This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. ADN biotinilación <ol><li> La biotinilación de ADN de extremos romos usando transferasa terminal (TdT) Nota: El uso de ADN T4 (166 kpb), que es un ADN de extremos romos. <ol><li> Añadir 5 l de 2,5 mM CoCl 2, 5 l de 10 x tampón de reacción, 0,5 l de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 l de transferasa terminal (10 unidades), y 0,5 l de ADN T4 (0,5 g / l) a la mezcla de reacción. Hacer a un volumen final de 50 l mediante la adición de 38,5 l de agua. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hr. Nota: el tiempo de reacción extendido puede producir ADN de doble atado, es decir, es posible que biotinas etiquetados en ambos extremos. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Mantenga el tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> La biotinilación de DNA de composición pegajosa Uso de ADN ligasa Nota: El uso λ DNA (48,5 kpb), que es un ADN de extremo cohesivo. &lt;ol&gt; <li> Añadir 1 l de ADN ligasa de T4, 5 l de 10 x tampón de ligación, 1 l de 25 ng / l de ADN de fago λ, y añadir 43 l de agua para hacer un volumen final de 50 l. </li><li> Mantenga el tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. La derivación de superficie funcionalizado Nota:. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en la superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1 Este proceso PEGilación es importante para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente el ruido aleatorio creado por la unión de moléculas no deseadas en la superficie. <ol><li> Piranha limpieza Nota: Las soluciones Piranha reaccionan violentamente con materiales orgánicos, por lo que debe ser manejado con cuidado, siguiendo las directrices de seguridad adecuadas. <ol><li> Lugar cubreobjetos sobre una rejilla de politetrafluoroetileno (PTFE), y los mantienen by cinta de PTFE sello de rosca a lo largo, la mitad en el borde de las superficies y la otra mitad en el estante. Después de envolver, deje una pieza larga (~ 5 cm) de cinta para el manejo del soporte durante el procedimiento de limpieza. </li><li> Llenar un vaso de vidrio de 1 litro con 350 ml de H 2 SO 4 y 150 ml de H 2 O 2 para hacer la solución piraña en una campana de humos. Coloque la parrilla en solución Piranha durante 2 horas. </li><li> solución vacío piraña del vaso de precipitados, y cubreobjetos de enjuague a fondo con agua desionizada hasta que el pH del agua en el vaso alcanza neutro. Utilice tiras de papel de pH. </li><li> Sonicar los bastidores de cubierta se desliza en el agua vaso de precipitados que contiene, por 30 min. Vaciar el agua del vaso justo antes de amino silanización. Utilice 75 W de potencia de ultrasonidos para limpiar y derivar los sustratos de vidrio. </li></ol></li><li> Aminosilanization sobre la superficie de cristal <ol><li> Añadir 2 ml de N - [3- (trimetoxisilil) propil] etilendiamina y 10 ml de ácido acético glacial a 200 mlde alcohol metílico en un recipiente de polipropileno limpio para la preparación de la solución aminosilanization. </li><li> Colocar cubreobjetos limpios en el recipiente de polipropileno. Agitar ellos en 100 rpm y la temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Someter a ultrasonidos el vaso con cubreobjetos derivatizados durante 15 min a 75 W. los agita a 100 rpm y la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. </li><li> Vaciar la solución del vaso de precipitados, y enjuague cubreobjetos con cuidado, una vez con alcohol metílico, y dos veces con alcohol etílico. cubreobjetos de las tiendas en alcohol etílico y los utilizan dentro de dos semanas. </li></ol></li><li> PEGilación del cubreobjetos <ol><li> Hacer 10 ml de bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO 3). Se filtra la solución con un filtro de jeringa de 0,22-micras. </li><li> Disolver 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidilo (biotina-PEG-SC) y 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) en 350 l de NaHCO3. Use un tubo de protección de la luz. </li><li> Vortex el tubo vigorosamente durante 10 seg, y se centrifuga al 10.000 × g durante 1 min para eliminar las burbujas. </li><li> Enjuague un portaobjetos de vidrio con acetona, seguido de un enjuague con alcohol etílico. Deje que el portaobjetos se seque al aire completamente. </li><li> Coloque una gota (50 l) de la solución de PEG en el portaobjetos de vidrio