Nuestro método es significativo, ya que permite al bioquímico promedio determinar rápidamente si las muestras aisladas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas están contaminadas con metales de transición. La principal ventaja es la facilidad con la que se puede realizar el ensayo. El ensayo utiliza instrumentación y técnicas comunes a la mayoría de los laboratorios de bioquímica, y se puede implementar fácil y rápidamente.
Mientras que en este artículo aplicamos este método para muestras aisladas con una columna de níquel-NTA, el método se puede utilizar con cualquier otra resina de afinidad de metal. Los usuarios por primera vez deben probar este método con una solución de material de níquel de concentración conocida. Esto los familiarizará con el flujo de trabajo, los colores de la muestra y las resinas que se muestran en los cambios espectrales.
Demostrando el procedimiento estará Cole Swain, un técnico de mi laboratorio. Para empezar, encienda y caliente el espectrofotómetro UV-Vis. Determinar las fracciones de cromatografía a ensayo utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos con absorbancia óptica a 280 nanómetros para cuantificar la proteína.
Obtenga de 10 a 100 tampón de muestra milimiolar con un PH entre 7 y 12, como Tris, HEPES, MOPS y tampón de fosfato. Preparar una solución de 12% de peso por volumen de dispersión de HNB en el tampón de muestra utilizando 120 miligramos de reactivo HNB para cada mililitro de solución de stock preparado. Establezca el espectrofotómetro para recopilar datos en 647 nanómetros.
Utilice una cubeta de cuarzo llena con el búfer de muestra para dejar en blanco el espectrofotómetro. Preparar una solución de control en una cubeta que contenga 50 microlitros de HNB por mililitro del volumen total del ensayo. Deje que el control se incuba durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.
Mida y registre la absorbancia en 647 nanómetros para la muestra de control. Prepare las muestras de ensayo mezclando 150 microlitros de caldo HNB con 2850 microlitros de fracciones de proteínas adecuadamente diluidas con el tampón de muestra. Dejar incubar la muestra durante un mínimo de tres minutos a temperatura ambiente.
Repita la grabación de espectro para cada fracción a medir. En el caso de que no se obtenga suficiente dilución, toda la banda espectral a 647 nanómetros ha desaparecido. Mientras que con una dilución demasiado fuerte, la muestra es indistinguible del control.
Para determinar la concentración de metal en cada muestra, primero encuentre la diferencia de cada absorbancia de muestra a 647 nanómetros del control HNB. Determinar la concentración de metal en micromolar utilizando la fórmula donde el DF es el factor de dilución para la fracción de ensayo, delta A-B-S 647 es el cambio de absorbancia a 647 nanómetros, 3.65 veces 10 a la negativa 2 representa el coeficiente de extinción de HNB, y l es la trayectoria óptica de la cuvette en centímetros. En este estudio, aquí se muestra el espectro de HNB libre en PH neutro en espectros representativos de fracciones ensayadas para ion de níquel del aislamiento de MSP1E3D1.
Se observó una disminución de la absorbancia en 647 nanómetros en comparación con el control HNB, que correspondía a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Para demostrar la aplicación de este ensayo, se analizaron dos proteínas de andamios de membrana etiquetadas, MSP1E3D1, MSP2N2, y un novedoso citocromo de tipo C de tres hemo, de geobacter sulfurreducens. El contenido de iones de proteína y níquel de cada fracción para GSU0105 se desplazó significativamente entre sí, mientras que las fracciones para MSP1E3D1 y MSP2N2 que contenían la mayor cantidad de proteína también tenían el mayor contenido de níquel.
También se ilustra que el contenido del metal puede no distribuirse uniformemente entre las fracciones recogidas mediante una cromatografía de afinidad de metal movilizada. Es más importante mezclar adecuadamente y consistentemente el espacio en blanco en todas las muestras y permitir tiempos de incubación iguales para el espacio en blanco en todas las muestras. Las fracciones proteicas de especial interés podrían analizarse más a fondo con espectrometría de absorción atómica o ICPMS para confirmar la contaminación por metales y probar iones metálicos proteicos quelados o fuertemente unidos.
Además de la detección de lixiviación de metales de transición, esta técnica se puede utilizar para medir las afines de unión en iones metálicos de transición a proteínas. HNB y cualquier níquel presente en las muestras son irritantes para los ojos y la piel respectivamente. Durante el método se debe utilizar EPI estándar, incluidos guantes y protección para los ojos.
