Este trabajo fue financiado por la Alianza de NanoHealth pre-centro de premio (W81XWH-11-2-0168) y Texas Centro de Nanomedicina Cáncer (1U54CA151668-01).

1. Fabricación de chips <ol><li> Crear la solución de revestimiento para el chip, empezando con la solución de precursor de silicato hidrolizado. Mezclar 14 ml de tetraetilortosilicato (TEOS) con 17 ml de etanol, 6,5 ml de agua desionizada y 0,5 ml de HCl 6M bajo fuerte agitación (1200 rpm) usando un revolver placa caliente. Calentar esta solución a 80 ° C durante 2 horas, manteniendo la agitación constante. </li><li> Se preparan soluciones de polímero mediante la adición de la deseada tri-bloque coploymer (Pluronic F127, L121 y P123) a 10 ml de etanol a temperatura ambiente con fuerte agitación. Completa la mezcla por adición de 7,5 ml de la solución de silicato (del paso 1,1) en la solución del copolímero tri-bloque seguido de 2 horas de fuerte agitación a temperatura ambiente. Esto representa la solución de revestimiento final. </li><li> Aplicar 1 ml de solución de revestimiento a una oblea de silicio de 4 pulgadas por recubrimiento por rotación a una velocidad de 1500 rpm durante 20 segundos. Entonces el calor a 80 ° C durante 12 horas. </li><li> Calentar las películas para quitar Su orgánicarfactant elevando la temperatura de 1 ° C por minuto hasta 425 ° C y hornear durante 5 horas. </li><li> Trate previamente la sílice mesoporoso (MPS) con la superficie del chip incineración con plasma de oxígeno (Plasma Asher - marzo de plasma del sistema). (O 2 Caudal: 80 cm ³, potencia: 300 W, tiempo: 10 minutos). </li><li> Opcional superficie modificación química: virutas silanate en 3% en un organosilano metanol: agua DI (19:1) solución durante 72 horas a temperatura ambiente en un N 2 guantera. Enjuagar secuencialmente con metanol y agua desionizada. Cure fichas a 110 ° C durante 15 minutos en un horno con ventilador accionado. </li></ol> 2. Ejemplo de Pre-tratamiento <ol><li> Añadir TFA y ACN para cada muestra de suero de tal manera que las concentraciones finales son 0,01% de TFA y 5% de ACN. Vortex para mezclar. </li><li> Agitar estas muestras en una mesa de vórtice agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li></ol> 3. El fraccionamiento de suero <ol><li> Pre-hornear virutas durante la noche en un horno a 160 ° C. Por otra parte, almacenamientoe las fichas en un desecador hasta su utilización para evitar la hidratación de la superficie por el agua en el aire ambiente. </li><li> El uso de aire comprimido a desempolvar cualquier partícula que pueda haber en la superficie del chip. </li><li> Cortar prefabricado, comprado CultureWell cámaras cubreobjetos para incluir el número deseado de pozos. Cubreobjetos limpia con etanol al 100% y luego colóquela sobre una superficie de chips de MPS. Presione hacia abajo cubreobjetos con unas pinzas para asegurar un sellado completo con chip. </li><li> Pipetear 10 L de muestra de suero en cada uno de 3 mm bien. Incubar durante 30 minutos en una cámara humidificada, a temperatura ambiente. </li><li> Pipeta hasta el suero de los pozos y deseche. Pipetear 10 L de agua desionizada a cada pozo para lavar proteínas más grandes. Repite 4 veces. </li><li> Verter de 5 l de tampón de elución (0,1% TFA + 50% ACN) a cada pocillo de la muestra. Pipetear arriba y hacia abajo 30 veces mientras se mueve alrededor de la punta de la pipeta en el pozo para mezclar el tampón de elución. (Solamente se aplican tampón de elución a 1-2 muestras en un tiempo para evitar tampón de eluciónse evapore tan rápidamente). </li><li> Después de mezclar, pipetear todo el tampón de elución y colocar en un tubo de microcentrífuga hasta que esté listo para realizar análisis MALDI-TOF. </li><li> Con el fin de emular la complejidad de una muestra biológica y para evaluar el efecto de enriquecimiento en la cosecha de las especies de bajo peso molecular con nuestro sistema de fraccionamiento en el chip, se seleccionaron y se reunió una mezcla estándar de proteínas y péptidos de conteo veintiséis especies diferentes con una amplia distribución de pesos moleculares (900-66 500 Da) y PI (4,0 a 10,2) y concentraciones (0.5-8 pmol / l) (véase la lista de proteína en la Tabla 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF análisis de los péptidos <ol><li> Punto 0.5 l de la muestra a la placa de MALDI objetivo y dejar secar. </li><li> Punto 0,5 matriz l (α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), 5 g / l) o una solución saturada de ácido trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (SA) en 50% de acetonitrilo que contenía 0,1% de TFA y permitir a co-cristalización. &lt;/ Li&gt; <li> Punto 0.5 l de solución de calibración para cada punto de calibración y deje que se seque. </li><li> Inserte la placa de destino en el espectrómetro de masas MALDI-TOF. La máquina debe estar configurado en modo positivo con un reflector de la intensidad del láser de 4200 y 3000 disparos por ejemplo. El rango de masas seleccionado debe ser 800 a 5000 Da con una masa objetivo de 2000 Da. </li><li> Realice mismo análisis MALDI-TOF en el modo lineal, sino cambiar el rango de masas de 900 a 10.000 Da o Da 3000 a 70.000 y una masa objetivo de 5000 Da. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Los espectros de crudo fueron procesados ​​con el software ConvertPeakList y los datos se exportan a SpecAlign software para procesamiento previo. Todos los espectros fueron alineados utilizando el método de correlación PAFFT y las intensidades se normalizaron a la corriente total de iones (TIC) en cada espectro correspondiente. Todos los espectros se alisa y se de-divulgó con el factor de 4 y 0,5, respectivamente. Los picos se detectaron con una línea de base de 0,5 ventana de masa, de 21 y la alturaratio de 1,5, los valores negativos fueron retirados antes del análisis. </li><li> La agrupación jerárquica se ha realizado mediante Cluster 3.0 y visualizados con el software de Mapletree. MALDI MS de datos (m / z pico de intensidad) es log-transformados, normalizada, y centrado en la mediana. De correlación de Pearson se utilizó para calcular la distancia entre las muestras, y la agrupación de ligamiento completo se realizó. </li><li> Un estudiante independiente t-test fue utilizado para la comparación entre los grupos (n = 2 grupos) para cada pico detectado MS antes del análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado. Un valor de p de 0,02 o menos fue considerado significativo para seleccionar los péptidos y las proteínas diferencialmente cosechados entre los distintos chips de mesoporosos proteómicos (poros grandes frente a pequeños poros). </li></ol> 6. Los resultados representativos Como se muestra en la Figura 1, en ​​este estudio se han fabricado una serie de películas delgadas de sílice mesoporosos con una variedad de nanotextures y explorado exhaustivamente elIR en uso selectivo Figura 2a capturar y enriquecer péptidos y proteínas LMW partir de suero humano. yb muestran los espectros de MS de la muestra de suero sin procesar para péptidos en el intervalo de 900 a 10.000 Da y para las proteínas en el intervalo de 3.000 ~ 70.000 Da, respectivamente . Estos espectros ilustran la supresión de la señal en la región LMW debido a la presencia de bien ionizado, muy abundante, de alto peso molecular (HMW) de proteínas tales como albúmina. Figura 2c y d muestran los espectros de MS de la muestra de suero después de fraccionamiento por el L121 MPS (tamaño de poro, 6 nm). La mayoría de las moléculas grandes se han agotado, resultando en un enriquecimiento significativo de los componentes LMW. Como control, la misma muestra de suero se aplicó sobre una superficie no porosa de sílice puro para evaluar la especificidad de las películas delgadas de MPS para la recuperación PBPM. Como puede verse en la Figura 2e y f, no hubo cosecha significativa de peplas mareas o las proteínas de la sílice porosa. Así se puede concluir que era la arquitectura mesoporoso y no la afinidad superficie de la sílice que constituye el factor predominante en el enriquecimiento de PBPM. Precisamente controladas variaciones en el tamaño de poro se puede lograr mediante el uso de copolímeros con diferentes longitudes de bloques hidrófobos. Mediante el uso de las proteínas y la mezcla de péptidos diseñados, el efecto del tamaño de poro en el péptido LMW y la eficacia de recuperación de proteína se investigó utilizando MPS películas delgadas preparadas a partir de cuatro tensioactivos Pluronic (F127, P123, L121, L121 y más agente de hinchamiento) con diferentes relaciones de volumen de los componentes hidrófilos e hidrófobos para formar tamaños de poro de 3,7 nm, 5.2, 7.4 nm y 9,0 nm, respectivamente. Esta gama de tamaños de poro condujo a la recuperación de un repertorio diferente de péptidos y proteínas a partir de la misma muestra de suero a través de tamaño y forma de exclusión (Figura 3). Los espectros de proteínas de alto peso molecular en demonstrate el corte molecular de cada tipo de chip. Además de la reducción dependiente del tamaño de las proteínas de alto peso molecular, el fraccionamiento en el chip de la solución de estándares muestra un diferencial y el enriquecimiento selectivo de especies LMW asociados con los tamaños de poro. El agrupamiento de dos vías jerárquico presenta en la Figura 3b muestra el patrón LMW normas enriquecimiento obtenido con el MSC diferente. Incluso si todos los péptidos están por debajo del corte molecular de los chips, existe una correlación positiva entre los tamaños de poro y el peso molecular de las especies atrapadas. El MSC con poros grandes, de hasta 9 nm, preferentemente cosechar grandes péptidos, péptidos más pequeños mientras se recuperan más eficazmente por los chips con poros más pequeños. La transformación estructural de la disposición mesoporoso se llevó a cabo mediante la regulación de la concentración del polímero plantilla. El aumento de la concentración del polímero plantilla resultó en una curvatura reducida interfacial entre las fasesdel agua, el copolímero, y el silicato, por consiguiente, iniciando la progresión interrelacionada de un esférico a una estructura cilíndrica. Pluronic F127, con su alto peso molecular, posee este alto grado de periodicidad estructural. Al aumentar la concentración de F127 en el inicio de solución, diferentes nanoestructuras MPS película delgada periódicos se puede obtener de nanoestructura 3D para nanoestructura 2D. Las nanoestructuras 3D cúbicos y hexagonales de nido de abeja, que posee la interconexión nanopore más deseable y la morfología de nanopore más accesible, exhiben