limpio. Cubrir la gotita suavemente con una hoja de la cubierta amino silanizada, sin generar burbujas. </li><li> Colocar los portaobjetos durante 3 horas hasta toda la noche en un lugar oscuro, bien nivelados cámara húmeda a temperatura ambiente. Utilice un soporte de la punta de la pipeta vacía como la cámara, con agua en la parte inferior. Sellar solución de PEG residual en el tubo y se mantiene a 4 ° C. </li><li> Enjuague el portaobjetos pegilado a fondo con agua desionizada. Almacenarlo en un lugar oscuro y seco hasta su uso. </li></ol></li></ol> 3. Montaje de una cámara de flujo <ol><li> Fabricar un soporte acrílico perforado, como en la Figura 2. Asegúrese de que el diámetro de la inserción de la tubería es 0,762 mm, y designar un agujero es una entrada y el otro esuna salida (Figura 2). </li><li> Coloque tiras adhesivas de doble cara de cinta (ancho 5-6 mm) en un soporte de acrílico (Figura 2), alineando perpendicularmente a un orificio de entrada y salida, no perturbar cualquier orificio del canal. Utilice estas tiras de cinta como las paredes de varios canales para hacer cámaras. Frote la cinta utilizando una punta de pipeta. </li><li> Colocar un cubreobjetos pegilado en la parte superior para hacer cámaras de flujo, con la cara hacia abajo pegilado. </li><li> Para evitar cualquier solución se produzcan fugas, presione la parte superior de un cubreobjetos sobre el área donde se colocan cintas de doble cara. Añadir pegamento de secado rápido epoxi para cerrar los bordes de la cámara en la parte superior y en la parte inferior (color amarillo en la Figura 2). </li><li> Conectar una pieza corta (2,5 cm) de tubo (diámetro externo, OD, 0,042 &quot;) a una jeringa hermética a los gases y sellar la unión con pegamento de epoxi. </li><li> Conectar un tubo largo y flexible (OD: 0,03 &quot;) a la tubería vinculada a la jeringa y sellar la unión con pegamento epoxi. </li><li> Llene el Tubing vinculada a la jeringa con agua DI. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. </li><li> Introduzca el tubo en el orificio de la cámara de flujo sellado con pegamento de epoxi. </li><li> Coloque una punta amarilla (200 punta l) en el otro orificio como reservorio. </li></ol> 4. Carga de la muestra en la cámara de flujo Nota: Neutravidina se puede sustituir con otras proteínas avidina como la estreptavidina. Todas las reacciones pueden realizarse a temperatura ambiente, a menos que se menciona. Tome la solución de la muestra en una punta amarilla, e instalar la punta con la solución sobre el agujero del soporte de acrílico (Figura 2b). <ol><li> Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 50 l / min. Carga de 20 l de proteína de avidina (25 mg / ml en solución T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), y mantenerla durante 10 minutos. </li><li> Carga de 20 l de oligodesoxinucleótidos con biotina (100 micras en 1 x TE), y mantenerla durante 10 minutos. Si se utiliza transferasa terminal, no realice la cargade oligodesoxinucleótidos. </li><li> Carga de 20 l de solución de ADN a partir del paso 1 en la cámara de flujo a un caudal de 10 l / min, y mantenerla durante 30 minutos. </li><li> Se lava la cámara de flujo con 1 x TE, y la carga de 40 l de FP-PAD 10 (~ 80 nm). </li><li> Observe ADN bajo un microscopio de fluorescencia con flujo continuo de moléculas de tinción en 1 x TE en una lente de objetivo 60X. Utilice 488 nm láser de estado sólido para la excitación de FP -DBP (EGFP). Para estiramiento completo de moléculas de ADN, aplicar diferentes velocidades de flujo de acuerdo con las longitudes de ADN utilizados. Por ejemplo, se aplican 50 l / min durante 48,5 kpb de ADN λ, y 100 l / min durante 166 kpb de ADN T4. <ol><li> Para el reciclaje del soporte de acrílico, remojo cámaras de flujo montados en una solución de detergente doméstico 12. Retire las cintas y epoxi con una hoja de afeitar y frotar con las manos para tomar completamente apagado. Destapar los agujeros con agujas de jeringas. Mantener a los titulares en agua desionizada hasta su uso posterior. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. 6 En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados continuamente tienen una alta probabilidad de atacar a un esqueleto de fosfato del ADN, 9 la potencia de luz de excitación se tuvo que reducir al mínimo para evitar la foto-escisión. A fin de superar este inconveniente, se desarrolló por ingeniería genética proteínas fluorescentes de unión al ADN con capacidad (FP-DBP) para el ADN de tinción sin foto-escisión. 