This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

el trabajo con animales fue autorizado y aprobado por el comité de revisión ética de la Universidad de Newcastle. Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las líneas de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. 1. Administración EdU <ol><li> Disolver EdU en solución salina estéril (0,9% w / v) a una concentración final de 12,5 mg / ml. <ol><li> Calentar la solución a 40 ° C y agitar para disolver completamente. Almacenar suficiente EDU / solución salina a 4 ° C para inyectar todos los ratones en el estudio lo que permite 6 inyecciones diarias. Nota: Por lo general se requieren más de 6 ratones para cada grupo experimental. Sin embargo, los cálculos de potencia se deben realizar para estudios independientes. </li></ol></li><li> Pesar ratones individuales. Calcular el volumen necesario para administrar 100 mg / g de solución / solución salina EdU a cada ratón (8 l de solución madre EdU por g). </li><li> Dibujar el volum apropiadae del EDU / solución salina en jeringa de insulina con una aguja de 25 G. </li><li> Realizar intraperitoneal (ip) durante la manipulación de los ratones usando técnicas del Ministerio del Interior aprobados. <ol><li> Coloque el ratón en la tapa de la jaula. Tire suavemente de nuevo en la base de la cola y sujete firmemente el ratón por la piel. </li><li> Exponer el abdomen para inyección Manteniendo el ratón con el dedo índice y el pulgar cerca de la base de la cabeza e inclinando la cabeza del animal hacia atrás hacia el piso. </li><li> Limpiar el abdomen con una solución de alcohol 70%. Localiza la línea media del animal y en el cuadrante inferior derecho. Se inyecta la solución EDU / solución salina en el animal en el cuadrante inferior derecho. </li><li> Inyectar ratones con solución / solución salina EdU y registrar la hora del día. </li></ol></li><li> Repetir los pasos 1.2 a 1.4 en el mismo momento del día, durante 6 días consecutivos. Nota: A medida que se requiere un control negativo EdU para ajustar la compuerta para el análisis de citometría de flujo, inyectar una edad adicional, el género y experimentalmente que coincidaed ratón con un volumen equivalente de solución salina sin edu. Esto proporcionará el control requerido (ningún control EDU). Este control debe ser incluido para cada estudio para permitir variaciones en los lotes de reactivos y citómetro configurado. </li></ol> 2. Los corazones de cosecha <ol><li> A las 24 h después de la inyección EdU 6º, sacrificar a los ratones por dislocación cervical (o un horario alternativo 1 de Ministerio del Interior aprobó el método). </li><li> Lugar de los animales sacrificados en una posición supina y hacer incisión en la piel desde el centro del abdomen hasta el diafragma con tijeras quirúrgicas. </li><li> Cortar el diafragma, y ​​sosteniendo el esternón lejos de la cavidad del cuerpo, corte bilateralmente para exponer el corazón. </li><li> Levantar ligeramente el corazón y cortar los principales vasos sanguíneos del tracto de salida para diseccionar el corazón fuera de la cavidad torácica. </li><li> Inmediatamente colocar el corazón en cada una de 15 ml tubo de centrífuga individual que contiene 10 ml de PBS enfriado a 4 ° C. </li><li> Transferir los corazones a SEParate 10 cm placas de Petri, utilizando un escalpelo cortar cada corazón en dos en una orientación sagital y lavar el corazón apretando suavemente con un par de fórceps. A continuación, reemplace el PBS para eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Repita este paso dos veces. </li><li> Coloque ambas partes de cada corazón en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml individual. </li><li> Continúe con el paso 3 o, alternativamente, almacenar las muestras -80 ° C como se detalla en los pasos 2.9 y 2.10. </li><li> Usando una aguja 25 G, hacer un pequeño agujero en la tapa del tubo de microcentrífuga para evitar que la tapa de apertura debido a la expansión de los gases cuando