmenes de columna. Después de que se equilibra, conectar los instrumentos que permiten el análisis de la muestra que se produzca. </li><li> Configurar el método de HPLC hasta la bomba tampón A sobre la columna a 0,4 ml / min durante 15 min. </li></ol> 4. Configuración y ejecución de exclusión por tamaños - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Nota: Los procedimientos operativos pueden variar entre los instrumentos y modelos. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para aprender más acerca de cómo configurar el ICP-MS está utilizando. <ol><li> Coloque el ICP - MS en modo de espera antes de cambiar la configuración de hardware. <ol><li> Una vez en el modo de espera, apagar la comunicación para el muestreador automático y cambiar la introducción de la muestra al &quot;otro&quot;. Nota: Dependiendo del software y duroArtículos de configuración seleccionando &quot;HPLC&quot; como fuente de introducción de muestras se puede utilizar. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para saber si esta opción está disponible. </li></ol></li><li> Utilice PEEK tubo (ID 0,13 mm) para conectar el flujo de salida desde el detector de UV directamente al nebulizador en la ICP-MS. </li><li> El poder una copia de seguridad del ICP - MS y deje que el instrumento se caliente durante 10 - 20 min. </li><li> Después de que el plasma ha encendido, conecte el cable alejado de la ICP - MS de la parte posterior del inyector automático HPLC. Para ello, una vez que el plasma se ha encendido; de lo contrario el sistema de HPLC se apagará automáticamente desde el ICP - MS no está encendida. </li><li> Cambiar el método ICP-MS para recopilar datos para LC-ICP-MS. <ol><li> Alterar el método de adquisición de espectro para la adquisición de tiempo de resolución (TRA). </li><li> Seleccionar los elementos a analizar, Fe, Cu, Zn, Co, I, así como cualesquiera otros elementos de interés, y establecer tiempos de integración (típicamente entre 0,05 a 0,3 seg). Después de que los elementos de interés de unare elegido, ajustar el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo de ejecución para la cromatografía (por ejemplo, 900 segundos para una carrera de cromatografía 15 min). </li><li> Sintonización manual de la ICP - MS para el helio sensibilidad y la colisión de células (He) las tasas de flujo de gas con el tampón de cromatografía que fluye usando Cs y Sb incluyen en la memoria intermedia. Las velocidades de flujo Él son típicamente ~ 1 ml / min menos que los utilizados para el análisis a granel. Una vez que los recuentos de iones metálicos se han estabilizado y valores de la desviación estándar relativa (RSD) están por debajo de 5%, el sistema está listo para usar. </li></ol></li><li> Hacer listas de conductos de muestra tanto en la HPLC y los programas de software de ICP-MS. La lista de ejemplos de ejecución contiene el orden en que cada una de las muestras se ha de inyectar, así como el nombre con el que se guardarán los datos. Compruebe que el número total de muestras en el partido de la lista entre los dos programas. </li><li> Iniciar el lote de muestra de la ICP-MS antes de la HPLC, como la inyección de la muestra por el HPLC dará lugar a la ICP - MS para comenzar a recogerdatos. Si esto no se hace en el orden correcto que dará lugar a los datos que faltan. </li><li> Generar puntos de la curva de calibración mediante la inyección de volúmenes variables de la SOD y estándar mezclado FTN de 200 mg / l a 6.000 g / L inyecta en la columna para Cu y Zn y 2.000 mg / l hasta 60.000 mg / l para el Fe. Los volúmenes de inyección oscilan de 1 a 30 l. Nota: Estos intervalos de concentración abarcan las concentraciones de Fe, Cu y Zn típicamente observados en homogeneizados de complejos. Para muestras que contienen sólo proteínas purificadas el rango máximo de la curva debe ajustarse en consecuencia. A medida que la cantidad de metal asociado con la proteína puede requerir un rango más pequeño o más grande ya que hay menos contaminación en la muestra de otros factores. </li><li> Analizar cada uno de los cultivos de tejidos muestras desconocidas, plasma o célula. </li></ol> 5. Análisis de datos, manipulación y visualización <ol><li> Almacenar los datos en el valor separados por comas (CSV) formato de archivo y cargar into programas de procesamiento según sea necesario. </li><li> Con el fin de controlar la deriva del instrumento, dividir las cuentas por segundo para cada elemento de las cuentas por segundo, ya sea para Cs o Sb. </li><li> Generar curvas de calibración para cada uno de los elementos. <ol><li> Determinar el área bajo el pico de metal que corresponde a la metalloprotein que está obligado a para cada una de las inyecciones mediante la realización de la integración de picos en el software de análisis de datos preferida. </li><li> Trazar el área bajo el pico de metal frente a la cantidad total del metal que fue inyectado en la columna en cada ejecución, 200 - 6000 g / L de Cu y Zn y 2000 - 60.000 mg / L de Fe. Realizar un análisis de regresión lineal de acuerdo con el protocolo de software. </li><li> Utilizar los resultados de pendiente a partir del análisis de regresión lineal como un factor para convertir cuentas por segundo a pg / seg. Divide cada una de las cuentas por segundo puntos de datos en todo el cromatograma por el gradiente de la línea de valor. </li></ol></li><li> Graficar los datos enpg / seg para el tiempo cromatograma. Determinar el área bajo los picos de interés. El área bajo el pico representa la cantidad total de metal que la proteína se une a, en pg. </li><li> Generar una calibración basado en el peso molecular de las metaloproteínas conocida y la hora a la que se eluyen. Use esto para estimar el tamaño de los picos de proteínas en muestras complejas. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Asegurar el estado nativo de la proteína significa una atención especial a los tampones y es necesario efectuar el almacenamiento de la muestra. No se pueden emplear todas las técnicas de cromatografía o técnicas de preparación de muestras. Es importante que los tampones utilizados en la preparación de muestras y la cromatografía están desprovistas de quelantes de metales y tampones de uso que imitan pH y concentraciones de sal fisiológicas. Otras condiciones a evitar incluyen el calentamiento de la muestra o la adición de agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, urea). Es crítico para reducir al mínimo el número de ciclos de congelación y descongelación. La capacidad de la memoria intermedia elegida para unir metales divalentes también es importante y es una razón que Tris o de amonio tampones nitrato se eligen entre topes basados ​​en fosfato. La capacidad de baja resolución y pico de la cromatografía de exclusión de tamaño en relación con otras formas de cromatografía es una limitación importante de esta técnica. Sin embargo, la naturaleza suave de tamaño chromatogra exclusiónphy es importante mantener el estado nativo de la proteína y por lo tanto preservar los enlaces metal-proteína relativamente débiles. El requisito para mantener el estado natural de las proteínas requiere especial atención al tratamiento de las muestras, incluyendo la limitación del número de ciclos de congelación y descongelación, evitando quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) o sales y detergentes caotrópicos. Esta baja resolución de este impactos técnica de la capacidad de cuantificar la cantidad de metal asociado con una proteína específica si se encuentra en una muestra compleja como los picos observados contendrá más de una proteína. Por lo tanto, la cantidad de metal se determina utilizando el pico de la integración sería una indicación de la cantidad total de metal asociado con todas las proteínas que eluye a este punto de tiempo y no sólo una proteína específica. Con el fin de superar esta limitación la proteína de interés tendría que purificarse adicionalmente en condiciones nativas. Esto permitiría la cuantificación deel metal asociado con esta proteína que se informó con un mayor grado de certainity. Otra limitación potencial de esta técnica sería la pérdida de proteína debido a la unión reversible no a la columna. Con el fin de determinar si esto está ocurriendo un experimento de recuperación debe ser llevado a cabo mediante el cual se analiza la cantidad de proteína de elución de la columna para determinar si este coincide con la cantidad inyectada. El mismo se puede hacer mediante la medición del contenido de metal del material de elución y el material de partida por mayor ICP-MS. La recuperación de la columna puede variar dependiendo de las condiciones usadas, pero se ha demostrado que la recuperación completa de proteínas a partir de una columna de exclusión por tamaño es posible 9. Por lo tanto, es importante comprobar si hay o no hay ninguna pérdida en las condiciones de operación que se utiliza. Las modificaciones en el protocolo pueden estar relacionados con las normas metaloproteínas que se utilizan, así como los elementos analizados. El tipo de norma metaloproteına nosotrosed será diferente dependiendo de los elementos que son de interés. Para los elementos tales como Cu, Fe y Zn proteínas, se emplean SOD y ferritina. Cualquier otro metalloprotein que tienen stoichometries conocidos también se pueden utilizar y algunos ejemplos se han mostrado aquí. Una de las principales complicaciones que pueden surgir de la utilización de esta técnica es la acumulación de cristales de sal en la antorcha del ICP-MS. Para evitar la acumulación de cristales de sal, la antorcha se lava con agua destilada después de cada 500 - 1000 ml de tampón que se ha transmitido a través del sistema o cuando se determina mediante inspección visual de que el soplete se debe lavar. Otro problema que puede surgir es un descenso más rápido de la limpieza de los conos y extracción de muestras. Estos deben ser limpiados con regularidad siguiendo los protocolos del fabricante. La preparación de la muestra inicial es el paso más crítico en el protocolo. Si hay algún cambio en la proteína - complejo de metal de la información generado no será válida. Esta es una de las principales limitaciones de la técnica; Además el uso de la baja resolución, columna de exclusión por tamaño se obtiene una vista de detalle limitado de la verdadera complejidad de metaloproteínas de la biología. La técnica descrita aquí permite la expansión del conocimiento de la metalloproteome de un organismo. El análisis a granel sólo da una indicación aproximada de los cambios a la cantidad de metal dentro de una muestra. Además de las consideraciones generales que deben tenerse en cuenta, esta técnica proporciona una herramienta que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de metal asociado con proteínas, así como la identificación de metaloproteínas que difieren mediante la comparación de las trazas obtenidas. El uso de esta técnica se puede emplear para identificar las diferencias entre los estados de enfermedad. Los metaloproteınas identificados a continuación, pueden investigarse más a fondo para ayudar a determinar el papel que desempeñan en los procesos de enfermedad. La aplicación de un guión ICP-MS tiene un crecimientofuturo para determinar el papel de los fármacos que tienen un heteroátomo tal como el platino, el yodo o el cobre como el ICP-MS se puede utilizar para identificar las proteínas que se une el fármaco.