10 Se observó tinción de ADN fiable sobre superficies de las proteínas recubiertas de avidina. No obstante, esta plataforma tenía otro problema de la agregación indeseable de las proteínas fluorescentes en elsuperficie de la proteína, lo que resulta en un aumento del ruido de fondo. Es esencial para reducir al mínimo este ruido aleatorio para análisis de ADN de una sola molécula para mejorar el contraste de ADN y las proteínas del fondo. El uso de FP-DBP por lo tanto requiere pasivación de la superficie para evitar que la proteína fluorescente de ser adsorbido en la superficie. PEG podría ser un potente candidato para este propósito. 12 Por lo tanto, hemos utilizado biotinilado-PEG, que mejora considerablemente la relación señal-ruido para las moléculas de ADN de imágenes FP-DBP teñidas atados en la superficie. Hay varios pasos críticos y notas de este método para rendimientos más altos. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en una superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1. Este proceso de pasivación de la superficie es crítica para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente la adsorción al azar de generación de ruido en las superficies.Por lo tanto, se recomienda encarecidamente aminosilanization durante la noche y la PEGilación. Además, la limpieza de la lámina de vidrio, así como la cubierta de vidrio con solución Piranha puede reducir aún más el ruido de fondo. Un oligonucleótido biotinilado debe tener un grupo fosfato en el extremo 5 &#39;con el fin de vincularlo a 3&#39; grupo hidroxilo de una molécula de ADN grande. La secuencia de oligonucleótido biotinilado es 5&#39;-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 &#39;para la inmovilización de ADN λ. La solución de DNA λ tiene que ser cargado poco después de la preparación de solución de ADN λ (descrito en 1.1), porque λ DNA a menudo se forma concatemers con el almacenamiento de largo plazo. Para el ADN de extremos romos tal como ADN T4, transferasa terminal puede añadir dUTPs biotinilados en ambos extremos de ADN sin ninguna especificidad. Por lo tanto, el tiempo de reacción transferasa terminal tiene que ser ajustado con cuidado alrededor de una hora, de lo contrario la reacción extendido puede producir ADN de doble marcado (es decir, ambos extremos se marcan con biotina). en complementoition al ADN viral tal como λ y T4, cualquier tipo de ADN puede ser utilizado en esta plataforma. Sin embargo, se recomienda el uso de fragmentos de ADN genómico gigantesca después de la digestión por enzimas de restricción raros-cortador como SwaI o NotI. Diferentes velocidades de flujo se aplican para las diferentes longitudes de ADN. Por lo general, las moléculas de ADN más largas requieren velocidades de flujo más rápidas para estirar completamente las moléculas de ADN, para que coincida con la longitud exacta del contorno. Por ejemplo, λ DNA puede estirar hasta 16,5 micras, lo que corresponde al valor calculado de 0,34 nm x 48.502 pb. Es muy importante preparar recién todos los materiales, en particular todas las proteínas y PEG. Por ejemplo, Neutravidina pierde fácilmente su función de biotinas unión si se almacena como una solución diluida. Para las soluciones de PEG, el pH es crítico para conjugar grupos funcionales de una amina primaria y n-hidroxisuccinimida. Por lo tanto, se recomienda para preparar recién todos los materiales al menos cada semana. La visualización de grandes moléculas de ADN atados en la superficie es una plataforma versátil para ser aplicado para una variedad de aplicaciones tales como la genómica, epigenomics, estudios bioquímicos de ADN y la interacción de proteínas, y los estudios de la física de polímeros. Sin embargo, este enfoque está limitado sólo para modelar sistemas que utilizan moléculas de ADN relativamente simples y bien conocidos, tales como el genoma viral. Para ser ampliado con el genoma humano y el epigenoma, es muy importante establecer una plataforma robusta, fiable y sencilla para el uso práctico. Mediante la superación de la luz inducida por ADN foto-escote y evitar la adsorción de la proteína fluorescente al azar en la superficie, por lo tanto, esta plataforma proporciona imágenes claras y de alto contraste de ADN alargado con flujos de cizalla.

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, 1,2 y física de polímeros. 3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. 5 en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión. En segundo lugar, es muy fácil cambiar el entorno químico alrededor de moléculas de ADN para una serie de reacciones enzimáticas en una cámara de flujo. En tercer lugar, un flujo de cizallamiento de microfluidos induce ADN molecular de estiramiento hasta 100% de la longitud del contorno completo, lo cual es muy difícil de lograr con la elongación del ADN enfoques alternativos como la inmovilización superficie 6 y el confinamiento nanochannel. 7 A completamente stretched molécula de ADN también proporciona información de posición que puede ser útil para el seguimiento de los movimientos enzimáticas en el mapa genómico. Sin embargo, el procedimiento de anclaje del ADN tiene un defecto crítico en que el colorante de intercalación tales como el YOYO-1 por lo general hace que las moléculas de ADN atados a ser fácilmente rotas por la luz de excitación de fluorescencia. En general, las grandes moléculas de ADN tienen que ser teñido con un tinte fluorescente para la visualización en un microscopio fluorescente. Para este fin, otros colorantes de la serie TOTO YOYO-1 o son principalmente usados ​​debido a que estos tintes son fluorescentes solamente cuando se intercalan DNA de doble cadena. 8 Sin embargo, es bien sabido que los bis-intercalantes colorante hace DNA inducida por la luz de foto-escisión porque de la intercalación de fluoróforos. 9 Además, las moléculas de ADN fluorescente manchadas atados en la superficie son más frágiles puesto que los flujos de cizallamiento pueden ejercer fuerzas de rotura en mover libremente moléculas de ADN. Por lo tanto, hemos desarrollado FP-PAD como una novela DNA-tinción de colorante de proteínas para obtener imágenes de grandes moléculas de ADN atados en la superficie. La ventaja de usar FP-DBP es que no causa foto-escisión de las moléculas de ADN al que se une. 10 Además, FP-DBP no aumenta la longitud de contorno de ADN, mientras que los colorantes bis-intercalantes aumentan la longitud de contorno en aproximadamente 33%. Este método de vídeo introduce el enfoque experimental para la inmovilización de grandes moléculas de ADN a una superficie de PEG-biotina. La figura 1 ilustra los diferentes enfoques de la inmovilización de ADN con extremos romos y extremos pegajosos. Por lo tanto, este método de tinción se puede aplicar a cualquier tipo de molécula de ADN. La figura 2 muestra una representación esquemática del conjunto de cámara de flujo que puede ser controlado por una bomba de jeringa para generar flujos de cizallamiento para estirar las moléculas de ADN, así como para carga química y enzimática soluciones. la Figura 3 muestra micrografías de las moléculas de ADN completamente estirada atados en el PEGylated superficie 11 y se tiñeron con FP-PAD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="925">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1. DNA Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Terminal Transferase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0315S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotin-11-dUTP</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">R0081</td>
			<td>Biotin-ddNTP is also available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4GT7 Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:133px;">318-03971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">E6758</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0202S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Lambda Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Bioneer</td>
			<td style="width:133px;">D-2510</td>
			<td>Also available at New England Biolabs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:925px;">2. Functionalized Surface Derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.1) Piranha Cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Coverslip</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">0101050</td>
			<td>22x22 mm, No. 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Teflon rack</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">PTFE Thread Seal Tape</td>
			<td style="width:167px;">Han Yang Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">3032292</td>
			<td>Teflon&#8482; tape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sulferic acid</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">S280823</td>
			<td>H2SO4, 95 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">H290423</td>
			<td>H2O2, 35 % in water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sonicator</td>
			<td style="width:167px;">Daihan Scientific Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">WUC-A02H</td>
			<td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.2) Aminosilanization on Glass Surface</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] 
			ethylenediamine</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">104884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Duksan Chemicals</td>
			<td style="width:133px;">414</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">M300318</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polypropylene Container</td>
			<td style="width:167px;">Qorpak</td>
			<td style="width:133px;">PLC-04907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300202</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.3) PEGylation of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syringe Filter</td>
			<td style="width:167px;">Sartorius</td>
			<td style="width:133px;">16534----------K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Biotin-PEG-SC</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">Biotin-PEG-SC-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">mPEG-SVG</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300129</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">1000612</td>
			<td>~76x26x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">3. Assembling a Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylic Support</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Double-sided Tape</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Transparent type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Quick-dry Epoxy</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:167px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:133px;">06417-11, 06417-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Gas Tight 250 &#181;l Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Hamilton</td>
			<td style="width:133px;">81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:167px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:133px;">NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">4. Sample Loading into Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Neutravidin</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tris base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T1503-5KG</td>
			<td>Trizma base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:133px;">IX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:167px;">Q Imaging</td>
			<td style="width:133px;">Rolera EM-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Solid-state Laser (488 nm)</td>
			<td style="width:167px;">Oxxius</td>
			<td style="width:133px;">LBX488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Alconox</td>
			<td style="width:167px;">Alconox Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

La figura 1 muestra dos métodos de inmovilización de ADN diferentes en función de las estructuras terminales de la molécula de ADN. La Figura 1a ilustra cómo las moléculas de ADN de extremos pegajosos se hibridan con oligonucleótidos biotinilados complementarios, que están inmovilizados en la superficie PEG avidina-revestido. La Figura 1B muestra la adición de biotinilado ddNTP o dNTP para el grupo hidroxilo 3 &#39;de un ADN de extremos romos por transferasa terminal. Añadimos enlazadores flexibles entre moléculas de ADN y la biotina. Esto aumentó la eficacia de la unión de ligación y avidina-biotina para proporcionar espacio suficiente para las reacciones. La Figura 1C muestra la representación esquemática general para la inmovilización de ADN en la superficie PEG avidina-revestido. La figura 2 representa el conjunto de la cámara de flujo a lo largo con un soporte de acrílico. En comparación con glass / gafas de diapositivas de cuarzo, un soporte acrílico hecho a medida simplifica la preparación de la cámara de flujo para la microscopía de epi-fluorescencia. 12 La cámara de flujo permite el cambio instantáneo de las condiciones del tampón para reacciones enzimáticas, 6 y estiramiento de moléculas de ADN. La Figura 3 muestra de ADN-atado sola y T4 λDNA teñido con FP-PAD. cizalla de microfluidos flujos de moléculas individuales de ADN alargadas hasta longitudes de contorno completos, que incluyen 16,5 m (48,5 kb de ADN λ x 0,34 nm) y 56,4 micras (166 kb de ADN T4 x 0,34 nm). Hemos sido capaces de repetir ADN de estiramiento y relajación varias veces durante un período prolongado (por ejemplo, media hora), ya que hemos utilizado FP-PAD que no causa foto-escote. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la inmovilización del ADN. a) sADN de punta ticky se hibrida con un oligonucleótido complementario biotinilado. Trietilenglicol es un enlazador flexible entre el oligonucleótido y biotinilado dNTP se añade a un extremo romo de ADN de doble cadena, por transferasa terminal biotina. B). Spacer Policarbono (11 átomos) es un enlazador flexible entre dNTP y biotina. C) ADN biotinilado está anclada a una proteína avidina, que está vinculada a un PEG biotinilado unido covalentemente a la superficie de vidrio. La proporción de PEG con biotina con PEG normal fue de 0,025 (1:40). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig2.jpg" /> Figura 2. Cámara de flujo. a) Cámara de flujo consiste en un soporte de resina de ácido acrílico, tiras de cintas de doble cara y una hoja de cubierta pegilado. El titular de acrílico de dimensiones de 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x W x H), se fabricó con corte por láser b) Vista lateral de la cámara de flujo:. Orificios perforados son un orificio de entrada en la que se instala una punta amarilla por un depósito de regulación, y un orificio de salida que está conectado a un tubo controlado por una jeringa de la bomba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig2large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes microscópicas fluorescentes de moléculas de ADN estirados teñidas con FP-PAD. a) el ADN del bacteriófago λ (48,5 kbp), atado en la superficie después de la ligación con los oligonucleótidos complementarios biotinilados. b) DNA del bacteriófago T4 (166 kpb) atado en la superficie después de la adición de biotina con transferasa terminal. flechas indicadas muestran molecul ADNes estiran hasta sus longitudes de contorno completo tal como 16,5 micras para DNA λ y 56,4 micras para el ADN T4. Las barras de escala:. 10 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K vistas.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Investigación

Biología

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...