se procesa el corazón. </li><li> Etiqueta de cada tubo de microcentrífuga y colocar en un contenedor de nitrógeno líquido para congelar. </li></ol> Etiquetado 3. Los núcleos de disociación de los cardiomiocitos y Núcleos Nota: Este etiquetado de disociación y cardiomiocitos núcleos núcleos es una adaptación de la de Bergmann et al 11 Realice este procedimiento en todas las muestras inyectadas.con Edu y solución salina inyectada (sin control de EDU) control negativo. Ver Tabla 1 para la receta de soluciones que se requieren para llevar a cabo estos pasos. <ol><li> Para cada corazón para ser analizada, colocar 36 ml de 1% de BSA / PBS solución en un tubo de ultracentrífuga, se incuba durante 30 minutos, desechar la solución y luego dejar secar al aire. Nota: Este tubo se utiliza en el paso 3.6. </li><li> Coloque los corazones congelados individuales sobre una placa de 10 mm en el hielo y carne picada con un bisturí que permite a los corazones se descongelan durante el proceso de picar carne. </li><li> Coloque corazones picado en 15 ml de Tampón de Lisis Celular en un tubo de centrífuga de 50 ml y homogeneizar con un homogeneizador de sonda para 15 segundos a 25.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Añadir otros 15 ml de Tampón de Lisis Celular al tubo de centrífuga y transferir a un 40 ml Dounce con una mano de mortero grande despacho. Realizar 10 golpes con la mano del mortero y filtrar a través de 100 micras a continuación colador 40 micras de células en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Se centrifuga durante 10 minutos unat 700 xga 4 ° C y separar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento nuclear en 25 ml de sacarosa solución de gradiente y la capa de los núcleos celulares solución en la parte superior de 10 ml de solución de gradiente de sacarosa fresco en el tubo de ultracentrífuga preparado en 3.1 que contienen. </li><li> Centrifugar a 13.000 xg durante 1 hora a 4 ° C usando un rotor de tubo de oscilación hacia fuera. </li><li> Tras la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1.300 l de tampón de almacenamiento de núcleos en un tubo de 1.5 ml y etiqueta PCM1. </li><li> Eliminar 300 l de la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga y añadir 700 l de tampón de almacenamiento núcleos fresco. Etiquetar este tubo como control ISO. </li><li> Añadir anti-PCM1 a una concentración final de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado PCM1 y añadir el anticuerpo de control de isotipo IgG de conejo a una concentración de 8 mg / ml al tubo de microcentrífuga etiquetado de control ISO. </li><li> Incubar toda la noche a 4 ° C. Tras incubación, centrifugar a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante, sustituir con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco, resuspender y centrifugar de nuevo durante 10 min a 700 x g. Descartar el sobrenadante y reemplazar con 1 ml de tampón de almacenamiento núcleos fresco. </li><li> Añadir 1 l de F (ab &#39;) 2 Fragmento de IgG de cabra anti-conejo (H + L) de anticuerpos (FITC o tinte verde fluorescente equivalente) para alcanzar una concentración final de 2 mg / ml. Nota: El uso de un F (ab &#39;) 2 fragmento de anticuerpo disminuye el potencial para el etiquetado no específica de las células inmunes incluyendo macrófagos y células B. </li><li> tubos de envoltura en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuban durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Detección de EdU Incorporación <ol><li> Diluir 10 veces más concentrada EdU tampón de reacción 1:10 con agua desionizada. </li><li> Se centrifuga la PCM-1 e ISO suspensiones núcleos de control etiquetada a 700 xg durante 10 min, descartar el sobrenadante y resuspender el botón núcleos en 1 ml de1% de BSA / PBS solución. Lavar el sedimento de núcleos dos veces. </li><li> Después del lavado final, descartar el sobrenadante y reemplazar con 100 l de EdU fijador. </li><li> Envuelva los tubos en papel de aluminio para