This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA Biotinylierung <ol><li> Biotinylierung von blunt ended DNA unter Verwendung von Terminal - Transferase (TdT) Hinweis: Die Verwendung von T4-DNA (166 kbp), das eine stumpfe ended DNA ist. <ol><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l von 2,5 mM CoCl 2, 5 &amp; mgr; l 10 × Reaktionspuffer, 0,5 ul 10 mM Biotin-11-dUTP, 0,5 ul terminaler Transferase (10 Einheiten) und 0,5 ul T4 - DNA (0,5 ug / ul) zu dem Reaktionsgemisch. Machen zu einem Endvolumen von 50 &amp; mgr; l von 38,5 &amp; mgr; l Wasser zugegeben. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Erweiterte Reaktionszeit kann Ausbeute doppelt angebundenen DNA, dh es ist möglich , dass Biotinen an beiden Enden markiert sind. </li><li> Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinylierung von klebrigen Enden DNA unter Verwendung von DNA - Ligase Hinweis: Verwenden Sie λ-DNA (48,5 kbp), das eine klebrige-End-DNA ist. &lt;ol&gt; <li> 1 ul T4-DNA-Ligase, 5 ul 10 × Ligationspuffer, 1 ul 25 ng / &amp; mgr; l λ-Phagen-DNA, und fügen 43 ul Wasser auf ein Endvolumen von 50 &amp; mgr; l zu machen. </li><li> Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Funktionalisierte Oberflächenderivatisierung . Hinweis: Um ein Ende eines DNA - Moleküls auf der Glasoberfläche anbinden, eine primäre Amingruppe auf einem Deckglas silanisiert gefolgt von Biotin-PEG - Beschichtung , wie in Figur 1 gezeigt Dieser PEGylierung Prozess ist wichtig für Einzelmolekül - DNA - Bildgebung , da es kann erheblich zufälliges Rauschen durch Anlagerung von unerwünschten Molekülen auf der Oberfläche erzeugt verringern. <ol><li> Piranha Reinigung Hinweis: Piranha-Lösungen reagieren heftig mit organischen Materialien, daher sollte es mit Vorsicht behandelt werden, die nach einer ordnungsgemäßen Sicherheitsrichtlinien. <ol><li> Platz Deckgläser auf einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Rack, und halten Sie sie by PTFE Gewindedichtband der Länge nach, halb auf dem Rand der Oberflächen und zur Hälfte auf dem Rack. Nach dem Wickeln für die Handhabung der Zahnstange während des Reinigungsvorganges ein langes Stück (~ 5 cm) des Bandes verlassen. </li><li> Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit 350 ml H 2 SO 4 und 150 ml H 2 O 2 Piranha - Lösung in einem Abzug zu machen. Legen Sie das Rack in Piranha-Lösung für 2 Stunden. </li><li> Leere Piranha-Lösung aus dem Becher und rinse Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser, bis der pH des Wassers in dem Becher erreicht neutral. Verwenden Sie pH-Papierstreifen. </li><li> Beschallen die Racks von Deckgläsern in den Becher Wasser, 30 min. Leere Wasser aus dem Becher kurz vor Amino Silanisierung. Verwenden Sie 75 W von Beschallungsleistung zu reinigen und zu derivatisieren die Glassubstrate. </li></ol></li><li> Aminosilanisierung auf der Glasoberfläche <ol><li> 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylendiamin und 10 ml Eisessig zu 200 mlMethylalkohol in einem sauberen Polypropylenbehälter für die Aminosilanisierung Lösung vorbereitet. </li><li> Legen gereinigt Deckgläser in der Polypropylenbehälter. Schüttle sie bei 100 Upm und Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Beschallen den Becher mit derivatisierten Abdecküberzüge für 15 min bei 75 W für mindestens 30 min schütteln sie bei 100 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur. </li><li> Entleeren der Lösung aus dem Becherglas und spülen Deckgläser vorsichtig einmal mit Methylalkohol und zweimal mit Ethylalkohol. Shop Deckgläser in Ethylalkohol und nutzen sie innerhalb von zwei Wochen. </li></ol></li><li> PEGylierung des Deckplättchens <ol><li> Machen 10 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO 3). Filtern der Lösung mit einem 0,22 um-Spritzenfilter. </li><li> Man löst 2 mg Biotin-PEG-Succinimidylcarbonat (Biotin-PEG-SC) und 80 mg PEG-Succinimidyl - valerat (mPEG-SVG) in 350 &amp; mgr; l NaHCO 3. Verwenden Sie ein Lichtschutzrohr. </li><li> Mischen Sie den Schlauch kräftig für 10 sec, und es Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min zu entfernen Blasen. </li><li> Spülen einen Glasobjektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol gespült. Lassen Sie den Schieber vollständig an der Luft trocknen. </li><li> Einen Tropfen (50 ul) von PEG-Lösung auf dem sauberen Glas-Objektträger. Decken Sie die Tröpfchen sanft mit einem Amino silanisiert Deckglas, ohne Blasen zu erzeugen. </li><li> Die Objektträger für 3 Stunden bis über Nacht in einem dunklen, gut eingeebnete feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen leeren Pipettenspitzenhalter als die Kammer, mit Wasser auf dem Boden. Siegel Rest PEG-Lösung in dem Rohr und halten sie bei 4 ° C. </li><li> Spülen Sie die pegyliertes Deck gründlich mit entsalztem Wasser. Bewahren Sie es in einem dunklen und trockenen Ort bis zum Gebrauch. </li></ol></li></ol> 3. Montage einer Flusskammer <ol><li> Fabrizieren ein gestanztes Acrylhalter, wie in Abbildung 2. Stellen Sie sicher , dass der Durchmesser der Rohreinsatz 0,762 mm ist, und bezeichnen ein Loch ein Einlass ist und das andereeinen Auslass (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie doppelseitige Klebeband Streifen (Breite 5-6 mm) auf einem Acryl-Halter (Abbildung 2), Ausrichten senkrecht zu einer Ein- und Austrittsloch, keine Kanalbohrungen gestört. Verwenden Sie diese Bandstreifen als Mehrkanalwände Kammern zu machen. Schrubben Sie das Band mit einer Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie ein pegyliertes Deckglas auf der Oberseite, um die Strömungskammern machen, mit dem PEGylierten Seite nach unten. </li><li> Um eine Lösung nicht auslaufen, drücken Sie die Spitze eines Deckglases über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Fügen Sie schnell trocknend Epoxidkleber die Ränder der Kammer am oberen und am unteren Rand (gelbe Farbe in Abbildung 2) zu schließen. </li><li> Verbinden ein kurzes Stück (2,5 cm) der Rohrleitung (Außendurchmesser OD, 0,042 &quot;) zu einer gasdichten Spritze und Abdichten der Verbindung mit Epoxy-Klebstoff. </li><li> Verbinden eine lange flexible Schlauch (OD: 0,03 &quot;), um den Schlauch an der Spritze verbunden, und abdichten das Gelenk mit Epoxidkleber. </li><li> Füllen Sie den tubing an der Spritze mit DI-Wasser verbunden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase. </li><li> Legen Sie den Schlauch in das Loch der Strömungskammer mit Epoxid-Kleber versiegelt. </li><li> Legen Sie eine gelbe Spitze (200 ul Spitze) auf der anderen Loch als Reservoir. </li></ol> 4. Probe Laden in Flusskammer Hinweis: Neutravidin kann mit anderen Proteinen Avidin wie Streptavidin ersetzt werden. Alle Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, es sei denn, es erwähnt wird. Nehmen Probenlösung in einem gelben Spitze, und installieren Sie die Spitze mit der Lösung auf das Loch von Acrylhalter (Abbildung 2b). <ol><li> Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe bei 50 &amp; mgr; l / min. Last 20 ul Avidin-Protein (25 ug / ml in T50-Lösung, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), und halten Sie es für 10 Minuten. </li><li> Last 20 ul biotinylierten Oligodesoxynukleotide (100 &amp; mgr; M in 1 × TE), und halten Sie es für 10 Minuten. Wenn Terminal-Transferase verwendet wird, lassen Sie die Ladevon Oligodesoxynukleotide. </li><li> Last 20 ul DNA-Lösung aus Schritt 1 in die Strömungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul / min und Halten für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Flusskammer mit 1 × TE und laden 40 ul FP-DBP 10 (~ 80 nM). </li><li> Beobachten DNA unter einem Fluoreszenzmikroskop mit kontinuierlichen Fluss von Anfärben Moleküle in 1 × TE auf einem 60X Objektiv. Verwenden 488 nm Festkörperlaser zur Anregung von FP (eGFP) -DBP. Für volle Strecke von DNA-Molekülen, gelten unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten entsprechend den DNA-Längen verwendet. So gelten beispielsweise 50 &amp; mgr; l / min für 48,5 kbp von λ-DNA und 100 &amp; mgr; l / min für 166 kbp von T4 DNA. <ol><li> Für das Recycling des Acrylhalter tränken montierten Strömungskammern in einem Haushalt Reinigungslösung 12. Entfernen Sie Bänder und Epoxy mit einer Rasierklinge und reiben mit den Händen völlig sie auszuziehen. Unclog Löcher mit Spritzennadeln. Halten Sie die Halter in entsalztem Wasser bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li></ol>

