We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).

1. Preparación Experimental Nota: Las disecciones y procedimientos inmunohistoquímicos en las secciones 2 y 3 se llevan a cabo de acuerdo con las referencias 3-6, pero con modificaciones. <ol><li> Preparar solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 (PBT). Mantenerlos en hielo. </li><li> Preparar el fijador de Bouin (15 Ácido pícrico: 10 El formaldehído: 1 Ácido acético glacial). Hacer de este reactivo nuevo. </li><li> Seleccionar pasadores minutien de acero inoxidable limpia y unas pinzas finas. </li><li> Preparar placas de disección que contienen un disco de Sylgard en una placa de Petri de 5 cm. </li></ol> 2. Disección del tercer estadio larvario NMJs <ol><li> Escoja errante larvas de tercer estadio de un vial o una botella con un pincel fino y colocarlos en una placa de Petri que contiene 2 cm PBS a 4ºC para lavar la comida residual de distancia. </li><li> Coloque una larva en la parte superior de la superficie Sylgard de la placa de disección y asegurarse de que es positioned con su lado dorsal de modo que los dos tubos traqueales longitudinales son visibles en la parte superior. </li><li> Usando las pinzas para sujetar el pasador, perno de la larva hacia abajo en su extremo anterior, directamente debajo del gancho de la boca. Estirar la larva a cabo tanto como sea posible y el pin de su extremo posterior hacia abajo. </li><li> Añadir una cantidad suficiente de solución salina PBS para llegar a las paredes de la placa y sumergirse por completo la larva. </li><li> Repetir el procedimiento de los pasos 2.1 a 2.3 para otras larvas del mismo genotipo. A 5 cm Petri placa plato único disección puede acomodar fácilmente hasta 8 larvas. </li><li> El uso de las tijeras micro-disección, levante ligeramente la cutícula dorsal y hacer una pequeña incisión horizontal en el extremo posterior cerca de la espiga. </li><li> Inserte tijeras en la incisión, corte la larva todo el camino hasta el extremo anterior a lo largo de la línea media entre las dos secciones longitudinales de la tráquea. Asegúrese de que los cortes de la línea media son lo suficientemente superficial para pasar sólo a través de la cutícula y para evitar cortar a través de los músculos deel lado ventral. </li><li> En cada extremo, cortar dos muescas en los lados izquierdo y derecho. </li><li> Abra el filete mediante la colocación de dos pasadores a ambos lados de la incisión anterior. Repita lo mismo con el extremo posterior. Al colocar los pines, asegúrese de difundir la pared del cuerpo aparte. </li><li> Limpiar los órganos internos utilizando fórceps y solución salina PBS. Deje el sistema nervioso central intacto. estirar suavemente la larva con los pernos de las esquinas hasta que esté completamente estirada, pero asegúrese de que los músculos no se rompen durante este proceso. </li><li> Repetir el mismo procedimiento para la disección de las larvas de otros en la misma placa de disección. </li><li> Lavar con solución salina PBS tres veces para eliminar todos los órganos internos. </li><li> Vuelva a colocar la PBS con fijador de Bouin y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Lavar varias veces con PBT. </li><li> Retire los pasadores con cuidado y transferir todos los preparativos, que ahora son bastante rígido, en un tubo de 1,5 ml de microcentrífuga de inmuno-tinción.</li></ol> La tinción inmunohistoquímica 3. de Drosophila NMJs con anticuerpos específicos para los músculos y mionúcleos <ol><li> enjuagar rápidamente los filetes de larvas en PBT. </li><li> Bloquear las preparaciones mediante incubación con 10% de suero normal de cabra (NGS) en PBT durante 2 horas con agitación constante. </li><li> Incubar un conjunto de NMJs disecados en PBT que contiene 5% de NGS y un anticuerpo de conejo anti-lamina (a una concentración de 1: 500) y con un anticuerpo anti-DVAP conejillo de indias (a una concentración de 1: 500) durante 2 horas a temperatura ambiente o a 4 ºC durante la noche. El anticuerpo anti-DVAP tiñe los músculos estriados, mientras que la tinción anti-lamin detecta el contorno de mionúcleos. </li><li> Lavar una vez con rapidez en PBT para eliminar los anticuerpos en exceso. Lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos. </li><li> Se incuban las muestras en PBT que contiene 5% NGS y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a 1: 500 dilución durante 2 horas a temperatura ambiente. Las mismas muestras cun ser sometidos a tinción con múltiples anticuerpos al mismo tiempo si se usan anticuerpos secundarios conjugados con diferentes cromóforos. </li><li> Eliminar los anticuerpos secundarios y lavar en PBT durante 2 horas, cambiando el PBT tampón cada 15 minutos. </li><li> Para teñir el interior de los mionúcleos lavar las muestras tres veces con PBS y proceder como sigue: <ol><li> Añadir el marcador nuclear TO-PRO-3 a una dilución de 1: 1000 en PBS y se incuba durante 20 min con agitación constante. Este marcador se utiliza en este estudio, pero cualquier otro marcador nuclear disponible en el mercado puede ser utilizado también. </li><li> Lavar rápidamente tres veces en PBS antes de montar. </li></ol></li></ol> 4. Las muestras de montaje en las diapositivas <ol><li> Recoger las muestras con una pinza del tubo de 1,5 ml de microcentrífuga y las ponen sobre un portaobjetos de procesamiento. </li><li> Mediante el uso de tijeras micro-disección, corte la cabeza y la cola de los filetes y mantener su superficie interna hacia arriba. </li><li> preparar THe diapositiva de montaje envolviendo alrededor de tres tiras de cinta de celulosa en cada lado de un portaobjetos limpio a una distancia de aproximadamente 1 cm entre sí. Una vez que el cubreobjetos se coloca en la parte superior de las dos tiras, una brecha se generará que evitar el aplanamiento de las muestras. Esto es crucial si las representaciones de volumen tridimensionales de las estructuras deben ser hechos. </li><li> Ponga una pequeña gota de aproximadamente 20 l de medio de montaje en el medio de la corredera de montaje entre las tres tiras de cinta de celulosa. </li><li> Después de la difusión del medio de montaje con pinzas limpias, arrastrar las larvas diseccionado a la diapositiva de montaje en el medio de montaje, manteniendo la superficie interna hacia arriba. Trate de montar en filas de cuatro o cinco. </li><li> deje caer suavemente una hoja de la cubierta en la parte superior de la corredera de montaje y asegurarse de que no se generan burbujas de aire. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente. Deje que las muestras se sequen durante al menos 10 minutos antes de la proyección de imagen. </li></ol> 5. Configuración Confocal de Imagen Nota: Las imágenes que se presentan en este estudio se tomaron usando una unidad confocal Nikon A1R integrados en un Ti: E microscopio invertido. Sin embargo, cualquier microscopio confocal con un mínimo de unidades 3 de láser disponibles en las regiones de longitud de onda de 488 nm, 561 nm y 642 nm y un sistema de detección 3 de canal es adecuado para este propósito. <ol><li> Encender el detector de rayos láser, unidad, bulbo de mercurio, el controlador etapa, microscopio y el PC. Iniciar el software de control y asegurar la diapositiva en el soporte de la platina. </li><li> Para hacer más rápida de imágenes, seleccionar y marcar todas las regiones de interés (ROI) en la muestra utilizando un objetivo 20X. </li><li> Con cuidado, gire la pieza de nariz a la lente objetivo 60X mayor aumento (60X Plan de Apo VC / NA 1,4 ACEITE). </li><li> Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la lente objetiva y seleccione una de las ROI marcada desde la ventana de visión general XYZ en el equipo. </li><li> Comience de imágenes que utiliza las siguientes configuraciones ópticas: Seleccione el primer espejo dicroico: 405/488/561/640. Seleccione 488 nm láser con filtro de emisión de 525/50 nm en el canal 1, 561 nm láser con filtro de emisión de 595/50 en el canal 2 y el láser de 642 nm con filtro de paso largo de 650 nm en el canal 3. </li><li> Utilice los siguientes parámetros de escaneo antes de iniciar la adquisición de imágenes: Seleccionar escáner Galvano; dirección de exploración: una forma; Velocidad de escaneado: 0,5 cuadros por segundo. </li><li> Seleccione la serie de canales para evitar canal de derrame. </li><li> Ajustar el tamaño del agujero de alfiler a 1 unidad aireado. Escanear y ajustar la potencia del láser, el aumento de la detección y compensar adecuadamente para cada canal para evitar la saturación de píxeles y nivel de fondo. </li><li> Adquirir z-pilas utilizando voxel tamaño de 0,2 x 0,2 x 0,5 m 3 para todas las regiones de interés y los preparativos de diapositivas. Si las imágenes van a ser sometidos a deconvolución a continuación, establecer el tamaño del voxel a 0,06 x 0,06 x 0,15 m 3. </li><li> Guardar imágenes en formato de formato de archivo o .ics .nd2. </li></ol> 6. Cálculo de la distancia entre núcleos dentro estriado60; Músculos por el método del Análisis de vecinos más próximos <ol><li> Para este análisis, utilizar confocal de imágenes que muestran los músculos del cuerpo de pared larvas teñidas con anticuerpos DVAP para visualizar los músculos y con anticuerpos lamina y un marcador nuclear para resaltar los núcleos. </li><li> Para estimar la distancia más cercana entre los núcleos, utilizar Puntos de medición dentro del módulo MeasurementPro del software de análisis de imágenes (por ejemplo, Imaris). Otras aplicaciones de software similares para el análisis de imagen se puede utilizar para los mismos fines. </li><li> Abrir las imágenes confocal. Para iniciar, haga doble clic en el icono del software. Arrastrar y soltar las imágenes confocal z-stack en la Arena. </li><li> Haga doble clic en las imágenes para abrir automáticamente en la vista de superar, bajo el icono de la barra de herramientas del menú <img alt="imagen 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821img1.jpg" /> . La vista Superar tiene tres paneles principales del espacio de trabajo: Área, Mostrar objeto y el objeto Propiedades del área. </li><li> Crear un volumen prestado tRes de imagen del canal haciendo clic en el icono del menú Vista 3D <img alt="imagen 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821img2.jpg" /> . </li><li> Haga clic en el icono Agregar nuevo Puntos de Medición <img alt="imagen 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821img3.jpg" /> desde el Objetos barra de herramientas y siga el asistente de creación de objetos que aparece en Propiedades del área. </li><li> Desde el asistente de creación de seleccionar la pestaña Editar primero y luego el canal específico. Seleccione el marcador nuclear o el canal de lamina para resaltar los núcleos. </li><li> Mueve el puntero al modo Seleccionar pulsando la pestaña Esc en el teclado. </li><li> Ajustar el tamaño de la caja del cursor 3D con la rueda del ratón para contener un núcleo dado en la imagen. Añadir un punto de medición manteniendo pulsada la tecla Shift y haga clic izquierdo del ratón sobre el mismo núcleo. </li><li> Añadir el segundo punto en un núcleo cercanas en el mismo músculo mediante la repetición de los pasos anteriores. Se traza una línea automáticamente entre los dos puntos y la distancia medida entre<html> se muestran los dos núcleos. La distancia entre los dos núcleos se registra ahora como una variable estadística en el objeto Propiedades del área bajo la etiqueta de datos Estadísticas&gt; detallada&gt; Distancia. </li><li> Repetir el procedimiento de los pasos 6.6 a 6.10 para todos los núcleos que rodean un núcleo dado. </li><li> De Estadísticas&gt; Datos detallada&gt; Distancia mostrando todos los puntos de medición recogidos, seleccione la distancia más corta. </li><li> Al hacer clic en las estadísticas de exportación en la ficha Pantalla a Archivo <img alt="imagen 4" src="/files/ftp_upload/53821/53821img4.jpg" /> disponible con el objeto Propiedades del área, los datos se guardarán en una hoja de cálculo. </li><li> Repita el mismo procedimiento para los otros núcleos circundantes y para un número seleccionado de las fibras musculares por genotipo. </li><li> Utilizando los datos exportados a un archivo de hoja de cálculo, calcular la distancia más corta media (D ave) para todo el número M de los músculos utilizando la siguiente ecuación: OAD / 53821 / 53821eq1.jpg &quot;/&gt; Di es la distancia más corta al núcleo vecino para un núcleo dado i, donde i varía de 0 a N y N es el número de núcleos analizados por músculo. La suma de los valores de j = 0 para j = m indica el número M de los músculos analizados. </li><li> Como alternativa, utilice Asistente de creación de manchas y manchas de manchas Distancia mínima para estimar la distancia media al núcleo vecina más cercana. Para esto, se necesita un módulo de extensión de Matlab. <ol><li> Haga doble clic en una imagen específica en la imagen 3D de un volumen Arena y se mostrará en el área de visualización. Haga clic en el icono de creación de objetos y añadir nuevos puntos <img alt="imagen 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821img5.jpg" /> Objetos de la barra de herramientas. </li><li> Desde el asistente de creación de objetos en el Área de propiedades, haga clic en la opción de omitir la creación automática, editar manualmente. </li><li> Seleccione la lamina o canal marcador nuclear para mostrar los núcleos. </li><li> Cambiar y haga clic en lefbotón del ratón t en todos los núcleos de un músculo específico en la imagen. Aparecerá un punto en cada núcleo. </li><li> Seleccione los puntos a los puntos distancia más cercana que aparece en la pestaña Herramientas en el objeto Propiedades del área. Seleccione Estadísticas Spots bajo el modo de resultado y una ventana aparece Matlab. </li><li> En la pestaña Estadísticas, seleccione valores detallados a continuación específicos. Haga clic en el Distmin y aparecerán los valores de las distancias mínimas para cada núcleo. </li><li> Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo y calcular el promedio de estas distancias por músculo. Repita el procedimiento para todos los músculos de un cierto genotipo. </li></ol></li></ol> 7. Determinación de la forma de los núcleos dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila <ol><li> Para este análisis, utilizar imágenes confocal de los músculos del cuerpo de paredes manchadas de lamina y un marcador nuclear para visualizar los núcleos. </li><li> Para evaluar la forma de mionúcleos, medida esfericidad (definido como la relación entre el surárea de la cara de una esfera con el mismo volumen que el núcleo dado, a la superficie del núcleo) o elipticidad (distingue entre elipsoides alargados achatados / y esferoides). </li><li> Abra la imagen como se describe anteriormente. Haga clic en el icono de la barra de herramientas Objetos Añadir nuevas superficies <img alt="imagen 6" src="/files/ftp_upload/53821/53821img6.jpg" /> . </li><li> En el asistente de creación que aparece en el objeto Área de propiedades, seleccione