protegerlo de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lavar las muestras dos veces con 1 ml de 1% BSA / PBS solución, centrifugar a 700 xg y se incuba con una solución de permeabilización a base de saponina 1x a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Preparar 1x cóctel etiquetado EdU (Tabla 2). Se requerirá un mínimo de 2 reacciones de incluir el control edu. </li><li> Añadir 500 l de 1x cóctel EdU etiquetado directamente a cada muestra que ya contiene los núcleos en 100 l de solución de permeabilización a base de saponina 1X y se incuba a temperatura ambiente protegido de la luz durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 700 xg y resuspender en 1 ml de 1% BSA / PBS y repetir este paso dos veces más. </li><li> Se centrifuga a 700 xg, desechar el sobrenadante y reemplazar con 400 l de solución de tinción de ADN (véase la Tabla de Materiales). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td></tr><tr><td> 1. Tampón de Lisis Celular </td></tr><tr><td> 0,32 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> acetato de magnesio 5 mM </td></tr><tr><td> EDTA 2,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA 0,5 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> Solución Gradiente 2.Sucrose </td></tr><tr><td> 2,1 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> acetato de magnesio 5 mM </td></tr><tr><td> DTT 1 mM </td></tr><tr><td> 3. tampón de almacenamiento núcleos (NSB) </td></tr><tr><td> 0,44 M de sacarosa </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> KCl 70 mM </td></tr><tr><td> 10 mM de MgCl 2 </td></tr><tr><td> espermina 1,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Núcleos ingredientes de la receta tampón de aislamiento para todos los tampones usados ​​en la sección de protocolo 3 (disociación núcleos y etiquetado núcleos de cardiomiocitos).. 5. Análisis de citometría de flujo Nota: Realizar la citometría de flujo en núcleos aislados como se describió previamente 7,11,15. <ol><li> En primer lugar, crear un gráfico que describe dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) para permitir la discriminación de los núcleos de los desechos (Figura 2A). </li><li> Crear un plan para discriminar los núcleos individuales de los agregados (Figura 2B) mediante el trazado de 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol)) área (DAPI (3-405 / 450/50-A) respecto a la altura (33-405 / 450 / 50-H). garantizar that el 3-405 / 450/50-A de la señal se recoge en la escala lineal para permitir la correcta determinación del contenido de ADN. </li><li> Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A (PCM-1) frente al SSC y mostrar sólo los eventos de la puerta singlete creada en 5.2 con el fin de evaluar PCM-1 de expresión en la población singlete. </li><li> Ejecutar la muestra de control de isotipo a fin de establecer un PCM-1 puerta positivo (Figura 2C). Ejecutar una pequeña cantidad de PCM1 etiquetado de ejemplo para comprobar la PCM1 expresar la posición de la población y gating. </li><li> Crear un gráfico que describe SSC-A frente a 405/450 / 50-A (para detectar DAPI). En esta gráfica, pantalla sólo singlete Pcm1 núcleos que expresan, usando las puertas creadas en 5.3. Utilice esta parcela para crear una puerta jerárquico adicional que contiene sólo 2 N núcleos (Figura 2D). </li><li> Crear un gráfico que describe 488/535 / 30-A contra 1-633 / 660/20-A para permitir la identificación de etiquetado EdU de la población que expresa PCM1 cardiomiocitos. Mostrar sólo los núcleos que son singlete, P<html> CM1 + y 2N usando el gating anteriormente. </li><li> Muestra de corazón correr desde ningún control EdU para configurar la puerta EdU positivo (Figura 2E). Crear la puerta apropiada para las células EdU +. </li><li> Grabar y cuantificar singlete, 2N, núcleos PCM-1 que expresan las que han incorporado edu. </li><li> El cálculo de esta población como un porcentaje del total de singlete, PCM1 + núcleos. Esto proporcionará