un rendimiento superior en forma selectiva enriquecer péptidos de BPM que la estructura hexagonal 2D, a pesar de que comparten las mismas distribuciones de tamaño de poro y la misma moleculares de corte para el suero fraccionamiento (Figura 4). También simplificado la conjugación de organo-silano en los chips de MPS mediante la introducción de plasma de oxígeno calcinación para pretratar la superficie del chip. Con el fin de estudiar cualitativamente el efecto electrostático en selectoive en el chip de enriquecimiento, se utilizan las proteínas y la mezcla de péptidos. MS análisis de la solución de estándares proteómicos fraccionó en los chips de MPS preparados con L121 y conjugados con los grupos funcionales químicos se presentan en la Figura 5. La carga positiva y negativamente cargado los péptidos y proteínas LMW son capturados en el aniónico y los chips catiónicos respectivamente. La comparación cuantitativa de los chips de MPS múltiples en la recuperación de los péptidos con carga neta positiva se muestra en la Figura 5a. Los chips con carga negativa y las fichas sin ningún tipo de modificación (con un cargo negativo menor originalmente) muestran el enriquecimiento significativamente mayor para los péptidos que los chips modificados con APTES (-NH 2). A la inversa, los chips cargados positivamente MPS poseen capacidad excepcional para recuperar esos péptidos con carga neta negativa, como se demuestra en la Figura 5b. Mientras α-endorfina no muestra un cambio significativo due a su PI alrededor de 6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Figura 1. Principio de MPS fraccionamiento fichas y el enriquecimiento de BPM. Después muestra manchas en la superficie, las proteínas y péptidos LMW están atrapados en los poros, mientras que las especies más grandes se mantuvo fuera de los poros y se elimina durante las etapas de lavado. Las fracciones enriquecidas se eluyen a continuación y se analizaron por MALDI. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Figura 2. Enriquecimiento péptido utilizando los chips de sílice mesoporosos de película delgada. MALDI MS perfiles, tanto en el rango de masa baja (900 a 10 000 Da) y el rango de masas de alta (3000 a 70 000 Da) antes de (a, b) y después (c, d) el tratamiento de suero en las películas delgadas de sílice mesoporosos ( L121, de 6 nm). La recuperación molecular se reduce significativamente cuando se utiliza en blanco superficies no porosas de sílice (e, f). <img alt="Figura 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Enriquecimiento molecular de corte y el tamaño depende de los chips de MPS. (A) vista ampliada de los espectros de MALDI demostrando la característica molecular de corte de cada uno de los chips MPS correlacionan con el tamaño de poro. (B) la agrupación de dos vías jerárquicas de las características de una mezcla de péptidos entre los diferentes chips. La intensidad del color rojo o amarillo indica la concentración de péptido relativa. Poros más grandes mejorado la recolección de grandes péptidos (3600 a 8500 Da), mientras que los péptidos pequeños (900 a 3500 Da) se recuperaron preferentemente desde los chips con poros más pequeños. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterizaciones físicas de películas delgadas de MPS y la recuperación selectiva con diferentes nanoestructuras. XRD patrones (a, b, c), TEM (recuadro a, b, c), Pluronic F127 a diferentes concentraciones en la solución de precursor: 4,0 x10 -3 M (una), 6,0 x 10 -3 M (b), y 8,0 x 10 -2 M (c). (D) del gráfico de barras de la intensidad de detección que ilustra la recuperación selectiva péptidos en 3D cúbicos y 3D hexagonales F127 virutas proteómicos (Cub y hexagonal, respectivamente). Las modificaciones estructurales diferentes presentar un enriquecimiento selectivo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Figura 5. Carga específica de recuperación para los chips con funciones de superficie. Barra gráfica de la intensidad de MS de detección de péptidos selectivamente capturadas en los chips funcionalizados. De acuerdo con su punto isoeléctrico, los péptidos son carga positiva o negativa a pH 7,0. (A) péptidos positivos ((1) des-Arg1-bradiquinina, (2) La bradiquinina, (3) la sustancia P-amida, (4) neurotensina, (5) de ACTH (1-17), (6) de ACTH (7 - 38)) están específicamente enriquecido en la carga negativa-surcaras. (B) péptidos negativos ((7) Glu1-fibrinopéptido B, (8) α-endorfina, (9) de insulina de ACTH (18-39), (10), (11) de EGF, (12) similar a la insulina GFII) son específicamente enriquecido en las superficies de carga positiva. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Figura 6. On-chip de estabilización de suero fraccionado. (A) Representante perfiles MALDI de péptidos y proteínas LMW eluye inmediatamente después de fraccionamiento de suero (la parte superior) o después de 3 semanas de on-chip de almacenamiento a temperatura ambiente (inferior). (B) De arriba a abajo: el análisis de regresión lineal de las intensidades medias de los picos detectados de EM en cada repetición en comparación con el replicar de un recién fraccionado de suero y se fraccionó suero después de MPS 3wk de almacenamiento de los chips a temperatura ambiente. La ecuación, CV y el coeficiente de determinación (R 2) se indican.

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	<li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer.">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li><li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+early+detection.">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li><li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers.">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li><li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+written+in+blood.">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics.">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+old,+old+fashioned,+but+it+still+climbs+up+the+mountains.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein.">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li><li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome.">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Se están acumulando pruebas de que el bajo peso molecular región del proteoma circulatorio es una rica fuente de biomarcadores de diagnóstico para la detección precoz de la enfermedad. En esta tecnología, hemos presentado una serie de chips de silicio mesoporosos, con tamaños de poro diferentes, las estructuras de los poros y modificaciones para enriquecer de manera selectiva péptidos y proteínas de bajo peso molecular. Para evaluar la estabilidad de proteínas, los chips de MPS se incubaron con suero humano, se secó después del lavado, y se almacena para 3wk a temperatura ambiente. Los patrones de proteínas / péptidos obtenidos fueron comparables con las de suero recién fraccionada (Figura 6a), confirmado por los resultados del análisis estadístico mostró en la Figura 6b. La variabilidad de las señales de pico medidos por el CV medio se estimó en 12,7% para el suero crudo y en el 14,2% de las muestras fraccionadas. Las variaciones marginales podría ser debido a la variabilidad interna del instrumento MALDI y sugirió que la juntan-chip de pretratamiento y almacenamiento no indujo ninguna alteración significativa de los perfiles de proteínas MS. El mismo experimento se ha realizado en el silicio poroso no. El suero seco recuperado después del almacenamiento en la superficie de silicio se fraccionó en los chips MPS antes del análisis MALDI. El perfil de pobre MS obtenidos demostraron la ventaja de estabilización de la superficie mesoporoso. En analogía con los mecanismos previamente postulado, que postula que las especies LMW atrapados dentro de los nanoporos se han conservado de la degradación a través de la exclusión por tamaño de las proteasas, o por la inhibición estérica de su actividad proteolítica en el espacio confinado de los nanoporos. El método basado en chip de MPS podría ser una herramienta poderosa en el péptido y el perfil de proteínas LMW de estudio complejo de los fluidos biológicos. Los chips de MPS son baratas de fabricar y permitir la producción a escala hasta alcanzar el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras, proporcionando características ventajosas para exploratorio cribado y biomarcador de descubrimiento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Tetraetoxisilano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Giro revestidor </td><td> Brewer Ciencia </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson de marzo </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Elipsómetro espectroscópica </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-hidroxicinámico </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matriz para MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxiácido cinámico </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matriz para MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Revuelva la placa caliente </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell cámaras cubreobjetos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm de diámetro. X 1 mm de profundidad, 3.10 l, estéril </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-70-PPO PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO 70-PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-70-PPO PEO 20 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Propiedades físico-químicas y concentraciones diseñados (peso molecular y IsoPunto-eléctrico) del péptido seleccionado y los estándares de proteína.

low molecular weight protein enrichment on mesoporous silica thin films for biomarker discovery

La identificación de marcadores biológicos circulantes tiene un gran potencial para los no invasivos en el diagnóstico precoz y pronóstico, así como para el seguimiento de la eficacia terapéutica. 3.1 La circulación de proteoma de bajo peso molecular (PBPM), integrado por pequeñas proteínas desprenden de los tejidos y células, o fragmentos peptídicos derivados de la degradación proteolítica de proteínas más grandes, se ha asociado con el estado patológico en pacientes y probablemente refleja el estado de enfermedad. 4,5 A pesar de estas aplicaciones clínicas potenciales, el uso de espectrometría de masas (MS) para perfilar la PBPM desde fluidos biológicos ha demostrado ser muy difícil debido a la gran rango dinámico de las concentraciones de proteínas y péptidos en el suero. 6 Sin muestra pre-tratamiento, algunas de las proteínas más abundantes altamente oscurecer la detección de baja abundancia de especies en suero / plasma. Actuales enfoques basados ​​en la proteómica, como de dos dimensiones en gel de poliacrilamida-elmétodos ectrophoresis (2D-PAGE) y la proteómica son de escopeta en mano de obra intensiva, bajo rendimiento y la idoneidad de una oferta limitada para aplicaciones clínicas. 9.7 Por lo tanto, una estrategia más eficaz se requiere para aislar PBPM de la sangre y permitir que el cribado de alto rendimiento de las muestras clínicas . A continuación, presentamos una forma rápida, eficiente y confiable de varios fraccionamiento sistema basado en los chips de sílice mesoporosos para apuntar específicamente y enriquecer PBPM. 10,11 mesoporosos de sílice (MPS) películas delgadas con características ajustables a escala nanométrica se fabricaron utilizando la vía de copolímero de tres bloques de plantilla . El uso de plantillas diferentes polímeros y las concentraciones de polímero en la solución de precursor, varias distribuciones de tamaño de poro, estructuras de poros, conectividad y propiedades superficiales se determinaron y se aplica para la recuperación selectiva de proteínas de baja masa. El análisis selectivo de los péptidos enriquecidos en las diferentes subclases de acuerdo a sus propiedades físico-químicas se en-Hance la eficiencia de la recuperación y la detección de especies de baja abundancia. En combinación con la espectrometría de masas y el análisis estadístico, se demostró la correlación entre las características nanofase de las películas delgadas de sílice mesoporosos y la especificidad y la eficacia de la cosecha baja proteoma de masas. Los resultados presentados en este documento revelan el potencial de la tecnología basada en la nanotecnología para proporcionar una poderosa alternativa a los métodos convencionales de recolección PBPM de fluidos biológicos complejos. Debido a la capacidad de sintonizar las propiedades de los materiales, la capacidad de producción de bajo costo, la sencillez y la rapidez de la toma de muestras, y los requerimientos de la muestra muy reducidos para el análisis, esta novela de la nanotecnología tendrá un impacto sustancialmente el campo de la investigación de biomarcadores proteómicos y proteómica clínica evaluación.

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Hemos desarrollado una tecnología basada en película delgada de sílice mesoporoso para la recuperación selectiva de proteínas de bajo peso molecular y péptidos de suero humano. Las propiedades físico-químicas de nuestros chips mesoporosos fueron finamente sintonizada para proporcionar un control importante en el enriquecimiento de péptido y por lo tanto el perfil de la proteoma de suero para el diagnóstico.

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

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Research

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13.3K vistas.  The Methodist Hospital Research Institute. Hemos desarrollado una tecnología basada en película delgada de sílice mesoporoso para la recuperación selectiva de proteínas de bajo peso molecular y péptidos de suero humano. Las propiedades físico-químicas de nuestros chips mesoporosos fueron finamente sintonizada para proporcionar un control importante en el enriquecimiento de péptido y por lo tanto el perfil de la proteoma de suero para el diagnóstico.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Investigación

Bioingeniería

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hidrogel Nanoparticle recolección de plasma o de orina para la detección de proteínas de baja abundancia

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

a base de varilla de fabricación de dispositivos robóticos adaptables pinza neumática suaves para la manipulación del tejido delicado

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...