el marcador tinción nuclear como el Canal de la Fuente para mostrar los núcleos. </li><li> Establecer la opción de intensidad absoluta como el umbral. Asegúrese de que la mayor parte de los núcleos muestran una representación suave y no sobrecargado cambiando el valor de la curva de umbral. Al mismo tiempo, evitar la presencia de agujeros o máscara incompleta a cualquier núcleo utilizando la misma curva. </li><li> Utilizar el herramienta de filtro para excluir cualquier ruido en la prestación superficie. En la pestaña Editar de la capa superficial de nueva creación, división o fusión de los núcleos de las superficies que están incorrectamente rendered. </li><li> Exportar a una hoja de cálculo presentar los valores de elipticidad y la esfericidad de la superficie mostrada núcleos que están disponibles en la pestaña Estadísticas. </li><li> Alternativamente, utilizar el software ImageJ o Fiji para medir la circularidad de los núcleos donde la circularidad (C) se define como C <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq2.jpg" /> . Un valor de uno representa un círculo perfecto, mientras que un valor cercano a cero indica una forma cada vez más alargada. </li><li> Crear proyecciones de máxima intensidad de las pilas z de menú Imágenes&gt; Pilas&gt; Proyecto Z. Ajuste del tipo de proyección de máxima intensidad. </li><li> Dividir los canales y seleccione el canal marcador nuclear. </li><li> En el menú principal, seleccione Imagen&gt; Ajuste&gt; Umbral. </li><li> Segmento de los núcleos mediante el ajuste de la intensidad umbral. Si los núcleos cercanos están segmentados como una sola unidad, haga clic en Proceso&gt; Binary&gt; herramienta de cuencas para desconectar los núcleos. </li><li> En el menú principal, seleccione Editar&gt; Selecciones&gt; Crear selección. </li><li> Añadir todas las regiones de interés seleccionadas en el Administrador de retorno de la inversión haciendo clic en el menú Análisis&gt; Herramientas&gt; Administrador de retorno de la inversión. En la ventana del Administrador de ROI haga clic en Agregar. Dentro de la misma ventana seleccione Más&gt; Split. </li><li> Seleccionar en descriptores de forma Analizar&gt; mediciones indicadas. En la ventana del Administrador de retorno de la inversión clic en la pestaña Medida. Esto mostrará una lista de valores de circularidad de todos los núcleos seleccionados. </li><li> Además, para medir el volumen nuclear, sigue asistente de creación de superficie usando el canal marcador tinción nuclear tal como se describe en las subsecciones 7.3-7.7. </li></ol> 8. Volumen Renders 3D de núcleos seleccionados dentro de los músculos del cuerpo de pared de larvas de Drosophila para evaluar la Intranucleares La localización de una proteína específica <ol><li> Use imágenes confocal de informes músculos de la pared corporal teñidas con un marcador nuclear y con anticuerpos específicos para lamina y DVAP. </li><li> Abrir las imágenes al iniciar el software y select el núcleo específico a analizar. Esto se puede hacer seleccionando el principal elemento de menú Editar&gt; Recortar 3D. </li><li> Siga asistente de creación de superficie utilizando el canal de lamina tal como se describe en el apartado 7.3 a 7.7. </li><li> Una vez creada la superficie, haga clic en Editar en la objetos Propiedades del área y luego seleccione Máscara todo para aislar la señal en el interior del núcleo. Esto crea una nueva ventana. </li><li> Seleccione la señal de DVAP en el menú desplegable de selección de canal. Seleccione la señal de inmuno-reactividad DVAP el interior del núcleo haciendo clic en la opción set vóxeles fuera de la superficie a cero. Un nuevo canal enmascarado se crea y está disponible en la ventana de ajuste de visualización de la selección. </li><li> Para visualizar la presencia de la señal dentro del núcleo crear un plano de contorno haciendo clic en el icono Agregar nuevo plano delimitador <img alt="imagen 7" src="/files/ftp_upload/53821/53821img7.jpg" /> Objetos de la barra de herramientas. </li><li> Interactiva ajustar el ángulo del recorteavión y su posición para visualizar la distribución de la señal en el interior del núcleo. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+nesprin-1+produces+an+Emery+Dreifuss+muscular+dystrophy-like+phenotype+in+mice.">Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice.</a> Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).</li><li>Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+positioning+the+cell+nucleus+in+vertebrate+photoreceptors.">Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En el pasado, las variaciones morfológicas dentro y entre los grupos experimentales se rara vez se toman en cuenta. Sin embargo, la aplicación de métodos cuantitativos se está convirtiendo en la norma en los estudios comparativos de la morfología y la descripción matemática de las formas anatómicas se calculan. El uso de análisis cuantitativos en la evaluación de los efectos de las manipulaciones genéticas en los procesos celulares específicos, mantener la promesa en la mejora de nuestra capacidad para detectar cambios morfológicos y en la mejora de la precisión con que se describen estos cambios. Por otra parte, el análisis estadístico de los datos cuantitativos nos permite evaluar si las diferencias observadas entre los fenotipos son significativos. En músculos estriados, los núcleos exhiben una estructura redondeada distinto y se distribuyen uniformemente a lo largo de la fibra muscular. Aunque no se conocen los mecanismos moleculares para establecer y mantener el tamaño, la forma y la arquitectura de núcleos, estas características nucleares es probable tO jugar un papel fundamental en el control de la función muscular. De hecho, varios miopatías son causados ​​por mutaciones en los genes que regulan la morfología y la posición de los núcleos dentro de los músculos. La importancia funcional de forma y la distribución de los núcleos dentro de una célula no se limita a los músculos. La acumulación de pruebas muestra que los defectos nucleares también están asociados con enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson 18,24. Además, estamos empezando a apreciar que la morfología, tamaño y distribución intracelular de otros orgánulos incluyendo retículo endoplasmático y las mitocondrias pueden tener consecuencias funcionales. Por ejemplo, las alteraciones en la morfología mitocondrial se asocian con trastornos neurológicos tales como el tipo-1 atrofia óptica (OPA1) y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A neuropatía 25. Para ayudar en el proceso de aclaración de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos importantes, proponemos combinar alta resolución confocallos datos con el software de formación de imágenes y análisis morfométricos para evaluar cuantitativamente cómo las manipulaciones genéticas pueden afectar a la forma, tamaño y ubicación de los núcleos dentro de las fibras musculares. La potencia y la versatilidad de la genética de Drosophila junto con la naturaleza altamente estereotipada del sistema neuromuscular en larvas de Drosophila hacen que el larval NMJ un modelo experimental particularmente adecuada para este tipo de análisis. En los NMJs larvas, el análisis fenotípico se puede realizar en una sola resolución sinapsis permitiendo un análisis morfométrico precisa donde un número de NMJs puede ser estudiada dentro de la misma mosca e incluso el mismo identificable NMJ puede compararse entre las moscas de diferentes genotipos 3,4. Caracterización fenotípica de la posición nuclear, forma y tamaño en la Drosophila larval NMJ inicia mediante la realización de la inmunotinción de NMJs disecados con anticuerpos que ponen de relieve los músculos y los núcleos dentro de los músculos. En el protocolo descrito en la this papel, mionúcleos se tiñeron con anticuerpos policlonales contra la lamina, un marcador de la envoltura nuclear, con un marcador nuclear destacando los interiores y con anticuerpos nucleares específicos para DVAP para teñir todo el músculo. Los anticuerpos Lamin utilizados en estos experimentos fueron amablemente proporcionados por Paul Fisher 19-22 pero fuentes alternativas de anticuerpos anti-lamina se pueden utilizar. Además, una serie de otros anticuerpos específicos para la envoltura nuclear están disponibles comercialmente. Finalmente, los marcadores nucleares, como DAPI y yoduro de propidio, también están disponibles mientras que los músculos se podrían visualizaron por tinción con anticuerpos anti-actina o anti-tubulina. Si se emplean anticuerpos distintos de los utilizados en este procedimiento experimental, el protocolo de inmunotinción requerirá extra-pasos en los que tendrán que ser optimizado las condiciones de fijación y las concentraciones de trabajo de los nuevos anticuerpos. Un paso crítico en este protocolo, sobre todo cuando las representaciones de volumen deben ser analizados, es THe de montaje de las muestras en la diapositiva. En este caso, es importante incluir separadores entre el portaobjetos y el cubreobjetos de modo que los especímenes no queden aplastados. Tres bandas de la cinta de celulosa envuelto alrededor de la corredera en ambos lados del cubreobjetos representan una manera fácil de hacer espaciadores. Mientras ImageJ se utiliza para imágenes en 2D, la mayor parte de la imagen multi-canal 3D del análisis expuestos en este documento, se hace mediante el uso Imaris debido a su disponibilidad en el local. Sin embargo, cualquier otro paquete de software comercial similar se puede utilizar para estas aplicaciones. Hay varios de código abierto (por ejemplo, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, helado, KNIME y otros) y plataformas de software comercial disponible para el análisis de imágenes confocal. ImageJ 26, el software gratuito de los NIH o su versión más mejorada, conocida como Fiji 27, tiene un gran número de filtros de importación, macros y plugins disponibles para la comu de imágenes en todo el mundoTy. La mayoría de estos plugins se centran en el procesamiento de la información de una manera rebanada rebanada por caso. También hay plugins disponibles para la visualización y análisis de imágenes en 3D multicanal. Sin embargo, a menudo están diseñados para una tarea específica y los usuarios pueden necesitar extender o adaptar estas extensiones para sus propias necesidades. Por otro lado, las plataformas comerciales se dirigen a los usuarios con poca experiencia y con frecuencia se centran en, una amplia cobertura facilidad-a-uso de las tareas de procesamiento de imágenes con una velocidad increíble. El procedimiento experimental junto con el análisis fenotípico cuantitativa se describe en este protocolo, puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la morfología orgánulo y su distribución dentro de una célula. Sin embargo, este enfoque tiene la limitación obvia de analizar estos procesos a un punto final específico. El proceso de control de la morfología y la distribución de los orgánulos es probable que sea muy dinámico y para variar no sólo entre diferentes ty célulapes sino también dentro de la misma celda en función del estado de desarrollo o fisiológico. Una implementación adicional de este análisis estaría representada por la imagen de lapso de tiempo que permite cambios en la morfología orgánulo y la posición a ser monitorizados con el tiempo.

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations. 
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems. 
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1. 
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Micro-Forceps 0.3x0.25 mm</td>
			<td style="width:187px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11030-12</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;">Sylgard dissection plates&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>76103</td>
			<td style="width:187px;">Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60&#186;C for at least 24 hours</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:187px;">Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Microdissection scissors (ultra-fine)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:187px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:187px;">Bouin&#39;s Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:187px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Triton-X100. SIGMA-T8787</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:187px;">Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:187px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:187px;">Guinea Pig anti-DVAP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:187px;">123-065-021</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:187px;">Rabbit anti-Lamin antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:187px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:187px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:187px;">Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>bs-295G-A555-BSS</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:187px;">Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>bs-0358G-Cy3-BSS</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:187px;">Vectashield mounting medium for fluorescence</td>
			<td style="width:187px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:187px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

why quantification matters: characterization of phenotypes at the drosophila larval neuromuscular junction

La mayoría de los estudios sobre la morfogénesis se basan en descripciones cualitativas de cómo los rasgos anatómicos se ven afectados por la interrupción de genes específicos y vías genéticas. descripciones cuantitativas se realiza con poca frecuencia, a pesar de las manipulaciones genéticas producen una serie de efectos fenotípicos y se observan variaciones incluso entre los individuos dentro de los grupos de control. Nuevas pruebas muestra que la morfología, tamaño y ubicación de los orgánulos desempeñan un papel previamente underappreciated, sin embargo, fundamental en la función celular y la supervivencia. Aquí nos proporcionan instrucciones paso a paso para realizar análisis cuantitativos de los fenotipos en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila (UNM). Utilizamos varios marcadores inmunohistoquímicos fiables combinados con técnicas bio-de formación de imágenes y análisis morfométricos para examinar los efectos de las mutaciones genéticas en los procesos celulares específicos. En particular, nos centramos en el análisis cuantitativo de los fenotipos que afecta a la morfología, el tamaño y la posición de nuclei dentro de los músculos estriados de las larvas de Drosophila. La Drosophila larval NMJ es un modelo experimental útil para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la estructura y la función del sistema neuromuscular, tanto en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las metodologías que describimos aquí se pueden extender a otros sistemas también.

La ELA es una enfermedad degenerativa que afecta específicamente las neuronas motoras que conducen a una parálisis progresiva y fatal de los músculos estriados 7. Mutaciones sin sentido en el VAMP-proteína asociada B (hVAPB) causan una serie de enfermedades de las neuronas motoras, incluyendo la ELA 8 Tipo de 8-12. Una mutación de sentido erróneo (V234I) en el gen hVAPB ha sido identificada recientemente en un caso de ALS típicos en humanos 13. Para evaluar su potencial patógeno, generamos moscas transgénicas que expresan el hVAPB Drosophila orthologue DVAP que porta la mutación causante de la enfermedad (DVAP-V260I). La expresión de este transgén fue dirigida a los músculos que utilizan el sistema UAS / GAL4 y el músculo específica controlador BG57-Gal4 14,15. El efecto de DVAP-V260I expresión transgénica fue comparado y contrastado con el de otros dos transgenes (DVAP-WT1 y DVAP-WT2), que expresan diferentes niveles de la proteína de tipo salvaje DVAP 16. More específicamente, el aumento de la inmunorreactividad DVAP es 2,2 veces mayor que en los controles para la línea DVAP-WT2 mientras que los niveles DVAP-V260I y DVAP-WT1 exposición comparables e inferior de la misma señal 16. Alteraciones nucleares se han asociado con el envejecimiento y varias enfermedades neurodegenerativas incluyendo la enfermedad de Parkinson 17,18. Para evaluar si nuestro modelo de mosca de ELA8 exhibe cambios en la arquitectura, la posición y el tamaño nuclear, teñidas núcleos dentro de los músculos estriados de genotipos apropiados con un marcador nuclear y el anticuerpo anti-lamina 19-22, que visualiza la envoltura nuclear. Para resaltar los músculos, un anticuerpo de DVAP específico también se añadió a las mismas muestras (Figura 1). Las imágenes confocales se recogieron y análisis detallados morfométricos se realizaron usando un software de análisis de imágenes. En los músculos de control, se encontraron núcleos estarán distribuidos uniformemente a lo largo del músculofibras mientras que en DVAP-V260I y DVAP-WT expresar los músculos, los núcleos exhiben una tendencia a redistribuir en grupos estrechamente asociados (Figura 1). Se realizó un análisis del vecino más cercano para realizar una evaluación cuantitativa de la distribución de los núcleos a lo largo de las fibras musculares de cada genotipo. Un análisis de vecino más cercano identifica primero el vecino más cercano para cada núcleo mediante la medición de la distancia entre el centro de un núcleo dado y el centro de cada otro núcleo circundante. Este procedimiento se repite entonces para cada otros núcleos a lo largo de la fibra muscular. Por último, la distancia más corta entre los núcleos dentro de un músculo específico, se calcula promediando las distancias más cortas de cada núcleo y sus vecinos más cercanos. (Figura 2A - C). En comparación con los controles, los músculos que expresan bien el transgén DVAP-V260I o cualquiera de los transgenes que sobreexpresan la proteína de tipo salvaje, Presentar una dramática reducción en la distancia más corta media entre los núcleos y, como consecuencia, los núcleos parecen estar estrechamente asociado en racimos. El efecto de la ALS causando alelo DVAP-V260I es más severo que el asociado con la sobreexpresión de la proteína de tipo salvaje, aunque el más fuerte transgén DVAP-WT2 se utiliza (Figura 1 y la Figura 2D). La sobreexpresión de cualquiera de DVAP-V260I o DVAP-WT transgenes también exhibe un grave deterioro de la arquitectura nuclear que resulta en núcleos deformados con una estructura alargada (Figura 1). Esta aberración estructural se cuantificó utilizando el software ImageJ en el que la circularidad se define por la fórmula C <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> , Que miden la relación de anchura a longitud de cada núcleo con C = 1 representa un círculo perfecto y C = 0 un polígono infinitamente alargado. en contrnúcleos ol que presentan una forma redonda distinta, C es igual a 1, mientras que en los mutantes transgénicos un cambio en la forma con la consiguiente pérdida de la circularidad, causa una desviación significativa de este valor (Figura 1 y la Figura 3). También se encontró que en los músculos que expresan los mismos transgenes, los núcleos muestran un volumen nuclear ampliada marcado comparación con los controles, aunque el alelo que causa ALS parece ser más eficaz en la inducción de este fenotipo en comparación con los transgenes DVAP-WT (Figura 4). Casi todas las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la acumulación intracelular de los agregados que contienen la proteína patógena. Hicimos reconstrucciones 3D y renders de volumen de los núcleos y se encontró que en los músculos que expresan el transgén mutante o sobreexpresan la proteína de tipo salvaje, DVAP inmuno-reactividad de los grupos A formadoEncontramos que algunos de ellos también fueron localizados en el núcleo (Figura 5). Por el contrario, en NMJs de control, DVAP inmuno-reactividad se dispersa ligeramente a lo largo de la fibra muscular y se excluye del núcleo 16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> . Figura 1: Confocal imágenes de mionúcleos dentro de los músculos estriados que expresan bien el los transgenes DVAP-260I DVAP-WT o (A) BG57-Gal4 / + control, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 y (D) BG57; músculos DVAP-ET2 que expresan los transgenes indicados se tiñeron con anticuerpos específicos para DVAP (señal roja), lamin (señal verde) y con un marcador específico nuclear para visualizar los núcleos (señal azul). Barra de escala = 30 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una</a>versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> Figura 2: análisis de vecino más cercano para determinar la distancia media entre un núcleo y su único vecino más cercano (B) Los resultados representativos que muestran alteración de posicionamiento nuclear en los músculos que sobreexpresan el transgén DVAP-WT2 en comparación con los controles en (A).. La distancia promedio nuclear en los músculos de los genotipos indicados se calculó utilizando la fórmula de (C) y se reportan los datos en (D). NMJs larvas se tiñeron con anticuerpos específicos para DVAP (señal roja), lamina (verde) y con un marcador nuclear (señal azul). Los asteriscos denotan significación estadística. *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Para el análisis estadístico de este experimento y se utilizó todos los experimentos descritos a continuación una prueba de ANOVA de una vía y multípara de Tukeyprueba de comparación le fue aplicado como una prueba post-hoc cuando se encontraron diferencias entre los genotipos de ser significativa por la prueba de ANOVA. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> Figura 3:. Imágenes que muestran las etapas de representación en el cálculo del volumen nuclear (A) Una imagen representativa que muestra núcleos segmentados utilizando el asistente de creación de superficie. Los núcleos fueron ignoradas en la frontera de las imágenes. (B) Imagen que muestra la señal de DVAP nuclear después de la tinción DVAP rodea ha sido enmascarado por el uso de la superficie creada en el canal marcador nuclear. (C) La capa superficial proporciona información de parámetros adicionalesincluyendo el volumen nuclear y la esfericidad. (D) Los datos sobre volumen nuclear de diversos genotipos. Los asteriscos denotan significación estadística. NMJs disecados fueron teñidas con anticuerpos anti-DVAP (señal roja), anticuerpos anti-lamina (señal verde) y un marcador nuclear (señal azul). *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> Figura 4: Imágenes que muestra las etapas de representación en la estimación de la forma nuclear mediante ImageJ. &#160;&#160; proyección de intensidad máxima de las imágenes se analizaron usando ImageJ para estimar la circularidad de los núcleos dentro de los músculos. (A) Un ejemplo representativo de la proyección de intensidadde la imagen de tres canales como en la etapa 7.9 del protocolo. Se selecciona (B) Imagen que muestra el paso 7.10 del protocolo en el que se separan los canales y el canal marcador nuclear. (C) Un representante imagen que muestra que después de la aplicación de umbral de intensidad para segmentar los núcleos y gestor de ROI Plugin en ImageJ, todos los núcleos de interés pueden ser seleccionados y su forma miden a través de descriptores de forma (pasos 7.11 a 7.15). (D) La cuantificación de la circularidad de diversos genotipos. En los NMJs larvales, la señal roja indica tinción DVAP mientras que el verde se describen núcleos y corresponde a la tinción lamina. El interior de cada núcleo con el azul debido a la tinción con un marcador nuclear. Los asteriscos denotan significación estadística. *** P &lt;0,001, ** P &lt;0,01. Las barras de error representan SEM. Barra de escala = 30 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic en ella</a>e para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> Figura 5: Imágenes que muestran los pasos específicos en la creación de representaciones de volumen de mionúcleos. (A) Imagen que muestra la intensidad 3D mezcló vista de los músculos teñidas con proteínas DVAP (rojo), la lamina (verde) y el marcador de ADN (azul). (B) Imagen que representa una capa superficial generada por el uso del canal de lamina para segmentar los núcleos. (C) Imagen que representa un núcleo en el que la capa superficial se ha usado para enmascarar la señal de DVAP fuera del núcleo seleccionado. Resaltado en amarillo es un plano de recorte que se ha añadido a la imagen. Su ángulo de visión y la posición se puede ajustar de forma interactiva para visualizar la distribución de la señal en el interior del núcleo. (D) Una imagen de informes una vista en sección transversal de la USI capa superficial nuclear creadong el canal lamina se fusionó con señales de marcadores nucleares y DVAP desenmascarado. (E y F) representaciones seccionadas de volumen adicionales del mismo núcleo. Barra de escala = 10 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

8.1K vistas.  University of Edinburgh. Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques. 

Video: Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...