Name: simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

עבודה Animal הוסמכה ואושרה על ידי ועדת הבדיקה אוניברסיטת אתיקה ניוקאסל. כל הנהלים בבעלי החיים בוצעו העומדים לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / איחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. 1. מינהל edu <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים edu תמיסת מלח סטרילית (0.9% w / v) בריכוז סופי של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון 40 ° C ו מערבולת כדי להתמוסס לחלוטין. אחסן מספיק edu / מלוחים ב 4 ° C להזריק כל העכברים במחקר המאפשר 6 זריקות יומיות. הערה: בדרך כלל מעל 6 עכברים נדרשים עבור כל קבוצת ניסוי. עם זאת, חישובי כוח יש לבצע מחקרים עצמאיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכברים בודדים. חשב את נפח נדרש לנהל 100 מיקרוגרם / גרם של פתרון edu / מלוחים כל עכבר (8 μl של פתרון המניות edu לכל גרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את volum המתאיםדואר של edu / מלוחים לתוך מזרק אינסולין עם מחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הזרקה (IP) זריקות תוך טיפול בעכברים באמצעות טכניקות משרד הפנים אישר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכבר על מכסה הכלוב. משוך בעדינות בחזרה על בסיס הזנב בתקיפות לתפוס את העכבר על ידי בעורפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הבטן להזרקה על ידי החזקת העכבר עם האצבע המורה והאגודל סמוך לבסיס של הראש להטות את הראש של החיה לאחור לכיוון הרצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את הבטן עם פתרון אלכוהול 70%. אתר את קו האמצע של בעלי החיים ברבע ימני תחתון. להזריק את פתרון edu / המלוח לתוך החיה לתוך ברבע הימני התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק עכברים עם פתרון edu / מלוח ולהקליט את הזמן של היום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.2 כדי 1.4 הזמני של יום, במשך 6 ימים רצופים. הערה: כפקד שלילי edu נדרש להגדיר את gating עבור ניתוח התזרים cytometric, להזריק בעידן נוסף, מגדר בניסוי ההתאמהעכבר ed עם נפח שווה של תמיסת מלח ללא edu. זה יספק את השליטה הנדרשת (אין שליטה edu). שליטה זו יש לכלול עבור כל מחקר כדי לאפשר וריאציות בקבוצות של ריאגנטים cytometer להגדיר. </li></ol> 2. לבבות קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 24 שעות לאחר הזרקת 6 th edu, להקריב בעכברים באמצעות פריקת צוואר רחם (או לוח זמנים חלופי 1 ביתי אשר שיטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חיה להקריב בתנוחה אופקית ולעשות חתך בעור מהבטן באמצע כדי הסרעפת עם מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת, והחזקה של עצם החזה משם מחלל הגוף, לחתוך בילטרלי כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הלב מעט וחותכים את כלי הדם הגדולים של דרכי יצוא לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד למקם כל הלב כדי צינור צנטריפוגות בודדות 15 מ&quot;ל המכיל 10 מ&quot;ל PBS מקורר עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר לבבות ספarate 10 ס&quot;מ צלחות פטרי, באמצעות אזמל לחתוך כל הלב בשני בכיוון sagittal ולשטוף את הלב על ידי כיווץ בעדינות עם זוג מלקחיים. ואז להחליף את PBS להסיר דם רב ככל האפשר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שני החלקים של כל לב לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר אותו אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב 3 או לחילופין דגימות חנות -80 ° C כמפורט צעדים 2.9 ו 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 25 G, לעשות חור קטן במכסה צינור microcentrifuge כדי למנוע את המכסה מעל הפתיחה בשל הרחבת גזי כשהלב מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל צינור microcentrifuge ומניחים במיכל חנקן נוזלי להקפיא. </li></ol> 3. גרעיני דיסוציאציה ו Cardiomyocyte תיוג גרעינים הערה: תיוג גרעיני דיסוציאציה cardiomyocyte גרעינים זה מותאם מזו של ברגמן ואחות &#39;11 בצע נוהל זה על כל הדגימות מוזרקות.עם edu ו מלוחים מוזרק (אין שליטה edu) כביקורת שלילית. ראה טבלה מס &#39;1 על המתכון של הפתרונות הנדרשים כדי לבצע שלבים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל הלב כדי להיות מנותח, להציב 36 מ&quot;ל של 1% BSA / פתרון PBS לתוך צינור ultracentrifuge, דגירה במשך 30 דקות, להשליך את הפתרון ולאחר מכן ולאפשר לאוויר יבש. הערה: צינור זה משמש בשלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לבבות קפואים הפרט על צלחת 10 מ&quot;מ על הקרח ופשטי- באמצעות אזמל המאפשר את ליבם להפשיר במהלך תהליך מתייפייף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לבבות טחון לתוך 15 מ&quot;ל של תא הצפת תמוגה בתוך שפופרת 50 צנטריפוגות מ&quot;ל ו homogenize עם homogenizer החללית במשך 15 שניות ב -25,000 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר נוסף של תא הצפת תמוגה אל הצינור צנטריפוגה ומעביר 40 מיליליטר dounce עם עלי אישור גדול. בצעו 10 משיכות עם העלי ולסנן דרך 100 מיקרומטר אז 40 מיקרומטר תא מסננת לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דק &#39;t 700 XG ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הגרעיני 25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע שכבה בגרעיני התאים המכילים פתרון על גבי 10 מיליליטר של תמיסת סוכרוז שיפוע טריה בצינור ultracentrifuge הערוך 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C באמצעות הרוטור צינור ונדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב -1,300 μl של חיץ אחסון הגרעינים צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ותווית PCM1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 300 μl של ההשעיה לצינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 700 μl של חיץ אחסון גרעינים טריים. לייבל הצינור הזה כשליטה ISO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי PCM1 בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו PCM1 ולהוסיף נוגדנים לשלוט אלוטיפ הארנב IgG בריכוז של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אל הצינור microcentrifuge שכותרתו שליטה ISO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. בעקבות incubation, צנטריפוגות ב XG 700 במשך 10 דקות, לבטל את supernatant, להחליף עם 1 מ&quot;ל של חיץ אחסון גרעינים טריים, גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 10 דקות ב g 700 x. בטל supernatant ולהחליף עם 1 מ&quot;ל של חיץ אחסון גרעינים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של F (ab &#39;) 2 שבר IgG נגד ארנב עיזים (H + L) נוגדנים (FITC או צבע ירוק ניאון שווה ערך) כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הערה: שימוש F (ab &#39;) 2 נוגדן שבר מקטין את פוטנציאל התיוג הלא ספציפי של תאים חיסוניים כולל מקרופאגים ותאי B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לעטוף בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. </li></ol> 4. איתור של edu התאגדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 10x מרוכז תגובת edu חיץ 1:10 עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה PCM-1 ו השעיות גרעינים שכותרתו שליטה ISO ב 700 XG במשך 10 דקות, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה גרעינים ב 1 מ&quot;ל של1% BSA / פתרון PBS. שטוף את כדור הגרעינים פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, לבטל את supernatant ולהחליף עם 100 μl של מקבע edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת צינורות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימות פעמיים עם 1 מ&quot;ל של 1% BSA / פתרון PBS, צנטריפוגות ב XG 700 ו דגירה עם פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל תיוג edu 1x (טבלה 2). מינימום של 2 תגובות יידרשו לכלול את כל שליטה edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של קוקטייל תיוג 1x edu ישירות מדגם המכיל גרעינים כבר 100 μl של פתרון permeabilization מבוססי saponin 1x דגירה בטמפרטורת החדר המוגן מן האור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 700 ו resuspend ב 1 מ&quot;ל של 1% BSA / PBS וחזור על שלב זה עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 700 XG, להשליך supernatant ולהחליף עם 400 μl של פתרון מכתים DNA (ראה טבלה של חומרים). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של המגיב </td></tr><tr><td> 1. תא הצפת תמוגה </td></tr><tr><td> 0.32 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 אצטט מגנזיום מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ EGTA </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradient פתרון </td></tr><tr><td> 2.1 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 אצטט מגנזיום מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;מ DTT </td></tr><tr><td> 3. למאגר אחסון גרעינים (NSB) </td></tr><tr><td> 0.44 M סוכרוז </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ spermine </td></tr></tbody></table> טבלת 1: מרכיבי חיץ גרעיני בידוד מתכון לכל החוצצים המופיעים בפסקה פרוטוקול 3 (דיסוציאציה גרעינים וסימון גרעיני cardiomyocyte).. ניתוח 5. תזרים Cytometric הערה: בצע זרימת cytometry על גרעינים מבודדים כפי שתואר לעיל 7,11,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, ליצור עלילה המתאר פיזור קדימה (FSC) ואת הצד פיזור (SSC) כדי לאפשר אפליית גרעינים מן ההריסות (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור העלילה להפלות גרעינים יחיד מתוך אגרגטים (תרשים 2B) על ידי התוויית 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) אזור (3-405 / 450/50-א) לעומת גובה (33-405 / 450 / 50-H). ודא thaך * 3-405 / 450/50-אות נאסף על בקנה מידה ליניארי לאפשר קביעה נכונה של תוכן DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתארת ​​488/535/30 א &#39;(PCM-1) לעומת SSC ולהציג אירועים בלבד משער הגופייה שנוצר 5.2 כדי להעריך ביטוי PCM-1 באוכלוסיית הגופייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מדגם שליטת אלוטיפ כדי להקים שער חיובי PCM-1 (איור 2 ג). הפעל כמות קטנה של PCM1 שכותרתו מדגם לאמת את PCM1 להביע עמדה האוכלוסייה gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתארת ​​SSC-A vs 405/450/50-A (כדי לזהות DAPI). בחלקה זו, תצוגת גופייה רק ​​גרעינים להביע PCM1, באמצעות השערים שנוצרו 5.3. השתמש עלילה זה כדי ליצור שער hierarchal נוסף המכיל רק 2N גרעינים (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עלילה המתאר 488/535/30 א לעומת 1-633 / 660/20-א &#39;עד תאפשר זיהוי של תיוג edu של PCM1 להביע האוכלוסייה cardiomyocyte. הצגת גרעינים רק שהוא גופייה, P<html> CM1 + ו- 2N באמצעות gating לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם לב לברוח אין שליטת edu כדי להגדיר את השער החיובי edu (האיור 2E). צור את השער המתאים תאי EDU +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גופיית שיא ולכמת, להביע 1 PCM, גרעיני 2N כי שלבו edu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אוכלוסייה זו כאחוז הגופייה הכוללת, גרעיני PCM1 +. זה יספק את שיעור דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו, בתקופת דופק 7 יום edu, כאחוז גרעיני cardiomyocyte הכולל. הערה: כפי DAPI מחייב DNA הוא stoichiometric את עוצמת הקרינה היא יחסי לכמות של DNA. לקבוע ploidy מבוסס על עוצמת 405/450/50-אות, כפי שתואר לעיל 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ploidy בתוך האוכלוסייה cardiomyocyte הכולל להשתמש העלילה הוקמה בשנת 5.5 ואסטרטגיה gating מבוסס על DNA ריכוז 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2:. Gating אסטרטגיה לכמת cardiomyocyte edu התאגדות ploidy (א) גרעינים מופלים מן ההריסות מבוססות על פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC). (ב) שער ליניארי נוצר אוכלוסיית גרעיני הגופייה מזוהית מבוססים על תיוג DAPI וגובה 405/450/50 vs אות אזור. (C) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ו-cardiomyocyte הלא (PCM-1-שלילי) גרעינים מרקמות הלב. Intensity (D) של האות DAPI משמש כדי לקבוע ריכוז דנ&quot;א ploidy גרעינים ובכך האוכלוסייה cardiomyocyte PCM1 +. בשנת העכבר&gt; 80% של גרעיני cardiomyocyte הם דיפלואידי (2n). (E) gating פלורסנט מאפשר הפרדת 2N, גרעינים cardiomyocyte אשר שילבו edu (PCM + / EDU + = 0.9%) מ 2N, cardiomyocytes אשר לא שולבו edu (PCM + חינוכיות). כל הצעדים מפורטים בפרוטוקול 5.0. בדוגמה המוצגת מן MDX -. / עכברים y על רקע C57 / BL10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324, 98-102 (2009).</li><li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes.">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493, 433-436 (2013).</li><li>Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+measuring+cardiomyocyte+renewal.">Challenges measuring cardiomyocyte renewal.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 799-803 (2013).</li><li>Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cell+therapy+stimulates+endogenous+cardiomyocyte+progenitors+and+promotes+cardiac+repair.">Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair.</a> Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).</li><li>Malliaras, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+proliferation+and+progenitor+cell+recruitment+underlie+therapeutic+regeneration+after+myocardial+infarction+in+the+adult+mouse+heart.">Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart.</a> EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).</li><li>Hsieh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+from+a+genetic+fate-mapping+study+that+stem+cells+refresh+adult+mammalian+cardiomyocytes+after+injury.">Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury.</a> Nat Med. 13, 970-974 (2007).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover.">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).</li><li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+content,+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction.">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).</li><li>Carmena, M., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+geography+of+aurora+kinases.">The cellular geography of aurora kinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Cardiomyocyte+Nuclei+from+Post-mortem+Tissue.">Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue.</a> J. Vis. Exp. , e4205 (2012).</li><li>Gilsbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+methylation+orchestrates+cardiomyocyte+development,+maturation+and+disease.">Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease.</a> Nat Commun. 5, 5288 (2014).</li><li>Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+regeneration+in+the+mdx+mouse+model+of+non-ischemic+cardiomyopathy.">Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+humans.">Cardiomyocyte renewal in humans.</a> Circ Res. 110, e17-e18 (2012).</li><li>Prigge, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+double-fluorescent+reporter+for+in+vivo+and+ex+vivo+analyses+of+biological+transitions+in+mouse+nuclei.">Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei.</a> Mamm Genome. , (2013).</li><li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number.">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157, 795-807 (2014).</li><li>Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiomyocyte+polyploidy+and+multinucleation+by+CyclinG1.">Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1.</a> Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).</li><li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart.">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocyte+turnover+in+the+aging+human+heart.">Myocyte turnover in the aging human heart.</a> Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).</li><li>Kajstura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyogenesis+in+the+adult+human+heart.">Cardiomyogenesis in the adult human heart.</a> Circ Res. 107, 305-315 (2010).</li><li>Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation+in+vivo--an+analysis+based+on+cardiomyocyte+nuclei.">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei.</a> Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).</li><li>Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration.">Cardiac regeneration.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 1769-1776 (2006).</li><li>Gonzalez-Valdes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+limits+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure+by+inhibiting+cardiac+senescence.">Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence.</a> Nat Commun. 6, 6473 (2015).</li><li>Kimura, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+fate+mapping+identifies+cycling+cardiomyocytes+in+the+adult+heart.">Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart.</a> Nature. 523, 226-230 (2015).</li><li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts.">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כדי לכמת במדויק מחזור cardiomyocyte מבחני התחדשות יש להבחין בין הדור cardiomyocyte נכון וחילוק DNA פרודוקטיבי. מחקרים רבים ממשיכים פשוט להתעלם אירועים בלתי יצרניים אלה, לכימות התפשטות cardiomyocyte אך ורק דרך הביטוי של נִיעוּת cyclin וסמני מחזור התא. עד כה שיטה אחת המאפשרת הכימות המדויק של מחזור cardiomyocyte תוך פיקוח על אירועים בלתי יצרניים אלה נשאר מרומז. בפרט הוא נשאר קשה להסביר polyploidization cardiomyocyte התורמת עד ~ 65% של שכפול הדנ&quot;א cardiomyocyte 13. לכן כדי לסייע כימות המדויק של דור cardiomyocyte פתחנו פרוטוקול המאפשר כימותים החזקים של שיעורי גרעיני ניאו cardiomyocyte תוך הדרת שכפול הדנ&quot;א שתוצאתו ploidy המוגברת. למרות בפרוטוקול זה לא יכול אפליה בין סוגים הניאו-cardiomyocytetion ו cardiomyocyte דו-התגרענות, ניתן להשתמש בו במהירות ובאופן מדויק לחשב את הגבול העליון (והיוו ploidy) של הדור cardiomyocyte. פרוטוקול זה ולכן מספק כלי הקרנה להעריך שינויים אפשריים בשיעורי דור cardiomyocyte ו polyploidization במודלי מחלה או להעריך את היעילות הפוטנציאלית של רפויים. לאחר שינויים בשער של דור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מזוהה באמצעות פרוטוקול זה מחקרים מאוחרים יותר ניתן להשתמש כדי לבדוק אם זה עקב שינויים דורות cardiomyocyte של מספר התגרענות cardiomyocyte, כפי שתוארו לעיל 2,13,17,18. אלה כוללים את שימוש דינמיקת התגרענות cardiomyocyte כימות היסטולוגית בתקופת הדופק או מנתח סעיפי רקמות המתקבל חי פעמיו edu כדי להשוות התאגדות edu באוכלוסיות cardiomyocyte mononucleated ו multinucleated. בשל הרמות הנמוכות של מחזור cardiomyocyte זהפרוטוקול עושה שימוש זריקות מרובות של edu פני תקופה של 7 ימים. זה גם מאפשר &quot;רודף&quot; של כל מקורות הסלולר הפוטנציאל של דור cardiomyocyte ומתיר כימות של דור גרעיני cardiomyocyte המצטבר במשך פרק זמן זה. בהתאם המחקר, זמן זה עשוי להיות מותאם כדי להתאים את הרמות החזויות של דור cardiomyocyte. עבור כימות מדויק ההתאגדות edu בגרעינים cardiomyocyte, קיים הכרח כי אין תיוג הלא ספציפית של גרעינים עם נוגדנים משני המשמשים לאיתור תגובתיות PCM-1. לכן יהיה זה נבון לבצע ניסויי טיטרציה נוגדנים משני נוספים על מנת לייעל את ההיבט הזה של הפרוטוקול, במיוחד אם נוגדנים משני חוץ מזה הציעו בפרוטוקול זה הוא לשמש. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בביטוי PCM-1 לזהות גרעיני cardiomyocyte. אמנם זה מהווה סמן cardiomyocyte הוקמה, סמנים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי לאמתנתונים; אלה כוללים נוגדנים ספציפיים עבור לב Troponin T אשר זוהה בחלקו מקומי גרעיני cardiomyocyte 1. בדומה לכך, חלבונים מקומיים גרעיניים חלופיים ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת התאגדות edu באוכלוסיות גרעינים אחרות מזה של cardiomyocytes. חשוב כי כל הגרעינים cardiomyocyte כי עוברים פעיל מיטוזה מודרים מן הניתוח, כמו גורלם של סינתזת ה- DNA הזה אינו ידוע ועלול לגרום גם חלוקת התא או ploidy מוגברת. PCM1 הוא מפורק בשלב M של מחזור התא ולכן cardiomyocytes שעברו מיטוזה לא יזוהה על ידי ביטוי PCM1. בנוסף, כל הגרעינים בשלב S של מחזור התא צריך להיות מחוץ לניתוח שלאחר מכן. זו יכולה להיות מושגת על ידי gating את כל הגרעינים בעוצמה DAPI מעל האוכלוסייה 2N כולל אלה עם עוצמת DAPI בין 2N ו 4N אוכלוסיות. למרות זאת הוא יותר ויותרקיבל שהלב את היכולת להחליף cardiomyocytes במהלך הזדקנות נורמלית לבין פגיעה חריפה הבאה, את המקור ואת מידת הפוטנציאל הזה נשאר שנוי במחלוקת. בנוסף, שיעורים מפורד ממחזור cardiomyocyte דווחו 1,7,20-22. זה עשוי להיות בין השאר בשל קשיים טכניים לאתר במדויק וכימות הדור הניאו-cardiomyocyte 19. עד כה רוב המחקרים התבססו רק על השימוש בניתוח היסטולוגית והזיהוי של cardiomyocytes באמצעות ביטוי של חלבונים cytoplasmic, כולל חלבונים של sarcomere, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות 2,4,23,24. השימוש בשיטות אלה כדי לזהות את הביטוי של סמני התפשטות, או כפי שהודגם כאן, השילוב של אנלוגים thymidine יכול לגרום בקלות מזיהוי השגויה של סוגי תאים לבביים אחרים כמו cardiomyocytes. בעוד השימוש הדמיה confocal 3D יכול לעזור כדי להקל על בעיות אלה השיטות אסה יקרות זמן רב. מעניין לציין, כי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים הדור גרעינים-cardiomyocyte ניאו מתרחשת בקצב של 0.17% בשבוע. זה עולה בקנה אחד עם זרימת אחרים cytometry מחקרים המבוססים הוכחת שיעורי תחלופה שבועית של עד 0.13% 5. למרות שזה מפתה להסיק שיעורי מחזור שנתיים על פי נתונים אלו, כמו במחקרים קודמים 2,5,25,26, זו אינה מתאימה כמו ושיעור העזיבה הם דינמיים במהלך זמן חיים של חיה 13. לשיטה זו מספר היישומים הפוטנציאליים כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ושיעורי polyploidization cardiomyocyte.

בשנים האחרונות חלה ולראיות תיגר על ההנחה כי הלב הוא איבר 1,2 הבדיל סופני, שלאחר mitotic. עם זאת, כימות של מחזור cardiomyocyte והתחדשות נותרת מאתגרת. הקשיים בזיהוי דור cardiomyocyte נדיר במדויק תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical סטנדרטיים גם מדווחים 3. בנוסף, מקור הסלולר של דור cardiomyocyte נשאר לא ברור עם ראיות לתרומות על ידי התפשטות cardiomyocyte וכן התמיינות תאי גזע 4-6. לכן, שימוש במודלים התחקות השושלת אשר דורשים ידע של פנוטיפ cardiomyocyte אבי הוא בלתי אפשרי וכימות של התפשטות מאוכלוסיה אחת, כולל שריר הלב, אינו ראוי. יתר על כן cardiomyocyte יש פוטנציאל endoreplication ללא karyokinesis (וכתוצאה מכך המכונית polyploiddiomyocyte) או karyokinesis בהעדר cytokinesis (וכתוצאה מכך cardiomyocyte binucleated) 7,8. כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte תלויה ביכולת להבחין בינם ובין הדור הניאו-cardiomyocyte נכון. זה יוצר סיבוכים ייחודיים משום שכפול הדנ&quot;א וביטוי של קינאזות תלויות ציקלין ב cardiomyocytes לא בלעדי להפגין חלוקת תא נכון 9,10. כדי לסייע כימות של הדור הניאו-cardiomyocyte, יש לנו בשילוב טכניקה בידוד גרעינים הוקמה, וסימון אימונולוגיים של pericentriolar חומר 1 (PCM1) לזיהוי גרעינים cardiomyocyte כפי שתואר על ידי ברגמן et al. 7,11 עם שיטות חדשניות של טווח ארוך תיוג DNA וניתוח ploidy. PCM-1 הוא חלבון centrosome שמצטבר על פני שטח הגרעין של מיוציטים בדיל, הלא אופניים. מחקרים קודמים הראו כי נוגדנים נגדPCM-1 תווית במיוחד גרעינים cardiomyocyte 7,11 וכפי PCM1 נוצל בעבר על ידי מספר קבוצות עצמאיות לזהות 1,12,13 cardiomyocytes כזה. בנוסף, אנו הראינו כי ביטוי PCM1 מפות כדי גרעיני cardiomyocyte שכותרתו גנטית במודל העכבר המהונדס-cre TnT 14 (איור 1 משלים). הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי המדויק ורגיש של דור גרעיני cardiomyocyte ניאו בלב העכבר, ללא קשר המקור התאי (איור 1 א &#39;וב&#39;) תוך הדרת תיוג nucleoside זמנית בשל polyploidization מהניתוח (איור 1 ג ו-ד). אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte אשר נדרש עבור כימות מדויק של מחזור cardiomyocyte. יתר על כן,הוא מספק כלי מיון מהירים להעריך שינויים פוטנציאליים הדינמיקה של דור cardiomyocyte. בעוד תיוג DNA בדרך כלל 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU) כמו אנלוגי thymidine, פרוטוקול המתואר כאן משתמשת assay מבוסס 5 ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) כפי שהוא דורש מדרגות עיבוד פחות עבור יותר מהיר דרך-לשים ואינו דורש denaturing של DNA כדי לאפשר גילוי חיסוני, מה שהופך אותו תואם פרוטוקולי immunostaining אחרים ובכך הגדיל את היישומים במורד הפוטנציאל של השיטה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> איור 1: פועם רציף עם edu תוויות הניאו-cardiomyocytes ללא קשר אבות שלהם. (א) edu הוא שולב DNA של cardiomyocytes בעת חלוקת התא. הפצת נשק באוכלוסייה cardiomyocyte יהיה Result לעלייה, או החלפה של cardiomyocytes ולכן הוא סינתזה של DNA פרודוקטיבי (תורם תחזוקה ותיקון רקמות). (ב) edu הוא שולב DNA של ובתאים לב בעת חלוקת התא. זה יישמר בתא במהלך בידול אל שושלת cardiomyocyte. התמיינות תאי גזע זה תביא גם לעלייה במספר cardiomyocytes ולכן תורמת תחזוקה ותיקון רקמות. (C) cardiomyocytes יש פוטנציאל לעבור &quot;לא פרודוקטיביים&quot; שכפול הדנ&quot;א וכתוצאה מכך ploidy cardiomyocyte גדל, אשר מזוהה עם היפרטרופיה cardiomyocyte שיפוץ שריר הלב, אך אינו מחליף cardiomyocytes האבוד. תהליך polyploidization נבדל binucleation כמו התוצאה היא cardiomyocyte עם גרעינים יחידים אשר מכיל ארבעה או יותר סטים של שני כרומוזומים הומולוגיים (&gt; 2N). (ד) בעקבות p גרעינים רציףulse, פרוטוקול זה מתאר בידוד גרעינים וזיהוי של גרעינים cardiomyocyte ידי ביטוי PCM1 לאפשר כימות של שני ploidy cardiomyocyte ושילוב edu. ביטוי PCM1 ושילוב edu זוהה באמצעות cytometry הזרימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M sucrose</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM magnesium acetate</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM spermine</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PCM-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab&#039;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>cell strainers&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m and 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&amp;rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for section, EdU reaction buffer,&amp;nbsp; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2 step kit,</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>This kit inlcudes&amp;nbsp; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td></tr><tr><td>Probe homogeniser, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor Disposable Probes</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

למרות זאת הוא קיבל את זה בלב יש פוטנציאל מוגבל להתחדש cardiomyocytes בעקבות פציעה וכי רמות נמוכות של מחזור cardiomyocyte להתרחש במהלך הזדקנות נורמלית, כימות של אירועים אלה נותר מאתגר. מדובר בין השאר בשל הנדירות של תהליך והעובדה מקורות תאיים רבים לתרום תחזוקה שריר הלב. יתר על כן, שכפול ה- DNA בתוך cardiomyocytes לעתים קרובות מוביל cardiomyocyte polyploid ורק לעיתים רחוקות מוביל cardiomyocytes חדש על ידי חטיבת הסלולר. כדי לכמת במדויק אפליה מחזור cardiomyocyte בין תהליכים אלה היא חיונית. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיקה תיוג nucleoside לטווח ארוך כדי לתייג כל הגרעינים שהתעוררו כתוצאה גרעינים שכפול דנ&quot;א cardiomyocyte מזוהה על ידי ניצול בידוד הגרעינים ואת immunolabeling PCM1 שלאחר מכן. יחד זה מאפשר זיהוי מדויק ורגיש של תיוג nucleoside של גardiomyocyte אוכלוסיית גרעינים. יתר על כן, 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole תיוג וניתוח ploidy גרעינים, מאפשרת אפליה של גרעינים הניאו-cardiomyocyte מגרעינים אשר שילבו nucleoside במהלך polyploidization. אמנם שיטה זו לא יכולה לשלוט על cardiomyocyte binucleation, היא מאפשרת כימות מהיר ויציב של גרעינים הניאו-cardiomyocyte תוך התחשבות polyploidization. לשיטה זו מספר היישומים במורד זרם כוללים בחינה של הרפוי הפוטנציאלי כדי לשפר התחדשות cardiomyocyte או שבדק את ההשפעה של מחלת לב על מחזור cardiomyocyte ו ploidy. טכניקה זו היא גם תואמת עם טכניקות immunohistological במורד נוספות, המאפשרות כימותי התאגדות nucleoside בכל סוגי תאי הלב.

שיטה זו מאפשרת כימות של התאגדות edu מוגברת בשל חלוקת גרעיני cardiomyocyte תוך פיקוח על polyploidization המוגברת. באמצעות assay מבוסס BrdU, הראינו בעבר כי הלב יונקים מגיב לאובדן cardiomyocyte כרונית, במודל עכבר MDX של ניוון שרירים דושן, עם התחדשות של שריר הלב החדש. השתמשנו בשיטות המתוארות כאן כדי להמשיך ולאמת את הממצאים שלנו שפורסמו וכדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול. על פי הפרוטוקול המתואר; מבוגר (12 בן שבוע) עכברי bl10 MDX ושליטה היו פעמו עם זריקה יומית אחת edu למשך 7 ימים, שדווח בעבר כדי לאפשר ניתוח סטטי בין 5,13 קבוצות ניסוי. ניתוח immunohistological הלבבות פעמו מדגים את הנוכחות של PCM1 להביע cardiomyocytes אשר שילבו edu (איור 3 א). עם זאת, הנתונים שהתקבלו usinיכול להתפרש שלא כהלכה גרם שיטות immunohistological, כמו סוגי תאים אחרים אשר שילבו edu ניתן בטעות כמפר cardiomyocytes. דוגמה לכך באה לידי ביטוי משלים איור 1 א &#39;וב&#39;. זאת ועוד שיטות immunohistological אינן מבחינות polyploidization מחלוקה גרעינית. תזרים cytometry הניתוח המפורט בפרוטוקול זה מאפשר הכימות המהיר של חטיבה הגרעינית cardiomyocyte בעכברי MDX ובקרה, תוך הדרת תאים אשר שלבו edu בשל polyploidization. בדומה נתונים שפורסמו בעבר 13, ניתוח הראה עלייה בשיעורי דור גרעינים הניא-cardiomyocyte בלבבות עכבר MDX לעומת גיל מתאים שולטים (1.2% לעומת 0.17%; איור 3 ו- C). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> איור 3: </strong&gt; כימות edu שכותרתו cardiomyocytes ב wildtype ולבבות MDX. (א) תמונה של תחזיות מחסנית Z שנלקחו 40 מיקרומטר חלקים עבים של לבבות MDX. PCM-1 גרעיני cardiomyocyte להביע (ירוק) אשר מאגד edu (אדום). החץ הצהוב מצביע edu שכותרתו cardiomyocytes. I ו- II מציין הפרט edu שכותרתו cardiomyocytes שמוצג מטוס- Z. גרעינים שכותרתו עם DAPI (כחול) (B ו- C) cytometry זרימה של גרעינים בודדים מראה מגרשים נציג 12-13 בשבוע סוג בר הישן (C57 / BL10) ועכברים MDX (MDX - / y על רקע C57 / BL10). (ב) היסטוגרמה מראה עוצמת DAPI ואפליה בין 2N ו&gt; 2N גרעינים. מגרשים (C) מראים התאגדות edu באוכלוסיית גרעיני 2N cardiomyocyte כאשר נותח כמפורט בפרוטוקול זה. עבור כל העכברים Edu היה מנוהל במשך שבוע 1 מ 12 שבועות של גיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור 1 משלים:. PCM-1 הוא סמן ספציפי עבור גרעיני cardiomyocyte באמצעות הפרוטוקול המתואר גרעינים נותקו מן העכבר המהונדס הכפול המיוצר על ידי חציית TNT-cre עכברים 14 עם קו הכתב הרגיש ROSA NT / NG cre 16. בהפעלת cre העכבר וכתוצאה בשליטת Troponin T האמרגן (TNT) מוביל ביטוי בלתי הפיך של GFP עם הוא מקומי הגרעינים. גרעינים שכותרתו עם שליטת אלוטיפ (ISO) מדגים את היכולת לזהות את אוכלוסיית גרעיני cardiomyocyte להביע GFP (488/530/30-א). תיוג של גרעינים עם אנטי PCM1 (נוגדנים משני זוהו על ידי 633-660 / 20-A) מדגים את מתאם ביטוי PCM1 עם cardiomyocy להביע GFPאוכלוסיית גרעיני te. בדוגמה זו 98.8% של גרעיני cardiomyocyte כפי שהוגדרו על ידי פעילות הפרומוטר TNT, מסומנים על ידי נוגדן PCM1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 1.</a> איור 2 משלים:. אתגרים לכימות חידוש cardiomyocyte ידי טכניקות immunohistological (א) תמונה 2D מציגה שני PCM-1 גרעינים להביע cardiomyocyte (ירוק) אשר נראה להיות מתויג גם עבור edu (אדום). חצים צהובים עולים מה שנראה cardiomyocytes אשר שלב edu. זאת בשל את שיתוף לוקליזציה לכאורה הביטוי PCM1 וסימון edu כאשר דמיינו באמצעות הדמיה 2-מימדית. (ב) היטל 3 ממדים של תמונה זו מזהה את edu שכותרתו תאים אינם cardiomyocytes אבל הם תאים שאינם cardiomyocyte שמעל PCM1 להביע גרעיני cardiomyocyte. C57 / עכברים BL10 לאחר 12 שבועות של גיל המשמשים בניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד איור 2A משלים.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת משלים איור 2B.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> מרכיבי תגובה </td><td colspan="2"> מספר התגובות </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 μl </td><td> 2.19 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מגן נחושת </td><td> 20 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> יזיד picolyl צבע פלואורסצנטי </td><td> 5 μl </td><td> 12.5 μl </td></tr><tr><td> תגובה מדוללתחיץ ערוך 4.1 </td><td> 100 μl </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> עוצמת התגובה סה&quot;כ </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2: edu מרכיב קוקטייל. מתכון קוקטייל תיוג edu הנדרש בפרוטוקול סעיף 4 (איתור התאגדות edu).

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover at JoVE.com

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

simultaneous-assessment-cardiomyocyte-dna-synthesis-ploidy-method-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  Newcastle University. Quantification of cardiomyocyte turnover is challenging. The protocol described here makes an important contribution to this challenge by enabling accurate and sensitive quantification of neo-cardiomyocyte nuclei generation and nuclei ploidy.

Video: Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genetics

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Medicine

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting bona fide heart regeneration limits the validation of potential regenerative factors. One method to detect new cardiomyocytes is multicolor lineage tracing with clonal analysis. Clonal analysis experiments can be difficult to undertake, because labeling conditions that are too sparse lack sensitivity for rare events such as cardiomyocyte proliferation, and diffuse labeling limits the ability to resolve clones. Presented here is a protocol to undertake clonal analysis of the neonatal mouse heart by using statistical modeling of nearest neighbor distributions to resolve cardiomyocyte clones. This approach enables resolution of clones over a range of labeling conditions and provides a robust analytical approach for quantifying cardiomyocyte proliferation and regeneration. This protocol can be adapted to other tissues and can be broadly used to study tissue regeneration.

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח משובט של לב העכבר היילוד באמצעות מידול השכן הקרוב ביותר

Presented here is a protocol for using multicolor lineage tracing and nearest-neighbor modeling to identify clonally derived cardiomyocytes during growth and regeneration in mice. This approach is objective, works across different labeling conditions, and can be adapted to incorporate a variety of image analysis pipelines.

ניתוח משובט של לב העכבר היילוד באמצעות מידול השכן הקרוב ביותר

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Biology

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

ניתוח משובט של לב העכבר היילוד באמצעות מידול השכן הקרוב ביותר

ניתוח משובט של לב העכבר היילוד באמצעות מידול השכן הקרוב ביותר

הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים