Agradecemos al Dr. Nael Alami y el Dr. Nam Chul Kim por sus útiles comentarios sobre este manuscrito.

1. Preparación para la inmunofluorescencia: <ol><li> Para crear una superficie de disección, vierta Sylgard 184 Base de elastómero de silicona en una placa de cultivo de tejidos pequeños. Asegúrese de no llenar completamente la placa para que el área de disección es menor que la llanta. </li><li> Trim pines disección de una longitud aproximada de 3,5 mm para una mayor facilidad de manipulación, y asegúrese de tener al menos 6 pines por larva. </li><li> Usted necesitará unas pinzas contundente que le permitirá a usted comprender los pines para la disección. </li></ol> 2. La disección de las larvas: <ol><li> Seleccione vagando larvas de tercer estadio que se están arrastrando a los lados del vial y no han comenzado a convertir en ninfas. </li><li> Colocar una larva en la superficie de la disección bajo un microscopio estereoscópico. Evacuación de la húmeda el exceso de uso de un Kimwipe. </li><li> Organizar cada larva por lo que la parte dorsal hacia arriba. Usted será capaz de ver dos tráquea, líneas blancas a lo largo de la cara dorsal de las larvas. Trate de centrar estas en el medio tanto como sea posible, porque esto marca la línea media dorsal. </li><li> Colocar el pin # 1 justo por encima de los ganchos de la boca (Figura 1). </li><li> Colocar el pin # 2 en la cola justo por encima de los espiráculos entre las tráqueas. </li><li> Agregue una pequeña cantidad de PBS a las larvas para evitar la desecación de la cutícula. </li><li> Repita los pasos anteriores con todas las larvas, asegurándose de que los genotipos están separados espacialmente mediante la colocación de un alfiler entre cada genotipo. </li><li> Gire a la derecha pequeño corte transversal sobre el pin # 2 a través de ambas tráqueas (Figura 1). </li><li> Inserte sus tijeras en el primer corte y corte a lo largo de la línea media dorsal entre la tráquea hasta el final hasta pasados ​​pin # 1. </li><li> Usted tendrá que hacer otros pequeños cortes en la parte inferior y superior de cada lado de la cutícula, por lo que la izquierda ya la derecha se abrirá lo que le permite precisar sin tirar de la cutícula. </li><li> Colocar el pin # &#39;s 3, 4, 5 y 6 en cada esquina. </li><li> Fijar la muestra con 4% PFA durante 20-25 minutos a temperatura ambiente </li><li> Decantar la PFA y enjuague con PBS 3.4 veces, la decantación cada vez. </li></ol> 3. Extracción de tejido: <ol><li> Comience por quitar los tejidos en el extremo posterior, porque por lo general quiere proteger la zona donde se encuentra el cerebro. </li><li> Mientras se utiliza un steromicroscope y con las larvas en una gota de PBS, en primer lugar tomar el extremo posterior de una de la tráquea y tire de ella que puede eliminar algunas de las grasas de cuerpo con él. Repita el procedimiento para la tráquea segundos. </li><li> Coge un poco de la parte posterior del cuerpo la grasa o el intestino y sacarlos de la preparación. Una vez que la mayoría de los tejidos posterior se ha eliminado, se centran en la eliminación de los tejidos que rodean el cerebro pequeño. Si usted está interesado sólo en los músculos, o la morfología de la UNM se puede quitar el cerebro. </li><li> Extracción del cerebro que permite una mejor visualización del músculo 31, que es un marcador útil para la orientación del segmento abdominal. </li></ol> 4. Inmunofluorescencia para zonas activas: <ol><li> Añadir agente de bloqueo (5% suero normal de cabra en PBS) a las preparaciones de disección en el plato de la disección. Bloque durante 1 hora a temperatura ambiente. Si usted desea hacer una única solución para el bloqueo y las diluciones de anticuerpos, son un 0,1% TritonX-100 a su agente de bloqueo para la permeabilización de los tejidos. </li><li> Aplicar el anticuerpo primario diluido en el bloqueo de reactivo con el 0,1% TritonX-100. El anticuerpo zona activa es alcanzable a través del desarrollo Estudios del Banco hibridoma (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). El uso de un anticuerpo de referencia (por ejemplo, peroxidasa de rábano-Cy3 conjugada) para marcar la membrana MNJ y los axones. </li><li> Incubar los anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Así que la sequedad de la nevera no se evapora la solución de anticuerpos, crear una cámara de humedad, poniendo un poco de agua en el fondo de una caja de pipeta utilizada. Cubra la tapa transparente con papel de aluminio para reducir el fluorescente de blanqueo. Colocar la placa de disección en la cámara húmeda y poner toda la caja en la incubadora de 4 ° C durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente, lavar con PBST (PBS con 0,2% Triton-X-100) 5-10 veces durante 5-10 minutos cada uno. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario (por ejemplo, Invitrogen Alexa cabra anti-ratón-488) diluido en el bloqueo de reactivo con el 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente durante 2-4 horas en la cámara de humedad cubiertos. Incluyen una mancha nuclear (por ejemplo, DAPI) en el secundario, si desea identificar la ubicación de los núcleos en los músculos o el cerebro. </li><li> Lavar con PBST (PBS con 0,02% Triton-X-100) 5-10 veces durante 5-10 minutos cada uno. </li></ol> 5. Montaje de las muestras de las larvas de las diapositivas: <ol><li> Decantar y la mecha de la lava PBST pasado. </li><li> Pipeta de 80% de glicerol de aproximadamente 1 ml para cubrir las pieles inmovilizado larval. </li><li> Retire 5 de los 6 pines en todas las larvas. </li><li> Cuando esté listo para poner el primer genotipo en un portaobjetos de quitar el pasador de una duración de todas las larvas que genotype. </li><li> Prepare un &quot;lavado&quot; de diapositivas por poner dos gotas de su medio de montaje sobre un portaobjetos limpio. Este paso es importante lavar la solución de agua de las larvas para el montaje y la más clara imagen. </li><li> Agarra una larva por la cola con su pinza roma, arrastre la larva en todo en el glicerol y luego a lo largo de los bordes secos de su plato de disección, para eliminar la mayoría de los triglicéridos. Coloque las larvas en el descenso medio del primer montaje. </li><li> Repita el paso 6 para todas las larvas del mismo genotipo. </li><li> Una vez que todas las larvas se encuentran en el descenso medio del primer montaje, toma la larva en primer lugar por la cola y tire de ella a través de la caída y después a lo largo de los bordes del plato seco para eliminar la mayoría de los medios. A continuación, coloque las larvas en la caída de segundo medio de montaje. </li><li> Repita el paso 8 para todas las larvas con el mismo genotipo. </li><li> Prepare su última diapositiva, mediante el etiquetado y la colocación es una pequeña &quot;T&quot; de medio de montaje en la diapositiva. </li><li> Como en el paso 5.8, toma la larva por la cola, tire de la piel a través de la caída de segundo medio de montaje y luego a lo largo de los lados de la seca &quot;lavado&quot; de diapositivas. Después de que la mayoría de los medianos ha salido, colocar la piel de las larvas en la diapositiva final en el medio de montaje. </li><li> Repita para todas las pieles de las larvas. </li><li> Asegúrese de que todas las pieles de las larvas están dispuestas como se desee asegurarse de que el lado de la cutícula se ha reducido y el músculo está expuesto hacia arriba. </li><li> Coloque una hoja de cubierta de la diapositiva para cubrir las larvas disecadas, con el borde de partida en la línea superior de la &quot;T&quot; </li><li> Ponga un peso pequeño (por ejemplo, batería de 9 voltios) en la hoja de la cubierta, asegurándose de que el medio de montaje se extiende por completo bajo el cubreobjetos. </li><li> Para reducir el enfriamiento fluorescentes es posible, colocar la placa en un cajón o un espacio oscuro hasta el medio de montaje se ha curado. </li><li> Limpiar el medio de montaje que se desbordó el filo de la hoja de la cubierta. Limpie el exceso de medio de montaje en seco de la hoja de la cubierta o de diapositivas con etanol al 70%. </li><li> Para crear un sello final, sellado con esmalte de uñas. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Un ejemplo de diapositivas de las larvas de disección y immunostained se muestra en la Figura 2. Cuando la disección de las larvas, las manchas, y el montaje se hace correctamente, el usuario puede identificar el músculo larvas de interés (Figura 3) en los segmentos A2-A6. Hoang et al. Proporciona una descripción detallada de la posición de los músculos, así como la caracterización de determinados botones sinápticos (Hoang y Chiba, 2001). Utilizando un objetivo de alta potencia que el usuario pueda concentrarse en una sola sinapsis y tomar z-stack de la imagen. Un máximo representante de la imagen de proyección de una parte de la sinapsis 6.7 se muestra (Figura 4). Luego, utilizando el software de imágenes, las zonas activas pueden ser evaluados cuantitativamente para las características que son propias de su fenotipo mutante. Ejemplos de características que pueden estar alterados en un fenotipo mutante particular, la cantidad total, la intensidad de fluorescencia, y el espaciamiento entre las zonas activas. Errores potenciales: Evaluación de inmunofluorescencia de la unión neuromuscular larvaria es un valioso sistema que puede proporcionar información valiosa sobre la biología sináptica, aunque existen riesgos potenciales que pueden limitar la utilidad de este sistema. Por ejemplo, con frecuencia es conveniente para la imagen del patrón de tinción de dos o más anticuerpos primarios en la misma muestra. La elección apropiada de anticuerpos primarios, fluoróforos adecuados y apropiados controles negativos es esencial para el éxito. Si dos antígenos de imágenes en su experimento, asegúrese de que los anticuerpos primarios son de diferentes especies para que cada proteína de interés puede ser identificada con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Un método recomendado para reducir el fondo es el uso de un agente de bloqueo que contiene el suero normal de la especie de la que los anticuerpos secundarios se obtuvieron (por ejemplo, el uso de suero normal de cabra como un agente de bloqueo cuando se utiliza de cabra anti-conejo o anti-ratón secundaria de anticuerpos). Después de la planificación de los anticuerpos primarios y secundarios que va a utilizar en su experimento, también se debe considerar la inclusión de los controles de la tinción de conjuntos para asegurar que la señal fluorescente que está viendo es real y no sólo de fondo. A ser posible, muestras de control negativo que no contienen la proteína de interés. Esto se hace fácilmente en los estudios de la sobreexpresión de los transgenes exógenos mediante la inclusión de un animal silvestre, pero en algunos casos se puede lograr mediante el uso de un mutante homocigota de la proteína de interés. Otro control esencial negativo, útil para medir los niveles de fondo de la señal fluorescente, es utilizar el anticuerpo secundario, sin incluir las primarias. Cuando la imagen de su prepara resultante, es importante entender que todos los de la señal fluorescente que estamos viendo no puede ser real, y podría ser el fondo del your anticuerpos secundarios o de fondo del tejido endógeno. Es posible que necesite para normalizar las imágenes a considerar la fluorescencia de fondo cuando analizando los cambios entre la intensidad de la fluorescencia. Elección de fluoróforo también debe hacerse con cuidado. Consideración de la excitación y el espectro de emisión de cada fluoróforo y la capacidad de detectar de forma única cada señal es esencial para evitar sangrar a través de los canales. Si hay alguna duda, una forma sencilla de determinar si la extensión de la sangre a través de es inmunotinción con un único fluoróforo anticuerpo marcado a la vez y ver la imagen con cada canal que va a utilizar en el experimento final. Esto debe revelar si el sangrado se produce a través de su aparato de filtro microscopio. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama de flujo de cortar la cutícula y la colocación de los clavos 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Haga clic aquí para ver una imagen más grande</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Colocación de las larvas en la diapositiva final. Asegúrese de que las preparaciones de las larvas están expuestos los músculos laterales y laterales cutícula hacia abajo. Deje por lo menos un ancho de cuerpo de la larva en cada muestra. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cuando la imagen, localizar los músculos y los segmentos de interés. Común la unión neuromuscular caracterizado inervan los músculos de 6 / 7, 13 músculos, 12 músculos, o el músculo 4. En el lado opuesto de la línea media ventral, que es una imagen especular de la estructura muscular de la muestra hemi-segmento. Uso de los músculos 31 como un marcador para identificar a qué segmento está la imagen. Imagen de las mismas sinapsis y segmentos para el resto de sus muestras, recogiendo muchas imágenes sináptica por genotipo que puede ser utilizado para la cuantificación. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Una imagen de proyección máxima representante de una porción del músculo NMJ inervan 07.06 se muestra. NC82 (Bruchpilot) tinción se muestra en verde. HRP mancha pre-sináptica se muestra en rojo. Tenga en cuenta la punctae zona activa que puede ser cuantificados por el software de imágenes.

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Para las neuronas, la zona de la terminal sináptica es de vital importancia, y es el puente para la correcta comunicación entre el puesto y las células pre-sináptica. Una forma poderosa para investigar la salud de las neuronas en modelos de enfermedad es analizar las proteínas de la terminal sináptica por inmunofluorescencia. El método de inmunofluorescencia que aquí se presenta permite al investigador para examinar las larvas de manera simultánea al tiempo que limita las diferencias ambientales entre los grupo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base de silicona de elastómero </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Después de la mezcla permite que las burbujas se elevan lentamente por poner en los rotadores lentos o permitir que repose durante 30 minutos o más. </td></tr><tr><td> De acero inoxidable Minutien PIN </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26002-10 </td><td> Recorte de aprox. 3-4mm de longitud con tijeras regulares </td></tr><tr><td> Pinzas laminectomía (Blunt: se utiliza para agarrar pines) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11223-20 </td><td> Su uso como pinzas para agarrar contundente pines </td></tr><tr><td> Pinzas de disección </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Tijeras SuperFine, 8 cm de largo </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-BRP anticuerpos </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Utilice dilución 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 cabra AffiniPure anti-peroxidasa de rábano </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Uso en la dilución 1:200 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Uso aprox. Dilución 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

La Drosophila larvas de la unión neuromuscular (UNM) es un excelente modelo para el estudio de la estructura y la función sináptica. Drosophila es bien conocido por la facilidad de manipulación genética de gran alcance y el sistema nervioso de larvas ha demostrado ser particularmente útil para estudiar no sólo la función normal, sino también las perturbaciones que acompañan a algunas enfermedades neurológicas (Lloyd y Taylor, 2010). Muchas moléculas clave sináptica en Drosophila también se encuentran en los mamíferos y como la mayoría de las sinapsis excitadoras del SNC en los mamíferos, la Drosophila NMJ es glutamatérgica y demuestra dependiente de la actividad de remodelación (Koh et al., 2000). Además, las neuronas de Drosophila pueden ser identificados individualmente, porque sus patrones de inervación son estereotipados y repetitivos que permiten al estudio identificó las terminales sinápticas, como las que existen entre las neuronas motoras y las fibras musculares de la pared del cuerpo que inervan (Keshishian y Kim, 2004). La existencia de los componentes de la sinapsis conservado evolutivamente, junto con la facilidad de manipulación genética y física que el modelo de Drosophila ideal para investigar los mecanismos subyacentes a la función sináptica (Budnik, 1996). Las zonas activas en las terminales sinápticas son de particular interés debido a que estos son los sitios de liberación de neurotransmisores. NC82 es un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de Drosophila Bruchpilot (BRP), un miembro de la familia CAST1/ERC que es un componente importante de la zona activa (Wagh et al., 2006). BRP ha demostrado que la forma directa de la zona activa T-bar y es responsable de manera efectiva la agrupación Ca 2 + canales por debajo de la densidad de T-bar (Fouquet et al., 2009). Los mutantes de BRP han reducido la densidad de Ca 2 + canal, deprimido liberación evocada vesícula, y la alteración a corto plazo plasticidad (Kittel et al., 2006). Alteraciones en las zonas activas se han observado en modelos de enfermedad de Drosophila. Por ejemplo, la inmunofluorescencia con el anticuerpo NC82 mostraron que la densidad de la zona activa se redujo en los modelos de la esclerosis lateral amiotrófica y el síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Por lo tanto, la evaluación de las zonas activas, o de otras proteínas sinápticas, en los modelos de las larvas de Drosophila de la enfermedad pueden proporcionar una valiosa pista inicial a la presencia de un defecto sináptica. La preparación de todo el montaje disecados larvas de Drosophila para el análisis de inmunofluorescencia de la UNM requiere cierta habilidad, pero se puede lograr por la mayoría de los científicos con un poco de práctica. Que se presenta es un método que ofrece para las larvas de varios de ser diseccionado y immunostained en el plato de la disección mismo, lo que limita las diferencias ambientales entre cada genotipo y proveer suficientes animales para la confianza en la reproducibilidad y el análisis estadístico.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La unión neuromuscular (UNM) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Es un importante sistema modelo para estudiar la función sináptica normal, así como las perturbaciones de la función sináptica en ciertas enfermedades neurológicas. Se presenta un protocolo para la disección de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval del sistema motor y la inmunotinción de proteínas de la zona activa dentro de la UNM.

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K vistas.  St. Jude Children’s Research Hospital. La unión neuromuscular (UNM) de Drosophila melanogaster Es un importante sistema modelo para estudiar la función sináptica normal, así como las perturbaciones de la función sináptica en ciertas enfermedades neurológicas. Se presenta un protocolo para la disección de la Drosophila Larval del sistema motor y la inmunotinción de proteínas de la zona activa dentro de la UNM.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Solo Drosophila Omatidio disección e Imagen

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Investigación

Neurociencias

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...