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	<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads.">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li><li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -. L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase.">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li><li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow.">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li><li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy.">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces.">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li><li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis.">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection.">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li><li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers.">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules.">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA - Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. 6 In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA - Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA - Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregt...

Visualisierung großer DNA - Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein - Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA - Substrat, 1,2 und Polymerphysik verwendet. 3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA - Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. 5 Erstens hat ein großes DNA - Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik - Scherströmung induziert DNA - Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA - Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung 6 und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. 7 A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann. Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. 8 Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA - Moleküle der Interkalation von Fluorophore. 9 Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA - Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA - Moleküle bindet , an die verursacht. 10 Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%. Dieses Video - Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin - Oberfläche großer DNA - Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA - Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA - Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA - Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche 11 und gefärbt mit FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Figur 1 zeigt zwei verschiedene DNA Anbinden Methoden in Abhängigkeit von terminalen Strukturen des DNA - Moleküls. 1a veranschaulicht , wie die klebrigen Enden DNA - Moleküle mit komplementären biotinylierten Oligonukleotiden hybridisiert werden, die auf dem Avidin-beschichteten PEG Oberfläche immobilisiert sind. 1b zeigt die Zugabe von biotinyliertes ddNTP oder dNTP an die Hydroxylgruppe eines stumpfen ended DNA durch terminale Tr...

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Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Aufrufe.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Serie: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Forschung

Biochemie

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunologie und Infektion

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biologie

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>In situ Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekülstudien

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Effiziente Nukleosomenrekonstitution für Einzelmolekültechniken

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Dynamik der eukaryotischen DNA-Replikation durch Einzelmolekül-Visualisierung

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase