This work was supported by the British Heart Foundation, project grant PG/13/69/30454.

Tier Arbeit wurde von der Universität Newcastle Ethics Review Board zugelassen und genehmigt. Alle Tierverfahren wurden über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, um den Richtlinien von der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments durchgeführt entspricht. 1. EdU Verwaltung <ol><li> Auflösen EdU in steriler Kochsalzlösung (0,9% w / v) bei einer Endkonzentration von 12,5 mg / ml. <ol><li> Die Lösung wird auf 40 ° C und Wirbel um vollständig zu lösen. Bewahren Sie genug EdU / Saline bei 4 ° C alle Mäuse in der Studie zu injizieren, so dass für 6 tägliche Injektionen. Hinweis: In der Regel mehr als 6 Mäuse für jede Versuchsgruppe erforderlich sind. Allerdings Leistungsberechnungen sollten für unabhängige Studien durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Wiegen Sie einzelne Mäuse. Berechnen Sie das erforderliche Volumen 100 ug / g EdU / Salzlösung zu jeder Maus (8 ul Lager EdU Lösung pro g) zu verabreichen. </li><li> Zeichnen Sie die entsprechenden volume von EdU / Kochsalzlösung in Insulin-Spritze mit einer 25 G-Nadel. </li><li> Führen Sie intraperitoneale (ip) Injektionen beim Umgang mit Mäusen mit zugelassenen Home Office-Techniken. <ol><li> Legen Sie eine Maus auf den Käfig Deckel. Ziehen Sie vorsichtig an der Basis des Schwanzes zurück und fest mit der Maus durch das Genick fassen. </li><li> Expose den Bauch für die Injektion mit der Maus mit dem Zeigefinger und dem Daumen in der Nähe der Basis des Kopfes halten und kippt den Kopf des Tieres nach hinten auf den Boden. </li><li> Wischen Sie den Bauch mit 70% Alkohollösung. Suchen Sie die Mittellinie des Tieres und unteren rechten Quadranten. Injizieren Sie die EDU / Salzlösung in das Tier in den unteren rechten Quadranten. </li><li> Injizieren von Mäusen mit EdU / Kochsalzlösung und die Tageszeit aufzuzeichnen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.4 an der gleichen Tageszeit, für 6 aufeinander folgenden Tagen. Hinweis: Da ein EdU Negativkontrolle erforderlich ist, die Gating für Durchflusszytometrie-Analyse zu setzen, injizieren ein zusätzliches Alter, Geschlecht und experimentell entsprechened Maus mit einem äquivalenten Volumen von Kochsalzlösung ohne EdU. Dadurch wird die erforderliche Kontrolle (keine EdU Kontrolle). Diese Kontrolle sollte einbezogen werden für jede Studie für Variationen in Chargen von Reagenzien zu ermöglichen und cytometer einzurichten. </li></ol> 2. Ernten Herzen <ol><li> Bei 24 Stunden nach dem 6. EdU Injektion, opfere Mäuse Zervikaldislokation (oder eine alternative Liste 1 Home Office genehmigt Methode). </li><li> Legen geopfert Tier in Rückenlage und machen Hautschnitt aus der Mitte des Bauches auf die Membran mit einer chirurgischen Schere. </li><li> Schneiden Sie das Zwerchfell, und Halten des Brustbeins weg von der Körperhöhle, schneiden bilateral das Herz aussetzen. </li><li> Heben Sie das Herz leicht und schneiden Sie die großen Blutgefäße des Ausflusstraktes das Herz aus der Brusthöhle zu sezieren. </li><li> Unmittelbar jedes Herz platzieren zu einem einzelnen 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml PBS auf 4 ° C gekühlt. </li><li> Übertragen Herzen separate 10 cm Petrischalen, mit einem Skalpell jedes Herz in zwei Teile geschnitten in einer sagittalen Ausrichtung und waschen Sie das Herz, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette zusammendrücken. Dann ersetzen Sie die PBS so viel Blut wie möglich zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Legen Sie beide Teile jedes Herz in demselben Individuum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Weiter zu Schritt 3 oder alternativ speichern Proben -80 ° C wie in den Schritten detailliert 2.9 und 2.10. </li><li> Unter Verwendung einer 25 G Nadel, stellen ein kleines Loch in dem Mikrozentrifugenröhrchen Deckel, den Deckel von der Öffnung auf die Ausdehnung von Gasen durch zu verhindern, wenn das Herz verarbeitet wird. </li><li> Beschriften Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen und in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff einzufrieren. </li></ol> 3. Nuclei Dissoziation und Cardiomyocyte Nuclei Labeling Hinweis: Diese Kerne Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Kennzeichnung von der Bergmann et al angepasst ist 11 Führen Sie dieses Verfahren auf allen injizierten Proben.mit EdU und injizierten Salzlösung (keine EdU Kontrolle) negative Kontrolle. Siehe Tabelle 1 für das Rezept von Lösungen zur Durchführung dieser Schritte erforderlich. <ol><li> Für jeden Herz analysiert werden, legen 36 ml 1% BSA / PBS-Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen, für 30 min inkubieren, um die Lösung zu verwerfen und dann an der Luft trocknen. Hinweis: Dieses Rohr in Schritt 3.6 verwendet wird. </li><li> Legen Sie einzelne gefrorenen Herzen auf eine 10-mm-Schale auf Eis und Hackfleisch mit einem Skalpell so dass das Herz während des Zerkleinerungs- Prozess auftauen. </li><li> Platzieren gehacktem Herzen in 15 ml of Cell Lysis Buffer in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und homogenisieren mit einer Sonde Homogenisator für 15 Sekunden bei 25.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> In weitere 15 ml Zell-Lysepuffer in die Zentrifugenröhrchen und in ein 40 ml Dounce mit einem großen Freiraum Stößel. Führen Sie 10 Schläge mit dem Stößel und filtriert über ein 100 um dann 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge für 10 min eint 700 × g bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren Kernpellet in 25 ml Saccharose-Gradienten-Lösung und die Schicht hergestellt, um die Zellkerne enthaltenden Lösung auf die Oberseite von 10 ml frischem Saccharosegradienten Lösung in dem Röhrchen Ultrazentrifuge in 3.1. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 1 Stunde bei 4 ° C einer Ausschwingzeit Rohr Rotor verwendet wird. </li><li> Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und die Kerne resuspendieren Pellet in 1300 &amp; mgr; l der Zellkerne Speicherpuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Etiketten PCM1. </li><li> Entfernen Sie 300 ul der Suspension auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 700 ul frischen Kerne Speicherpuffer. Beschriften Sie diese Röhre als ISO-Steuerung. </li><li> Hinzufügen anti-PCM1 bei einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem PCM1 und Kaninchen-IgG-Isotyp-Kontrollantikörper bei einer Konzentration von 8 &amp; mgr; g / ml an den Mikrozentrifugenröhrchen markiertem ISO Steuerung hinzuzufügen. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Nach incubation, Zentrifuge bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen, mit 1 ml frischem min bei 700 x g für 10 Kerne Speicherpuffer, resuspendieren und Zentrifuge wieder ersetzen. Überstand verwerfen und ersetzen mit 1 ml frischem Kerne Speicherpuffer. </li><li> 1 &amp; mgr; l F (ab &#39;) 2 Fragment Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) Antikörper (FITC oder äquivalente grün fluoreszierenden Farbstoff) zu einer Endkonzentration von 2 ug / ml zu erreichen. Anmerkung: Die Verwendung eines F (ab &#39;) 2-Fragment-Antikörper verringert das Potential für nicht-spezifische Markierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen und B-Zellen. </li><li> Wrap Rohre in Aluminiumfolie vor Licht zu schützen und für 1 Stunde bei 4 ° C inkubieren. </li></ol> 4. Nachweis von EdU Incorporation <ol><li> Dilute 10x konzentriert EdU Reaktionspuffer im Verhältnis 1:10 mit VE-Wasser. </li><li> Zentrifugieren Sie die PCM-1 und ISO-Steuerung markierten Kerne Suspensionen bei 700 × g für 10 min, den Überstand verwerfen und das Pellet-Kerne in 1 ml1% BSA / PBS-Lösung. Waschen Sie die Kerne Pellet zweimal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, den Überstand verwerfen und ersetzen mit 100 ul EdU Fixiermittel. </li><li> Wickeln Rohre in Aluminiumfolie vom Licht geschützt und bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 ml 1% BSA / PBS-Lösung, Zentrifugation bei 700 xg und inkubiere mit 1x Saponin basierenden Permeabilisierung Lösung bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Bereiten Sie 1x EdU Kennzeichnung Cocktail (Tabelle 2). Ein Minimum von 2 Reaktionen werden benötigt, die keine EdU Kontrolle aufzunehmen. </li><li> Hinzufügen 500 ul 1x EdU Markierungscocktail direkt bereits zu jeder Probe Kerne in 100 ul 1x Saponin basierenden Permeabilisierung enthaltenden Lösung und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Zentrifuge bei 700 xg und Resuspendieren in 1 ml 1% BSA / PBS und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. </li><li> Zentrifuge bei 700 xg, Überstand verwerfen und ersetzen mit 400 &amp; mgr; l DNA - Färbelösung (siehe Tabelle der Materialien). </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Benennen des Reagens </td></tr><tr><td> 1. Zell - Lysepuffer </td></tr><tr><td> 0,32 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 2,0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 2.Sucrose Gradient - Lösung </td></tr><tr><td> 2,1 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM Magnesiumacetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 3. Nuclei Speicherpuffer (NSB) </td></tr><tr><td> 0,44 M Saccharose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM Spermin </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Nuclei Isolationspuffer Zutaten Rezept für alle verwendeten Puffer in Protokollabschnitt 3 (Nuclei Dissoziation und Kardiomyozyten Kerne Markierung).. 5. Analyse über Durchflusszytometrie Hinweis: Führen Sie Durchflusszytometrie auf isolierten Kernen wie zuvor beschrieben 7,11,15. <ol><li> Erstellen Sie zunächst eine Handlung beschreibt Forward Scatter (FSC) und Seitenstreuung (SSC) , um die Diskriminierung von Kernen aus Schutt (2A) zu ermöglichen. </li><li> Erstellen Sie ein Grundstück zu einzelnen Kerne aus Aggregaten (2B) unterscheiden durch Auftragen 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) (DAPI) Bereich (3-405 / 450/50 A) im Vergleich zu der Höhe (33-405 / 450 / 50-H). Stellen Sie sicher, that die 3-405 / 450/50-A-Signal auf der linearen Skala gesammelt wird, um die korrekte Bestimmung des DNA-Gehalts zu ermöglichen. </li><li> Erstellen Sie eine Handlung beschreibt, 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC und zeigt nur Ereignisse aus dem Singulett-Gate in 5.2 geschaffen, um PCM-1-Expression in den Singulett-Population zu beurteilen. </li><li> Führen Sie die Isotypkontrollreagenzien Probe um ein PCM-1 positive Gate (2C) zu etablieren. Führen Sie eine kleine Menge von PCM1 Probe markiert, um die PCM1 exprimierenden Population und Gating-Position zu überprüfen. </li><li> Erstellen Sie einen Plan beschreibt SSC-A vs 405/450/50-A (zu erkennen DAPI). In diesem Plot, nur Anzeige PCM1 exprimierenden Zellkerne Singulett, unter Verwendung der in 5.3 erstellt Tore. Verwenden Sie dieses Grundstück ein zusätzliches hierarchal Tor zu erzeugen , die nur 2N Kerne (2D) enthält. </li><li> Erstellen Sie ein Plot, der 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20 A beschreibt die Identifizierung von EdU Kennzeichnung des PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten Bevölkerung zu ermöglichen. Anzeige nur Kerne, die Singulett sind, P<html> CM1 + und 2N die obige Gating. </li><li> Führen Sie Herz Probe von keiner EdU Kontrolle , um den EdU positiven Gate (Abbildung 2E). Erstellen Sie die entsprechende Tor für EdU + Zellen. </li><li> Die Bilanz und zu quantifizieren, Singulett, PCM-1 exprimieren, 2N Kerne, die EdU eingebaut haben. </li><li> Berechnen Sie diese Bevölkerung als Prozentsatz des Gesamt Singulett, PCM1 + Kerne. Dies wird die Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation, während der 7 Tage EdU Pulsperiode, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten cardiomyocyte Kerne bereitzustellen. Hinweis: Da DAPI zur DNA-Bindung stöchiometrisch ist die Fluoreszenzintensität mit der Menge an DNA proportional ist. Ploidie bestimmen basierend auf der Intensität von 405/450/50 A - Signal, wie vorher 7 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie die Ploidie in der gesamten Kardiomyozyten Bevölkerung zu bewerten Strategie die Handlung etabliert in 5.5 und einer Gating basierend auf DNA - Konzentration 7. </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2:. Gating - Strategie Kardiomyozyten EdU Einbau und Ploidie zu quantifizieren (A) Nuclei aus Schutt diskriminiert basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC). (B) ein lineares Gate angelegt und der Singulett - Keimpopulation beruht auf DAPI Kennzeichnung identifiziert und die Höhe 405/450/50 vs Bereichssignal. (C) Fluorescent Gating erlaubt die Trennung von Kardiomyozyten Kerne (PCM-1-positiv) und nicht-Kardiomyozyten (PCM-1-negativ) Zellkerne von Herzgewebe. (D) Die Intensität des DAPI - Signal wird verwendet , um DNA - Konzentration zu bestimmen und dadurch Kerne Ploidie der PCM1 + Kardiomyozyten Bevölkerung. In Maus&gt; 80% der Kardiomyozyten Kerne sind diploiden (2n). (E) Fluorescent Gating ermöglicht die Trennung von 2N, Kardiomyozyten Kerne , die EDU (PCM + / EDU + = 0,9%) aus 2N eingebaut haben, Kardiomyozyten , die EdU nicht integriert haben (PCM + Edu-). Alle Schritte werden in dem Protokoll 5.0 beschrieben. Beispiel von MDX gezeigt -. / Y Mäuse auf dem C57 / BL10 Hintergrund <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Zur Quantifizierung genau Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration Tests müssen zwischen echten Kardiomyozyten Generation und unproduktiven DNA Teilung unterscheiden. Viele Studien weiterhin einfach diese unproduktiven Ereignisse ignorieren, Kardiomyozyten Proliferation Quantifizierung ausschließlich über die Expression von Cyclin kinesis und Zellzyklus-Marker. Um eine einzelne Methode Datum, das die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz ermöglicht, während für diese unproduktiven Ereignisse Steuerung bleibt allusive. Insbesondere bleibt es schwierig für Kardiomyozyten Polyploidisierung zu berücksichtigen , die 13 bis ~ 65% der Kardiomyozyten DNA - Replikation trägt auf. Daher sind in der genauen Quantifizierung von Kardiomyozyten Generation zu unterstützen wir ein Protokoll entwickelt, das die robuste Quantifizierung der Raten von neo Kardiomyozyten Kerne erlaubt, während die DNA-Replikation ohne die erhöhte Ploidie führt. Obwohl dieses Protokoll keine Diskriminierung zwischen neo-Kardiomyozyten Gattungention und Kardiomyozyten bi-Nukleation, kann sie schnell eingesetzt werden und genau die obere Grenze (Bilanzierung von Ploidie) von Kardiomyozyten Generation berechnen. Dieses Protokoll stellt daher ein Screening-Tool zu möglichen Veränderungen in den Raten von Kardiomyozyten Generation und Polyploidisierung in Krankheitsmodellen zu bewerten oder das Potenzial, die Effizienz von Therapeutika zu bewerten. Sobald Änderungen in der Rate der neo-Kardiomyozyten Kerne Generation identifiziert werden unter Verwendung dieses Protokolls können nachfolgenden Studien verwendet werden , um festzustellen , ob dies aufgrund von Änderungen in Kardiomyozyten Erzeugung von Kardiomyozyten Nukleation Nummer, wie zuvor beschrieben 2,13,17,18. Dazu gehört die Verwendung von histologischen Quantifizierung Kardiomyozyten Nukleation Dynamik während der Pulsperiode oder Analysen von Gewebeschnitten, die aus EdU gepulsten Tiere in EdU Einarbeitung in die einkernigen und mehrkernigen Kardiomyozyten Populationen zu vergleichen. Aufgrund der geringen Mengen an Kardiomyozyten Umsatz dieserProtokoll verwendet mehrere Injektionen von EdU über einen Zeitraum von 7 Tagen. Dies ermöglicht auch die aller potentiellen zellulären Quellen von Kardiomyozyten generation &quot;jagen&quot; und ermöglicht die Quantifizierung der kumulativen cardiomyocyte Kerne Generation über diesen Zeitraum. Je nach Studie kann dieser Zeitraum eingestellt werden, um die vorhergesagten Niveaus der Kardiomyozyten Generation gerecht zu werden. Für die genaue Quantifizierung von EdU Inkorporation in Kardiomyozyten Kerne, ist es unerlässlich, dass es keine nicht-spezifische Markierung der Kerne mit dem sekundären Antikörper verwendet werden, um PCM-1 Reaktivität nachzuweisen. Es wäre daher sinnvoll sein, zusätzliche sekundäre Antikörper Titrationsexperimente durchzuführen, um diesen Aspekt des Protokolls zu optimieren, insbesondere, wenn ein sekundärer Antikörper anders als das vorgeschlagen in diesem Protokoll verwendet werden soll. Das hier beschriebene Protokoll verwendet PCM-1-Expression cardiomyocyte Kerne zu identifizieren. Während dies eine etablierte Kardiomyozyten Marker ist, können alternative Marker verwendet werden, um zu überprüfen,Daten; Dazu gehören Antikörper , die spezifisch für die kardiale Troponin T , die als teilweise in Kardiomyozyten Kerne 1 lokalisiert identifiziert wurde. In ähnlicher Weise alternative Kern lokalisierte Proteine ​​verwendet werden können EdU Inkorporation in Kerne Populationen andere als die der Kardiomyozyten zu identifizieren und zu quantifizieren. Es ist wichtig, dass alle cardiomyocyte Kerne, die aktive Mitose durchlaufen werden von der Analyse ausgeschlossen, da das Schicksal dieses DNA-Synthese bekannt ist, und kann zu entweder der Zellteilung oder erhöhte Ploidie. PCM1 wird deshalb durch Mitose PCM1 Expression nicht Kardiomyozyten läuft während der M-Phase des Zellzyklus zerlegt identifiziert werden. Darüber hinaus werden alle Kerne in der S-Phase des Zellzyklus sollte eine nachfolgende Analyse ausgeschlossen werden. Dies kann durch die Ausblendung aller Kerne mit DAPI Intensität oberhalb der 2N Bevölkerung einschließlich derjenigen mit einer DAPI Intensität zwischen 2N und 4N Populationen erreicht werden. Obwohl es zunehmendangenommen, dass das Herz die Fähigkeit Kardiomyozyten während der normalen Alterung und nach einer akuten Verletzung zu ersetzen hat, bleibt die Quelle und das Ausmaß dieses Potential umstritten. Darüber hinaus haben unterschiedliche Raten von Kardiomyozyten Umsatz wurde 1,7,20-22 berichtet. Dies kann aufgrund der Schwierigkeiten teil werden in genau der Identifizierung und Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation 19. Bis heute wurden die meisten Studien stützte sich nur auf die Verwendung von histologischen Analyse und die Identifizierung von Kardiomyozyten über die Expression von cytoplasmatischen Proteinen, einschließlich Proteine ​​des Sarkomers, für die Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Erneuerung 2,4,23,24. Die Verwendung dieser Methoden, um die Expression von Proliferationsmarker zu detektieren, oder wie hier gezeigt, kann der Einbau von Thymidin-Analoga leicht in der Fehlidentifizierung von anderen kardialen Zelltypen wie Kardiomyozyten führen. Während die Verwendung von bildgebenden 3D-konfokalen kann diese Probleme zu lindern helfen these Methoden sind teuer und zeitraubend. Interessanterweise beschrieben das Protokoll hier demonstriert neo-Kardiomyozyten Kerne Generation mit einer Rate von 0,17% erfolgt pro Woche. Dies steht im Einklang mit anderen Durchflusszytometrie basierte Studien , die zeigen Wochenumsatz von bis zu 0,13% 5. Obwohl es verlockend ist jährlichen Umsatzraten zur Extrapolation auf der Grundlage dieser Daten, wie es in früheren Studien 2,5,25,26, das ist unangemessen , da die Preise des Umsatzes während ihres Lebenszyklus eines Tieres 13 dynamisch sind. Dieses Verfahren hat eine Reihe von möglichen Anwendungen, einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und die Raten der Kardiomyozyten Polyploidisierung zu verbessern.

In den letzten Jahren hat es eine Ansammlung von Beweisen Anfechtung der Annahme gegeben , dass das Herz eine terminal differenzierte, post-mitotischen organ 1,2 ist. Allerdings Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz und Regeneration bleibt eine Herausforderung. Die Schwierigkeiten bei der genauen selten Kardiomyozyten Generation unter Verwendung von Standard immunhistochemischen Techniken zu identifizieren sind gut 3 berichtet. Darüber hinaus bleibt die zelluläre Quelle der Kardiomyozyten Generation unsicher mit Beweis für Beiträge von Kardiomyozyten Proliferation sowie durch Stammzelldifferenzierung 4-6. Daher ist die Verwendung von lineage Verfolgungsmodelle Kenntnis der Kardiomyozyten-Vorläufer Phänotyps erforderlich ist unmöglich, und die Quantifizierung der Proliferation in einer Population, einschließlich Kardiomyozyten, ungeeignet ist. Weiterhin ist ein cardiomyocyte das Potential für Endoreplikation ohne karyokinesis hat (was zu einer polyploiden Autodiomyocyte) oder karyokinesis in Abwesenheit von Zytokinese (was zu einem zweikerniger cardiomyocyte) 7,8. Die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz hängt von der Fähigkeit zwischen diesen Ereignissen und wahre neo-Kardiomyozyten Generation zu unterscheiden. Dies schafft einzigartige Komplikationen , da die DNA - Replikation und Expression von Cyclin-abhängigen Kinasen in Kardiomyozyten nicht ausschließlich wahr Zelle zeigen Teilung 9,10. Zur Unterstützung bei der Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Generation haben wir eine etablierte Zellkerne Isolationstechnik und immunologische Markierung von pericentriolar Material 1 (PCM1) für Kardiomyozyten Kerne Identifizierung kombiniert , wie von Bergmann et al. 7,11 mit neuartigen Verfahren der langfristigen DNA-Markierung und Ploidie-Analyse. PCM-1 ist ein Zentrosomen Protein, das an der Kernfläche der differenzierten, nicht-teil Myozyten ansammelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Antikörper demonstriert gegenPCM-1 kennzeichnen spezifisch cardiomyocyte Kerne 7,11 und als solche PCM1 durch eine Anzahl von unabhängigen Gruppen verwendet wurde Kardiomyozyten 1,12,13 zu identifizieren. Darüber hinaus haben wir gezeigt , dass PCM1 Ausdruck zuordnet genetisch markierten Kardiomyozyten Kerne in der TnT-cre transgenes Mausmodell 14 (Supplementary Abbildung 1). Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue und empfindliche Identifizierung von neo cardiomyocyte Kerne Erzeugung im Mäuseherz, unabhängig von den zellulären Ursprung (1A und B) , während gleichzeitig Nukleosid Kennzeichnung ohne aufgrund Polyploidisierung aus der Analyse (Abbildung 1C und D). Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne, die für die genaue Quantifizierung von Kardiomyozyten Umsatz erforderlich ist. Außerdem,es stellt ein schnelles Screening-Tool mögliche Veränderungen in der Dynamik der Kardiomyozyten Generation zu bewerten. Während DNA-Markierung in der Regel 5-Bromo-2&#39;-desoxyuridin (BrdU) als das Thymidin-Analogon beschriebene Protokoll verwendet hier einen 5-ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EDU) basierenden Assay, da es weniger Verarbeitungsschritte für einen rascheren erfordert Durchsatz und erfordert nicht für Immun-Detektion der DNA-Denaturierung es kompatibel mit anderen immunostaining Protokolle zu machen und dadurch die möglichen nachgelagerten Anwendungen des Verfahrens zu erhöhen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> Abbildung 1: Kontinuierliche Pulsieren mit EdU Etiketten neo-Kardiomyozyten unabhängig von ihrer Vorläufern. (A) EdU wird in die DNA von Kardiomyozyten während der Zellteilung einbezogen. Proliferation in der Kardiomyozyten Bevölkerung Result in einer Erhöhung oder Ersatz von Kardiomyozyten und ist deshalb produktiver DNA-Synthese (trägt zur Gewebe Wartung und Reparatur). (B) EdU wird in die DNA von Herzvorläuferzellen während der Zellteilung einbezogen. Dies wird in der Zelle während der Differenzierung in die Kardiomyozyten lineage beibehalten werden. Diese Stammzelldifferenzierung wird auch in einer Erhöhung der Anzahl von Kardiomyozyten führen und trägt daher zur Gewebe Wartung und Reparatur. (C) Kardiomyozyten haben das Potenzial , &quot;nicht-produktive&quot; DNA - Replikation zu unterziehen , zu einer erhöhten Kardiomyozyten Ploidie führt, die mit Kardiomyozytenhypertrophie und das myokardiale Remodeling assoziiert ist, ersetzt aber nicht verloren Kardiomyozyten. Der Prozess der Polyploidisierung unterscheidet sich von binucleation wie es in einem Kardiomyozyten mit einem einzelnen Kernen führt, die vier oder mehr Sätze von zwei homologen Chromosomen enthalten (&gt; 2N). (D) Nach einem kontinuierlichen Kerne pUlse Dieses Protokoll beschreibt Kerne Isolierung und Identifizierung der Kardiomyozyten Kerne durch PCM1 Ausdruck Quantifizierung sowohl Kardiomyozyten Ploidie und EdU Einbau zu ermöglichen. PCM1 - Expression und EdU Einverleibung Durchflusszytometrie detektiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2038">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:501px;">0.32 M sucrose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">84100</td>
			<td style="width:1156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c5086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mM magnesium acetate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M-5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mM EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mM EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mM DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 mM KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mM MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mM spermine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotype rabbit IgG- ChIP Grade</td>
			<td>abcam</td>
			<td>abc7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-PCM-1 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">HPA023374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 F(ab&#39;)2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell strainers&#160; 70 &#956;m and 100&#956;m&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11597522, 11517532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10634</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for section, EdU reaction buffer,&#160; EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyStain DNA 2 step kit,</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>05 5005</td>
			<td>This kit inlcudes&#160; reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe homogeniser e.g. TissueRuptor&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueRuptor Disposable Probes</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:267px;">990890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ultracentrifuge</td>
			<td>Sorvall&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Facscanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous assessment of cardiomyocyte dna synthesis and ploidy: a method to assist quantification of cardiomyocyte regeneration and turnover

Obwohl es angenommen wird, dass das Herz ein begrenztes Potential hat Kardiomyozyten nach Verletzungen und dass niedrige cardiomyocyte Umsatz treten während der normalen Alterung, Quantifizierung dieser Ereignisse zu regenerieren bleibt eine Herausforderung. Dies wird teilweise aufgrund der Seltenheit des Verfahrens und der Tatsache, dass mehrere Zellquellen myocardial Wartung beizutragen. Darüber hinaus innerhalb Kardiomyozyten DNA Vervielfältigung führt oft zu einer polyploid Kardiomyozyten und führt nur selten zu neuen Kardiomyozyten durch Zellteilung. Um zu genau Kardiomyozyten Umsatz Unterscheidung zwischen diesen Prozessen zu quantifizieren wesentlich. Das hier beschriebene Protokoll verwendet Langzeit Nukleosid Kennzeichnung, um alle Kerne zu bezeichnen, die durch die Verwendung von Kernen Isolierung und anschließende PCM1 Immunmarkierung identifiziert als Ergebnis der DNA-Replikation und Kardiomyozyten Kerne entstanden sind. Zusammen ermöglicht dies eine genaue und empfindliche Identifizierung der Nukleosid Kennzeichnung des cardiomyocyte Keimpopulation. Weiterhin, 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol Markierung und Analyse von Kernen Ploidie, ermöglicht die Unterscheidung von neo-Kardiomyozyten Kerne aus Kernen, die während Polyploidisierung Nukleosid eingebaut haben. Obwohl dieses Verfahren nicht für Kardiomyozyten binucleation steuern kann, ermöglicht es, eine schnelle und robuste Quantifizierung von neo-Kardiomyozyten Kerne während für Polyploidisierung ausmacht. Dieses Verfahren hat eine Anzahl von Downstream-Anwendungen einschließlich der potenziellen Therapeutika Beurteilung cardiomyocyte Regeneration oder die Untersuchung der Wirkungen von Herzerkrankungen auf Kardiomyozyten Umsatz und Ploidie zu erhöhen. Diese Technik ist auch kompatibel mit zusätzlichen nachgeschalteten immunhistologische Techniken, so dass die Quantifizierung von Nukleosid-Inkorporation in allen kardialen Zelltypen.

Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung von erhöhten EdU Inkorporation aufgrund cardiomyocyte Kerne Teilung während für erhöhte Polyploidisierung steuern. Unter Verwendung eines BrdU basierten Assays, wir haben bereits gezeigt , dass das Säugetier-Herz reagiert auf chronische Kardiomyozyten Verlust, in der MDX - Maus - Modell der Duchenne - Muskeldystrophie, mit der Regeneration der neuen Kardiomyozyten. Wir haben die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um unsere veröffentlichten Ergebnisse validieren und die Nützlichkeit des Protokolls zu demonstrieren. Gemäß dem Protokoll beschrieben; Erwachsener (12 Wochen alt) MDX und Kontrolle BL10 Mäuse mit einer täglichen Injektion von EdU für 7 Tage gepulst wurden, berichtete zuvor 5,13 statisch Analyse zwischen experimentellen Gruppen zu ermöglichen. Immunhistologische Analyse gepulster Herzen zeigt die Anwesenheit von PCM1 exprimierenden Kardiomyozyten , die EDU (3A) eingearbeitet haben. Jedoch usin die erhaltenen Dateng immunhistologischen Methoden können falsch interpretiert werden, als andere Zelltypen, die EdU integriert haben können als Kardiomyozyten falsch identifiziert werden. Ein Beispiel hierfür ist in Ergänzungs 1A und B gezeigt. Außerdem immunhistologische Methoden unterscheiden nicht Polyploidisierung von Kernteilung. Die Durchflusszytometrie Analyse in diesem Protokoll detailliert ermöglicht die schnelle Quantifizierung von Kardiomyozyten Kernteilung in MDX und Kontrollmäuse, während ohne Zellen , die EdU aufgenommen hatte aufgrund Polyploidisierung. Ähnlich wie bei den zuvor veröffentlichten Daten 13, die Analyse ergab einen Anstieg der Preise von neo-Kardiomyozyten Kerne Generation in der MDX - Mäuseherzen im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollgruppe (1,2% im Vergleich zu 0,17%; 3B und C). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> Figur 3: </strong&gt; Die Quantifizierung von EdU markierten Kardiomyozyten in Wildtyp- und MDX - Herzen. (A) Bild von 40 &amp; mgr; m dicke Abschnitte von MDX Herzen genommen Z-Stack - Projektionen. PCM-1-exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün), die EDU (rot) aufgenommen hat. Gelber Pfeil zeigt EdU Kardiomyozyten markiert. i und ii anzeigt einzelnen EdU Kardiomyozyten gezeigt in der Z-Ebene bezeichnet. Nuclei markiert mit DAPI (blau) (B und C) Durchflusszytometrie von isolierten Kernen zeigt repräsentativen Parzellen von 12 bis 13 Wochen alten Wildtyp (C57 / BL10) und mdx - Mäusen (MDX - / y auf dem C57 / BL10 Hintergrund). (B) Histogramm zeigt DAPI Intensität und Diskriminierung zwischen 2 N und&gt; 2 N Kernen. (C) Plots zeigt EdU Einbau in den 2N Kardiomyozyten Keimpopulation , wenn sie in diesem Protokoll so detailliert analysiert. Für alle Mäuse wurde Edu für 1 Woche ab 1 verabreichtAlter von 2 Wochen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ergänzende Abb . 1: PCM-1 ist ein spezifischer Marker für Kardiomyozyten Kerne unter Verwendung des Protokolls beschriebenen Kerne aus der doppelt transgenen Maus durch Kreuzung TNT-cre Mäusen isoliert wurden 14 mit dem ROSA nT / nG cre - sensitives Reporterlinie 16. In der resultierenden Maus cre Aktivierung unter der Kontrolle von Troponin T (TNT) Promotor führt zu irreversiblen Expression von GFP mit den Kernen lokalisiert ist. Nuclei, markiert mit Isotypkontrollreagenzien (Iso) zeigt die Fähigkeit der GFP exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation (488/530/30-A) zu identifizieren. Die Markierung von Kernen mit anti-PCM1 (sekundärer Antikörper nachgewiesen durch 633-660 / 20-A) zeigt die Korrelation von PCM1 Ausdruck mit dem GFP-exprimierenden cardiomyocyte Keimpopulation. In diesem Beispiel 98,8% der Kardiomyozyten Kerne wie durch TNT Promotoraktivität identifiziert, durch PCM1 Antikörper markiert sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 1 zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">.</a> Ergänzende Abbildung 2:. Herausforderungen für die durch immunhistologische Techniken Kardiomyozyten Erneuerung Quantifizierung (A) 2D - Bild zeigt zwei PCM-1 - exprimierenden Kardiomyozyten Kernen (grün) , die auch für EdU (rot) markiert angezeigt werden. Gelbe Pfeile zeigen an, was Kardiomyozyten zu sein scheint, die EdU integriert haben. Dies ist aufgrund der scheinbaren Kolokalisation von PCM1 Expression und EdU Kennzeichnung wenn 2-dimentional Bildgebung sichtbar gemacht werden. (B) Ein 3-dimensionale Projektion dieses Bildes identifiziert die EdU markierten Zellen nicht Kardiomyozyten sind aber sind nicht-Kardiomyozyten Zellen PC überlagerndenM1 zum Ausdruck Kardiomyozyten Kerne. C57 / BL10 - Mäuse im Alter von 12 Wochen für Experimente verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 2A zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">Bitte hier klicken Ergänzender 2B zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaktionskomponenten </td><td colspan="2"> Anzahl der Reaktionen </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875 &amp; mgr; l </td><td> 2,19 ml </td></tr><tr><td> Copper protectant </td><td> 20 ul </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Fluoreszenzfarbstoff Picolylgruppe Azid </td><td> 5 ul </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Verwässertes Reaktion-Puffer in 4.1 </td><td> 100 ul </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Die gesamte Reaktionsvolumen </td><td> 1 ml </td><td> 2,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: EdU Cocktail Zutaten. Rezept für EdU Kennzeichnung Cocktail in Protokollabschnitt 4 (Nachweis von EdU-Einbau) erforderlich.

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Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

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During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

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An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...