El objetivo general de este procedimiento es demostrar los métodos de disección para la pierna adulta de Drosophila. Esta técnica elimina una porción de la cutícula, exponiendo el tejido subyacente de una manera que preserva la arquitectura neuronal y muscular. Este procedimiento nos permite caracterizar la unión neuromuscular para los cenadores de neuronas motoras identificados, utilizando técnicas químicas inmunocíticas estándar.
La disección es particularmente útil para el estudio de cambios degenerativos lentos que ocurren durante períodos de tiempo relativamente largos. El aspecto del tiempo es una consideración importante, porque la unión neuromuscular bien caracterizada de las larvas de Drosophila es estable durante aproximadamente cinco a siete días antes del inicio de la metamorfosis. Por el contrario, las neuronas adultas están presentes durante toda la vida de una mosca adulta, aproximadamente 90 días para un Drosophila melanogaster de tipo salvaje y criado en laboratorio.
La técnica es flexible y se puede aplicar a una variedad de genotipos para diferentes modelos de enfermedad, y utilizar una gama de anticuerpos disponibles para Drosophila como sistema modelo. El objetivo general de este procedimiento es demostrar los métodos de disección para la pierna adulta de Drosophila. Esta técnica elimina una porción de la cutícula, exponiendo el tejido subyacente de una manera que preserva la arquitectura neuronal y muscular.
Con un pincel, transfiera las moscas al metanol frío en un pozo de vidrio o plato durante aproximadamente 30 segundos a un minuto. El metanol solubiliza los hidrocarburos cuticulares, y las moscas ahora pueden sumergirse en lugar de flotar en soluciones acuosas. Con fórceps, transfiera cuidadosamente las moscas a PBS.
Enjuague tres veces en PBS helado para eliminar el exceso de metanol y mantenga las moscas en PBS en hielo hasta la disección y fijación. En este punto, las moscas deben ser diseccionadas y fijadas en el menor tiempo posible, preferiblemente menos de 30 minutos. Transfiera las moscas a un plato de disección de elastómero de silicona lleno de PBS frío.
Retire las piernas metatorácicas en la coxa usando dos pares de pinzas Dumont número cinco, o corte las piernas con tijeras Vannas. Transfiera las patas a un pozo en una placa de plástico de 24 pocillos llena de una mil de PBS, y mantenga la placa en hielo hasta que todas las patas se retiren y se transfieran a los pozos. Normalmente usamos 20 patas por pozo.
Reemplace la solución de PBS con una solución de FA de mililitros y gire sobre un nutator durante 30 minutos. El ajuste del nutator debe ajustarse a una velocidad media. Asegúrese de que las piernas estén completamente sumergidas en la solución durante este tiempo.
Para eliminar la solución de FA, lave en un mil PBS tres veces rápidamente, seguido de tres lavados adicionales durante cinco minutos cada uno en un mil PBS. Mantenga los tejidos en un mil PBS en hielo, antes y durante los pasos de disección. Para proporcionar una breve descripción de la anatomía de la pierna de Drosophila, se indican los segmentos de las piernas, incluidos la coxa, el trocánter, el fémur, la tibia y cinco segmentos tarsales.
Aquí vemos una vista anterior de la pierna, reconocida por la presencia de cerdas sensoriales en oposición a la cutícula desnuda presente en el lado posterior. También se indica la orientación del eje proximal-distal y del eje dorsal-ventral. Este procedimiento de disección elimina un pequeño trozo de cutícula del fémur proximal, de modo que se pueden estudiar los cenadores de axones, que se proyectan dorsalmente, inervando el músculo elevador de la tibia.
Nuestro trabajo previo se ha centrado en el cenador indicado, originario del presunto linaje ocular neuroblasto. En esta parte del procedimiento, eliminamos la cutícula del lado anterior del fémur. Las pinzas de disección son críticas para el éxito, y hemos encontrado que la introducción de una ligera curva al final de las pinzas súper finas número cinco proporciona un bisel que permite que la cutícula se agarre superficialmente, en lugar de ser pinchada, lo que puede arruinar el tejido.
Transfiera las piernas a un plato de elastómero de silicona en PBS para la disección. Usando un par de fórceps, fije el segmento de tibia al plato de elastómero de silicona como se muestra aquí en el lado derecho. Usando las otras pinzas sostenidas biseladas hacia abajo, agarre un trozo de cutícula en el extremo distal del fémur y tire en la dirección proximal hacia el trocánter.
Mantenga la extirpación metódica de la cutícula hasta que el músculo desnudo sea visible en todo el extremo proximal del fémur. Una vez que todas las piernas estén diseccionadas, reemplace PBS con solución de FA para posfijar las piernas durante 30 minutos con agitación en un nutator a velocidad media. Después, lave las muestras en un mil PBS por tres veces rápido, y luego tres veces durante cinco minutos cada una en solución de PBT.
Para bloquear los tejidos, reemplace un mil PBT con una solución de bloqueo que consiste en un mil 5% de suero de cabra normal diluido en PBT. Incubar las patas diseccionadas durante cuatro horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire la solución de bloqueo y reemplácela con el anticuerpo primario que se diluye en la solución de bloqueo.
Aquí, estamos usando discos anti grandes en una dilución de uno a 200. Vuelva a colocar las placas en una coctelera e incube a cuatro grados durante la noche. Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave los anticuerpos primarios en un mil PBT durante tres veces brevemente, y luego tres veces durante 15 minutos cada una.
Bloquee los tejidos nuevamente en un molino de suero de cabra 5% normal durante al menos dos horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire la solución de bloqueo y agregue 300 microlitros de los anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes diluidos apropiados. Además, agregue una a 2000 dilución de faloidina conjugada de fluorescencia para etiquetar el músculo.
Para incubar, selle los pozos con cinta de sellado de laboratorio y tapa. Además, envuelva las placas en papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Incubar durante seis a ocho horas a temperatura ambiente, o durante la noche a cuatro grados centígrados.
Para eliminar el anticuerpo secundario no unido, realice lavados con PBT de una manera similar a la descrita anteriormente al lavar el anticuerpo primario. Después de este paso, las muestras ya están listas para ser montadas y fotografiadas. Coloque las patas del lado anterior hacia arriba y cúbralas con medios de montaje adicionales si es necesario.
Raspe suavemente las esquinas de un deslizamiento de cubierta a través de una bola de arcilla. La arcilla resultante servirá como espaciador entre el tobogán y el deslizamiento de la cubierta, para que los tejidos no se trituren. Presione hacia abajo en el resbalón de la cubierta hasta que toque la parte superior de las piernas.
Selle los bordes con esmalte de uñas y guárdelos a cuatro grados hasta obtener la imagen. Imagen por microscopía confocal utilizando los parámetros de imagen descritos en la sección cuatro del protocolo escrito. Para ayudar a validar el protocolo de disección, primero obtenemos imágenes de las piernas mediante microscopía de contraste de fase a bajo aumento.
Aquí hay un ejemplo en el panel A de una buena disección a la izquierda y una mala disección a la derecha en la que se interrumpieron las fibras musculares. El panel C muestra una imagen confocal de una buena disección en la que no se ha interrumpido el músculo. En contraste, el panel D muestra una pierna dañada durante la disección, en la que faltan fibras musculares, como lo indica la flecha.
Aquí, teñimos una imagen de las piernas con peroxidasa anti rábano picante para detectar procesos neuronales, que se muestran aquí en verde, anti discos grandes, lo que facilita la agrupación de receptores de glutamato postsinápticos, que se muestran en rojo, y faloidina para etiquetar el músculo, que se muestra en azul. Cuando se captura a un aumento de 20X con un canal de luz transmitido, es fácil ver el área diseccionada. Tenga en cuenta que los anticuerpos penetran parcialmente en áreas no diseccionadas y se pueden ver a través de la cutícula como lo indica la flecha blanca.
Cada una de las neuronas motoras de la pierna hace proyecciones estereotipadas cuando inerva el músculo. Nuestro trabajo se centra en las neuronas motoras que inervan el músculo elevador de la tibia, que se muestra aquí como la región en caja e indicada por la flecha blanca. Con un aumento más alto de 60X con zoom 2X en la parte superior derecha, podemos obtener imágenes efectivas de boutons, que se muestran en verde, y DLG circundantes que se muestran en rojo.
Aumentar aún más el zoom, o pasar a un objetivo de 100X, permite la cuantificación del tamaño y la morfología del bouton como se muestra en la parte inferior derecha. Usando esta técnica de disección combinada con inmunocitoquímica, encontramos que hay hinchazón de bouton dependiente de H en un modelo mutante sod1 de ELA, que se muestra aquí en piernas H71Y envejecidas, en comparación con los controles de tipo salvaje como lo indican las flechas. Los tamaños de Bouton se cuantifican en la parcela de enjambre de abejas a la derecha.
Además, encontramos una reducción en el marcador de zona activa Bruchpilot, mostrado en rojo, dentro de axones HRP débilmente teñidos, mostrados en verde, de mutantes H71Y. Para estudiar la neurodegeneración, los agregados de proteínas ubiquitinadas a menudo son detectados por el anticuerpo FK2, y se muestran aquí como puntos FK2 positivos, en los axones y músculos de las moscas H71 envejecidas en el lado derecho, indicados por las flechas. Finalmente, las mitocondrias se pueden visualizar mediante inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal anti ATP5a, como se muestra aquí en rojo dentro del músculo elevador de la tibia.
Encontramos que las mitocondrias se agrandan con la edad en los mutantes H71Y. Una vez dominado, la preparación de la pierna diseccionada y la tinción de anticuerpos asociada le permitirán analizar los cambios moleculares en la unión neuromuscular adulta para su mutante favorito en varios puntos de tiempo.