metales esenciales desempeñan un papel vital en las funciones biológicas normales, incluyendo las vías mensajeras secundarias, vías de metabolismo y las funciones de los orgánulos. 30% de todas las proteínas se cree que son metaloproteínas 1 y 50% de todas las enzimas 2. Metaloenzimas utilizan estos metales traza como cofactores para catalizar reacciones químicas, estabilizar la estructura de proteínas, y para las funciones de regulación, tales como mensajeros secundarios. Algunos de los elementos traza más estudiados en lo que respecta a la neurodegeneración son el cobre, el hierro y el zinc 3. Se cree que participan en muchas vías de la enfermedad, donde por dyshomeostasis puede tener efectos adversos. Por ejemplo el estado de metal de la superóxido dismutasa (SOD) directamente afecta a la duración de la vida y el fenotipo de los modelos de ratones transgénicos de tipo familiar de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) 4. En la enfermedad de Alzheimer, metalloproteomics técnicas se han utilizado para descubrir una disminución en el estado de metal de transferrina en pLasma 5. Estos estudios ponen de relieve las metaloproteínas importante papel que pueden desempeñar en la enfermedad. El estudio de metaloproteínas directamente de los tejidos biológicos es un campo en desarrollo. Aunque algunos metaloenzimas se han caracterizado, la mayoría todavía permanecen sin caracterizar o desconocido 6. Uno de los principales retos en metaloproteínas de medición es el requisito para mantener el estado natural de la proteína 7. Classical abajo arriba técnicas proteómicas se basan en la digestión de las proteínas en péptidos. Este proceso altera la interacción no covalente de metales y sus proteínas. Por lo tanto, se obtiene ninguna información sobre el estado de metal de una proteína. Una forma de superar este problema es mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño se combina con plasma acoplado inductivamente - 8,9 espectrometría de masas (SEC-ICP-MS). Esto genera información sobre el tamaño aproximado de la proteína, así como de todos los metales que son Associated con él 10. Además, la exclusión de tamaño es una técnica cromatográfica suave que puede preservar el estado natural de un complejo de enzima o proteína-proteína. Una de las ventajas de la utilización de plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (ICP-MS) es la naturaleza cuantitativa de la tecnología. El uso de un conjunto de normas de metaloproteínas es posible proporcionar la cuantificación absoluta de metaloproteínas de muestras biológicas 9,11. Esto se logra mediante la generación de una curva estándar mediante la inyección de metaloproteínas conocidos en un intervalo de concentraciones de metales. Este protocolo muestra un ejemplo de cómo esto puede lograrse por una variedad de normas de metaloproteínas. En este trabajo pretendemos crear las curvas de calibración para los metales que son investigados en gran medida en los campos biológicos, incluyendo el hierro (Fe), cobre (Cu), zinc (Zn), yodo (I) y cobalto (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