la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos, durante el período de pulso EdU 7 días, como un porcentaje de núcleos totales cardiomiocitos. Nota: Como la unión a ADN DAPI es estequiométrica la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN. Determinar la ploidía en base a la intensidad de la / 450/50-A de la señal 405, como se ha descrito previamente 7. </li><li> Para evaluar la ploidía dentro de la población total de cardiomiocitos utilizar la trama establecida en 5,5 y un gating estrategia basada en la concentración de ADN 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Ventana de medida para cuantificar la estrategia de cardiomiocitos EdU incorporación y ploidía (A) Los núcleos están discriminado de desechos basados ​​en la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC). (B) Se crea una puerta lineal y la población se identifica singlete núcleos basados ​​en el marcaje con DAPI y la altura 405/450/50 vs señal de zona. (C) gating fluorescente permite la separación de los núcleos de cardiomiocitos núcleos (PCM-1-positivo) y no cardiomiocitos (PCM-1-negativos) de tejido del corazón. (D) La intensidad de la señal DAPI se utiliza para determinar la concentración de ADN y la ploidía de ese modo los núcleos de la población de los cardiomiocitos PCM1 +. En el ratón&gt; 80% de los núcleos de cardiomiocitos son diploide (2n). (E) gating fluorescente permite la separación de 2 N, núcleos de cardiomiocitos que han incorporado EdU (PCM + / + EDU = 0,9%) a partir de 2 N, cardiomiocitos que no han incorporado EdU (PCM + educación). Todas las etapas se detallan en el protocolo 5.0. Ejemplo muestra de MDX -. / Y ratones en el fondo C57 / BL10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Para cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos y ensayos de regeneración deben distinguir entre la verdadera generación de cardiomiocitos y la división de ADN no productiva. Muchos estudios siguen ignorando estos hechos simplemente no productivas, la cuantificación de la proliferación de cardiomiocitos únicamente a través de la expresión de ciclina kinesis y marcadores del ciclo celular. Hasta la fecha, un único método que permite la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos mientras que el control de estos eventos no productivos sigue siendo alusiva. En particular, sigue siendo difícil dar cuenta de los cardiomiocitos polyploidization que contribuye hasta ~ 65% de la replicación del ADN de los cardiomiocitos 13. Por lo tanto para ayudar en la cuantificación exacta de la generación de cardiomiocitos hemos desarrollado un protocolo que permite la cuantificación robusta de los tipos de núcleos de cardiomiocitos neo excluyendo la replicación del ADN que resulta en un incremento de ploidía. Aunque este protocolo puede no discriminación entre los géneros neo-cardiomiocitosción y cardiomiocitos bi-nucleación, que pueden ser utilizados rápidamente y calcular con precisión el límite superior (que representan el ploidía) de generación de cardiomiocitos. Por lo tanto, este protocolo proporciona una herramienta de evaluación para evaluar los posibles cambios en las tasas de generación de cardiomiocitos y polyploidization en modelos de enfermedad o para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial. Una vez que los cambios en la velocidad de generación de núcleos neo-cardiomiocitos se identifican utilizando este protocolo estudios posteriores se pueden utilizar para determinar si esto debido a cambios en la generación de cardiomiocitos de número de cardiomiocitos de nucleación, como se describió anteriormente 2,13,17,18. Estos incluyen el uso de la dinámica de nucleación cuantificación cardiomiocitos histológicos durante el período de pulso o análisis de secciones de tejido obtenidos a partir de animales EdU pulsados ​​en comparar EdU incorporación en las poblaciones de cardiomiocitos mononucleadas y multinucleadas. Debido a los bajos niveles de los cardiomiocitos rotación de esteprotocolo utiliza múltiples inyecciones de EdU lo largo de un período de 7 días. Esto también permite que la &quot;persecución&quot; de todas las posibles fuentes celulares de la generación de cardiomiocitos y permite la cuantificación de la generación de cardiomiocitos núcleos acumulada durante este período de tiempo. Dependiendo del estudio, este periodo de tiempo se puede ajustar para adaptarse a los niveles predichos de generación de cardiomiocitos. Para la cuantificación exacta de EdU incorporación en los núcleos de cardiomiocitos, es imperativo que no hay etiquetado no específica de los núcleos con el anticuerpo secundario usado para detectar PCM-1 reactividad. Por tanto, sería prudente para llevar a cabo experimentos de titulación de anticuerpos secundarios adicionales con el fin de optimizar este aspecto del protocolo, en particular si un anticuerpo secundario que no sea que se sugiere en este protocolo se va a usar. El protocolo descrito aquí utiliza PCM-1 de expresión para identificar los núcleos de cardiomiocitos. Si bien este es un marcador de cardiomiocitos establecido, marcadores alternativos se pueden utilizar para validardatos; estos incluyen anticuerpos específicos para la troponina T cardiaca que se ha identificado como parte localizada en los núcleos de cardiomiocitos 1. Del mismo modo, las proteínas localizadas nucleares alternativos pueden ser utilizados para identificar y cuantificar EdU incorporación en las poblaciones de núcleos distintos de los de los cardiomiocitos. Es importante que todos los núcleos de cardiomiocitos que están experimentando activamente mitosis se excluyen del análisis, ya que se desconoce el destino de esta síntesis de ADN y puede resultar en la división celular o el aumento de ploidía. PCM1 se desmonta durante la fase M del ciclo celular, por lo tanto cardiomiocitos mitosis no será identificado por la expresión PCM1. Además, todos los núcleos en la fase s del ciclo celular deben ser excluidos de análisis posteriores. Esto se puede lograr por Supresión todos los núcleos con una intensidad DAPI por encima de la población 2N incluyendo aquellos con una intensidad DAPI entre el 2N y 4N poblaciones. Aunque es cada vezaceptado que el corazón tiene la capacidad de sustituir los cardiomiocitos durante el envejecimiento normal y después de una lesión aguda, la fuente y el grado de este potencial sigue siendo controvertido. Además, las tasas dispares de rotación de los cardiomiocitos se han reportado 1,7,20-22. Esto puede ser debido en parte a las dificultades en la identificación y la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos 19 con precisión. Hasta la fecha la mayoría de los estudios se han basado sólo en el uso del análisis histológico y la identificación de los cardiomiocitos a través de la expresión de proteínas citoplasmáticas, incluyendo proteínas del sarcómero, para la cuantificación del volumen de negocio de los cardiomiocitos y la renovación 2,4,23,24. El uso de estos métodos para detectar la expresión de marcadores de proliferación, o como se ha demostrado aquí, la incorporación de análogos de timidina puede resultar fácilmente en el error de identificación de otros tipos de células cardiaca como cardiomiocitos. Mientras que el uso de la imagen confocal 3D puede ayudar a aliviar estos problemas thESE métodos son caros y lentos. Curiosamente, el protocolo descrito aquí demuestra neo-cardiomiocitos generación núcleos se produce a un ritmo de 0,17% por semana. Esto es consistente con otra citometría de flujo que demuestran los estudios basados ​​tasas de rotación semanales de hasta 0,13% 5. Aunque es tentador para extrapolar las tasas de rotación anual sobre la base de estos datos, al igual que en estudios previos 2,5,25,26, esto no es apropiado como las tasas de rotación son dinámicos durante el tiempo de vida de un animal 13. Este método tiene un número de aplicaciones potenciales, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y las tasas de polyploidization cardiomiocitos.

En los últimos años ha habido una acumulación de pruebas que cuestionan la suposición de que el corazón es un post-mitótico 1,2 de órganos terminales diferenciadas. Sin embargo, la cuantificación del volumen de negocios de los cardiomiocitos y la regeneración sigue siendo un reto. Las dificultades para identificar con precisión la generación de cardiomiocitos raras mediante técnicas de inmunohistoquímica estándar están bien reportaron 3. Además, la fuente celular de la generación de cardiomiocitos sigue siendo incierto con la evidencia para las contribuciones de la proliferación de los cardiomiocitos, así como por la diferenciación de células madre 4-6. Por lo tanto, el uso de modelos de linaje rastreo que requieren el conocimiento del fenotipo de cardiomiocitos progenitor es imposible y la cuantificación de la proliferación en una única población, incluyendo los cardiomiocitos, es inapropiado. Además un cardiomiocito tiene el potencial para endoreplication sin cariocinesis (que resulta en un coche poliploidediomyocyte) o cariocinesis en ausencia de la citocinesis (que resulta en un cardiomiocito binucleadas) 7,8. La cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos depende de la capacidad de distinguir entre estos eventos y la verdadera generación de neo-cardiomiocitos. Esto crea complicaciones únicas porque la replicación del ADN y la expresión de las quinasas dependientes de ciclina en cardiomiocitos no demuestran exclusivamente división celular verdadero 9,10. Para ayudar en la cuantificación de la generación de neo-cardiomiocitos, hemos combinado una técnica de aislamiento núcleos establecido, y el etiquetado inmunológica de material pericentriolar 1 (PCM1) para la identificación de los núcleos de cardiomiocitos como se describe por Bergmann et al. 7,11 con nuevos métodos de largo plazo marcaje de ADN y análisis de ploidía. PCM-1 es una proteína de centrosoma que se acumula en la superficie nuclear de diferenciados miocitos, no de ciclismo. Estudios previos han demostrado que los anticuerpos contraPCM-1 etiquetar específicamente núcleos de cardiomiocitos 7,11 y, como tal PCM1 ha sido utilizado por un número de grupos independientes para identificar los cardiomiocitos 1,12,13. Además, hemos demostrado que la expresión PCM1 asigna a núcleos de cardiomiocitos genéticamente etiquetados en el modelo CRE-TnT ratón transgénico 14 (Figura 1). El protocolo descrito aquí permite la identificación precisa y sensible de la generación de cardiomiocitos núcleos neo en el corazón de ratón, independientemente de los orígenes celulares (Figura 1A y B) mientras que excluye simultáneamente etiquetado nucleósido debido a polyploidization del análisis (Figura 1C y D). Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos que se requiere para la cuantificación precisa de la rotación de los cardiomiocitos. Además,proporciona una herramienta de detección rápida para evaluar los posibles cambios en la dinámica de generación de cardiomiocitos. Si bien el etiquetado de ADN implica generalmente 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) como el análogo de la timidina, el protocolo descrito aquí utiliza un ensayo de 5-etinil-2 &#39;desoxiuridina (EDU), basado ya que requiere menos etapas de procesamiento para una más rápida a través de entradas y no requiere desnaturalización del ADN para la inmuno-detección, por lo que es compatible con otros protocolos de inmunotinción y aumentando así las posibles aplicaciones posteriores del método. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Figura 1: pulsante continuo con etiquetas EdU neo-cardiomiocitos, independientemente de sus progenitores. (A) EdU se incorpora en el ADN de los cardiomiocitos durante la división celular. La proliferación de los cardiomiocitos en la población será Result en un aumento de, o la sustitución de los cardiomiocitos y es por lo tanto la síntesis de ADN productivo (contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos). (B) EdU se incorpora en el ADN de las células progenitoras cardiacas durante la división celular. Este será retenido en la célula durante la diferenciación al linaje de los cardiomiocitos. Esta diferenciación de células madre también dará lugar a un aumento en el número de cardiomiocitos y por lo tanto contribuye al mantenimiento y reparación de tejidos. (C) Los cardiomiocitos tienen la posibilidad de someterse a la replicación del ADN &quot;no productivo&quot; que resulta en aumento de ploidía de los cardiomiocitos, que está asociada con la hipertrofia de los cardiomiocitos y la remodelación del miocardio, pero no sustituye a los cardiomiocitos perdidos. El proceso de polyploidization difiere de binucleación ya que resulta en una cardiomiocitos con un solo núcleo, que contiene cuatro o más conjuntos de dos cromosomas homólogos (&gt; 2N). (D) A raíz de una núcleos continua pUlse, este protocolo describe el aislamiento y la identificación de los núcleos de los núcleos de cardiomiocitos por expresión PCM1 para permitir la cuantificación de ambos ploidía de los cardiomiocitos y la incorporación EdU. PCM1 expresión y Edu incorporación detectado mediante citometría de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2038">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:501px;">0.32 M sucrose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">84100</td>
			<td style="width:1156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c5086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM magnesium acetate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M-5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mM EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mM EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mM DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mM spermine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td>
			<td>abcam</td>
			<td>abc7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-PCM-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">HPA023374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 F(ab&#39;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell strainers&#160; 70 &#956;m and 100&#956;m&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11597522, 11517532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10634</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for section, EdU reaction buffer,&#160; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyStain DNA 2 step kit,</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>05 5005</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe homogeniser e.g. TissueRuptor&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueRuptor Disposable Probes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:267px;">990890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Facscanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

Aunque se acepta que el corazón tiene un potencial limitado para regenerar los cardiomiocitos después de la lesión y que los bajos niveles de rotación de los cardiomiocitos se producen durante el envejecimiento normal, la cuantificación de estos eventos sigue siendo un reto. Esto es en parte debido a la rareza del proceso y el hecho de que múltiples fuentes celulares contribuyen al mantenimiento del miocardio. Además, la duplicación del ADN dentro de los cardiomiocitos a menudo conduce a un cardiomiocito poliploides y sólo rara vez conduce a nuevos cardiomiocitos por división celular. Con el fin de cuantificar con precisión el volumen de negocios de los cardiomiocitos discriminación entre estos procesos es esencial. El protocolo descrito aquí emplea etiquetado nucleósido a largo plazo con el fin de etiquetar todos los núcleos que han surgido como resultado de la replicación del ADN y los núcleos de cardiomiocitos identificados mediante la utilización de aislamiento de núcleos y posterior immunolabeling PCM1. En conjunto, esto permite la identificación precisa y sensible del etiquetado nucleósido de la cardiomyocyte población núcleos. Además, 4 &#39;, el etiquetado y el análisis de la ploidía núcleos 6-diamidino-2-fenilindol, permite la discriminación de los núcleos neo-cardiomiocitos a partir de núcleos que han incorporado nucleósido durante polyploidization. Aunque este método no puede controlar para binucleación cardiomiocitos, permite una cuantificación rápida y robusta de núcleos neo-cardiomiocitos mientras que representa el polyploidization. Este método tiene una serie de aplicaciones posteriores, incluyendo la evaluación de los agentes terapéuticos potenciales para mejorar la regeneración de los cardiomiocitos o la investigación de los efectos de la enfermedad cardiaca en el recambio de los cardiomiocitos y la ploidía. Esta técnica también es compatible con las técnicas inmunohistoquímico aguas abajo adicionales, lo que permite la cuantificación de la incorporación de nucleósido en todos los tipos de células cardíacas.

Este método permite la cuantificación de aumento de la incorporación EdU debido a la división núcleos de cardiomiocitos mientras que el control para aumentar la polyploidization. El uso de un ensayo basado en BrdU, previamente demostrado que el corazón de los mamíferos responde a la pérdida de cardiomiocitos crónica, en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne, con la regeneración de nuevos cardiomiocitos. Hemos utilizado los métodos descritos aquí para validar aún más nuestros resultados publicados y para demostrar la utilidad del protocolo. De acuerdo con el protocolo descrito; adultos (12 semanas de edad) ratones mdx BL10 y de control fueron pulsados ​​con una inyección diaria de EdU durante 7 días, informó anteriormente de forma estática para permitir el análisis entre los grupos experimentales 5,13. Análisis inmunohistoquímico de los corazones de impulsos demuestra la presencia de PCM1 expresar cardiomiocitos que han incorporado EdU (Figura 3A). usin Sin embargo, los datos obtenidosg inmunohistoquímico métodos pueden ser mal interpretados, como otros tipos de células que han incorporado EdU pueden ser identificados erróneamente como cardiomiocitos. Un ejemplo de esto se demuestra en la Figura complementario 1A y B. Además, los métodos inmunohistoquímico no distinguen polyploidization de la división nuclear. El análisis de citometría de flujo se detalla en este protocolo permite la rápida cuantificación de la división nuclear de cardiomiocitos en ratones mdx y de control, mientras que excluye células que habían incorporado EdU debido a polyploidization. Similar a los datos publicados previamente 13, el análisis reveló un aumento en las tasas de generación de núcleos neo-cardiomiocitos en los corazones de ratones mdx de edad en comparación con controles pareados (1,2% frente a 0,17%; Figura 3B y C). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; Cuantificación de EdU etiquetado cardiomiocitos en corazones de tipo salvaje y mdx. (A) Imagen de proyecciones Z-stack tomadas de 40 micras de espesor secciones de corazones mdx. PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que ha incorporado EdU (rojo). flecha amarilla indica EdU etiquetado cardiomiocitos. i y II indica individuo EdU etiquetado cardiomiocitos que se muestran en el plano z. Núcleos marcados con DAPI (azul) (B y C) Citometría de flujo de núcleos aislados mostrando parcelas representativas 12-13 de la semana viejo tipo salvaje (C57 / BL10) y los ratones mdx (MDX - / y en el fondo C57 / BL10). (B) Histograma que muestra la intensidad DAPI y la discriminación entre 2 N y 2N&gt; núcleos. (C) Las representaciones que muestran EdU incorporación en la población núcleos de cardiomiocitos 2N cuando se analizó como se detalla en este protocolo. Para todos los ratones Edu se administró durante 1 semana a partir de 12 semanas de edad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Complementario Figura 1:. PCM-1 es un marcador específico para los núcleos de cardiomiocitos utilizando el protocolo descrito núcleos fueron aislados del ratón transgénico doble producida mediante el cruce de ratones TNT cre-14 con la línea de reportero CRE sensible ROSA nT / nG 16. En la activación cre ratón resultante bajo el control de troponina T (TNT) promotor conduce a la expresión de GFP irreversible con se localiza en los núcleos. Núcleos marcados con el control de isotipo (Iso) demuestra la capacidad de identificar la expresión de GFP cardiomiocitos núcleos de población (488/530/30-A). Etiquetado de los núcleos con anti-PCM1 (anticuerpo secundario detectado por 633 a 660/20-A) demuestra la correlación de expresión PCM1 con el cardiomyocy expresan GFPpoblación núcleos te. En este ejemplo, el 98,8% de los núcleos de cardiomiocitos identificados por la actividad del promotor TNT, están marcadas por el anticuerpo PCM1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar la Figura 1 complementario.</a> Figura complementario. 2: Desafíos para la cuantificación de la renovación de los cardiomiocitos mediante técnicas inmunohistoquímico (A) 2D La imagen muestra dos PCM-1 que expresan núcleos de cardiomiocitos (verde) que parecen estar también marcado por Edu (rojo). Las flechas amarillas indican lo que parece ser cardiomiocitos que han incorporado edu. Esto es debido a la aparente co-localización de expresión PCM1 y etiquetado EdU cuando visualizado utilizando imágenes 2-dimensional. (B) Una proyección 3-dimensional de esta imagen identifica el EdU etiquetado células no son cardiomiocitos pero son células no cardiomiocitos suprayacentes PCM1 expresar núcleos de cardiomiocitos. C57 / BL10 a las 12 semanas de edad utilizado para los experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2A.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar complementa la figura 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> componentes de la reacción </td><td colspan="2"> Número de reacciones </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 l </td><td> 2,19 ml </td></tr><tr><td> protector de cobre </td><td> 20 l </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> colorante fluorescente picolilo azida </td><td> 5 l </td><td> 12,5 l </td></tr><tr><td> reacción diluidatampón preparado en 4.1 </td><td> 100 l </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> volumen total de reacción </td><td> 1 ml </td><td> 2,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2: EDU ingredientes del cóctel. Receta para el cóctel de etiquetado EdU requerido por la Sección 4 del protocolo (Detección de EdU incorporación).

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K vistas.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...