El uso de estándares metaloproteínas permite la calibración de la columna de exclusión de tamaño. La Figura 1A muestra el perfil de elución para la normas tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y la vitamina B 12 basada en el metal que están obligados a (Fe, Co, Cu, Zn y I). la Figura 1B muestra la curva de calibración para la columna de exclusión de tamaño en base al peso molecular de los estándares de proteína y su tiempo de elución, se presenta en el formato de volumen de elución (Ve) dividido por el volumen vacío de la columna (Vo). Las proteínas usadas para generar esta curva estándar se concanavalina A, conalbúmina, ceruloplasmina, la ferritina, SOD y tiroglobulina. La Figura 2A muestra la elución de la ferritina en un rango de 2.000 - 60.000 pg de Fe inyectada en la columna y la Figura 2D es el análisis de regresión a cabo utilizando párea EAK. Figuras 2B y 2C son los perfiles de elución de Cu / Zn SOD para Cu y Zn y 2E y 2F son los análisis de regresión generadas usando áreas de los picos. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos en bruto en los recuentos / seg a pg / seg por lo que la cantidad de metal asociado con la proteína puede determinarse cuantitativamente. La conversión se realiza dividiendo la cuentas / s por la pendiente de la regresión lineal (por ejemplo, 334,6 (cuentas / segundo) x (seg / pg) de cobre). Como se ha indicado, esta técnica se puede utilizar para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Cerebro y plasma humano han sido sometidos a esta técnica y las figuras 3 y 4, respectivamente, muestran los resultados obtenidos. El cerebro humano separados por SEC-ICP-MS se muestra en las figuras 3A-3C, cada uno de los cuales representan un metal diferente de<html> interés (Cu, Zn o Fe). Las figuras 4A-4C muestran las trazas obtenidas cuando el plasma humano es sometida a esta técnica. La complejidad y la abundancia de la muestra tendrán un impacto en el número de picos que se ven. Como plasma esperada está dominado por unos pocos metaloproteınas incluyendo ceruloplasmina y transferrina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figura 1. Calibración de cromatografía de exclusión - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Usando Conocido perfil metaloproteínas (A) La elución de las normas de las metaloproteinasas basadas en sus respectivos metales.. (B) curva de calibración de peso molecular para los estándares de proteína tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbúmina (iv), Cu / Zn SOD (v) y concanavalina A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figura 2. Uso de ferritina y Cu / Zn SOD como Normas metalloprotein para determinar la cantidad de Cu, Fe o Zn Asociado con metaloproteínas en una muestra biológica compleja (A) Perfil de elución de ferritina sobre el rango de inyección de 2.000 -. 60.000 mg / l de hierro. (B) y el perfil de elución (C) para la Cu / Zn SOD sobre el rango de inyección de 200 - 6000 g / l de cobre y zinc, respectivamente. (D), (E) y (F) muestran los resultados del análisis de regresión para el hierro metales, cobre y zinc, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Cu, Fe y Zn Metalloproteome del cerebro humano. (A) traza de cobre (B) traza hierro (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra mediante el trazo negro con su peso molecular se indica en el gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figura 4. Cu, Fe y Zn Metalloproteome de plasma humano. (A) traza traza Hierro Cobre (B) (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra por la traza negro con su peso molecular endicated debajo de la gráfica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

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15.0K vistas.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Investigación

Química

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Medición de Tamaño de Partícula de distribución en turbias Soluciones por Dynamic Light Scattering Microscopía

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Fabricación y pruebas de termómetros fotónicos

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with controlled dimensions. This approach begins with synthesis of a functionalized lactone which is key to the pendant functionalization of the resulting polymer. Valerolactone (VL) and allyl-valerolactone (AVL) are then copolymerized using ring-opening polymerization. Post-polymerization modification is then used to install an epoxide moiety on some or all of the pendant allyl groups. Epoxy-amine chemistry is employed to form nanoparticles in a dilute solution of both polymer and small molecule diamine crosslinker based on the desired nanosponge size and crosslinking density. Nanosponge sizes can be characterized by transmission electron microscopy (TEM) imaging to determine the dimension and distribution. This method provides a pathway by which highly tunable polyesters can create tunable nanoparticles, which can be used for small molecule drug encapsulation. Due to the nature of the backbone, these particles are hydrolytically and enzymatically degradable for a controlled release of a wide range of hydrophobic small molecules.

This article describes a process for tuning the size and crosslinking density of covalently crosslinked nanoparticles from linear polyesters containing pendant functionality. By tailoring synthesis parameters (polymer molecular weight, pendant functionality incorporation, and crosslinker equivalents), a desired nanoparticle size and crosslinking density can be achieved for drug delivery applications.

Nanosponge afinabilidad de tamaño y densidad de entrecruzamiento

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Desenredar las fibras de aramida de copolímero de alta resistencia para permitir la determinación de sus propiedades mecánicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Aplicación de voltaje en el análisis de tamaño de partículas de dispersión de luz dinámica

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...