עבודה זו נתמכה על ידי הבריטים Heart Foundation מלגות כדי SZ (FS / 08/063 ו FS / 15/30/31494).

<ol>
	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels.">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li><li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors.">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li><li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors.">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li><li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail.">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li><li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interactions:+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations.">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li><li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast:+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits.">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li><li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies:+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system.">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li><li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system.">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li><li>Elion, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Detection+of+protein-protein+interactions+by+coprecipitation.">Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9,+Calcium+phosphate+transfection.">Chapter 9, Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2003).</li><li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+(TPC)-binding+protein.">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain.">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease.">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes.">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li><li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis.">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6.">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin.">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li><li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein.">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart.">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li><li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+oligomerization:+how+and+why.">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li><li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+oligomerization,+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states.">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li><li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration:+lessons+from+the+Alzheimer's+amyloid+beta-peptide.">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li><li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution:+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation.">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li><li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization.">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li><li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors:+biochemical+and+biophysical+methods.">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li></ol>

החוקרים אין להכריז.

ההיווצרות של הומו-oligomers חלבון היא תהליך ביולוגי בסיסי המסדיר את פעילותם של גורמי שעתוק, אנזימים, יון ערוצים קולטני 25,26. חשוב לציין, oligomerization חלבון יש גם השלכות פתולוגיות כולל ניוון מוחיים ומחלות לב arrhythmogenic 4,27. מתודולוגיות המתוארים במאמר זה משמשים לזיהוי אינטראקציות תחום-תחום בתיווך חלבון-שיוך עצמי oligomerization. להלן נבקש להצביע על שלבים קריטיים בתוך כל פרוטוקול, ואנחנו דנים שיקולים, מגבלות חשובות של פתרון בעיות. המערכת Y2H יכול להיות מועסק הראשון למסך שותפים חלבון אינטראקציה פוטנציאל בגלל הקרנת תפוקה גבוהה יחסית, קלות שימוש ותוצאות לשחזור מאוד. נהלי Y2H מתבצעים במעבדה למיקרוביולוגיה עם תקן (צלחת או שתייקרו) חממות ומתקני בלימת חדר. שימוש freshly מוכן תאים מוסמכים (שלב 1.1.8) הם קריטי עבור טרנספורמציה שמרים יעילות גבוהה, ואילו עבור התוצאות הטובות ביותר ב מבחני β-גל, טרי גדלו מושבות שמרים (עד 5 ימים) אמור לשמש (שלב 1.2.3). מערכות מבוססות על גורמי שעתוק מלבד GAL4 ו / או נוספים / גני כתב תחליפיים זמינות, ולכן פיתיון פלסמידים טרף צריך להיות בהתאמה עם זן Y2H המתאים. כמה זנים צריכים להיות תרבותיים בנוכחות 3-אמינו-1,2,4-triazole, מעכב תחרותי של חלבון HIS3, על מנת להרוות את כל ביטוי מכונן של גן כתב HIS3 7,8. ביטוי של חלבוני היתוך פיתיון היעד צריך להיות מאומת על ידי immunoblotting 17. במקרה פיתיון / חלבוני היתוך טרף רעילים שמרים, רמות חלבון נסבלות נמוך יכולות להיות מושגת על ידי שיבוט וקטורים שונים שבם פיתיון / ביטוי טרף הוא מונע על ידי אמרגן שונה. כמו כן, הוא חיוני כדי להבטיח tחלבוני כובע היתוך פיתיון / טרף אינם מציגי פעילות גן הכתב אוטונומי. הפעלת גן כתב אוטונומית יכולה להינצל על ידי שינוי המבנה להסיר באזור האחראי, או על ידי החלפת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה לשני החלבונים נבדקים. יתר על כן, תחומים הטרנסממברני מושמטים טובים יותר מן מבני פיתיון / טרף, כיוון שהם עלולים לגרום misfolding או mislocalization של חלבוני היתוך בתאי קרום תאיים. ואכן, החיסרון העיקרי של מערכת Y2H היא כי חלבונים הפיתיון היעד הם נקודתיים בגרעין שמרים הרחק מיקום subcellular פיזיולוגיים שלהם ואפשרות חסר שלאחר translational שינויים ספציפיים, וכתוצאה מכך אינטראקציות חיוביות שגויות או false-negative 6-9 . מערכות ביטוי Heterologous יונק מתאימות יותר לחקר חלבונים בממברנה אינטגרלי יונקים מבחינת שינויי קונפורמציה, שלאחר translational ולוקליזציה subcellular.אחת השיטות transfection התא הנפוץ ביותר הוא משקעים סידן פוספט, בעיקר בגלל הציוד המינימלי ריאגנטים הנדרש 11,15. שיטות חלופיות, כלומר electroporation, ליפוזומים, שומנים ופולימרים קטיוני, עשויות להניב יעילות transfection גבוהה בהתאם לקו התא לבנות משומש. באופן כללי, הגורמים העיקריים המשפיעים יעיל transfection הם באיכות פלסמיד דנ&quot;א כדאיויות תא בריאות /. התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר פלסמיד דנ&quot;א של הטוהר הגבוה ביותר (יחס ספיגת 260nm / 280nm של ~ 1.8) התאים המתחלקים באופן פעיל משמש. תאים ולכן יש transfected על לא יותר מ 60 - 70% מפגש (שלב 2.1.2), כי את היכולת לקחת את דנ&quot;א זר קשורה שטח הפנים של התא נחשף המדיום 11. בנוסף, הכללת האנטיביוטיקה במדיום התרבות במהלך transfection (שלב 2.1.3) לא מומלצת בשל מוות של תא מוגבר 15. Fאו משקע סידן פוספט בהכנה מסוימת, זהירה וכוונון pH (כדי 7.05 בדיוק) של פתרון 2x HBS (שלב 2.1.1), היווצרות נכונה של DNA פלסמיד / סידן / מתחמי פוספט על ידי ערבוב נמרץ (שלב 2.1.5) הם שלבים קריטיים עבור transfection היעילות גבוהה. בדרך כלל, ביטוי החלבון על ידי פסגות transfection חולף בתוך 24 - 72 שעות. לאחר תאים נקצרים, נהלים עקב חייבים להתבצע ב 4 ° C כדי למזער פעילות הפרוטאז, והוספת מעכבי פרוטאז מומלצת. המגון Cell צריך להיות מלווה צעד צנטריפוגה להסיר גרעינים כי כרומוזומליות DNA עשויה להגדיל את צמיגות פתרון ולשפר את הלא ספציפי מחייב. לפיכך, המגון באמצעים מכניים ב חיץ iso-האוסמוטי הוא העדיף, בדרך כלל (0.3 M) סוכרוז או (150 מ&quot;מ) NaCl. באופן כללי, מאגרים מבוססים סוכרוז ידועים כדי לשפר את יציבות חלבון ולהקטין צבירת חלבון פוטנציאל שאינה ילידי ארץ, אך בשל pהידרציה קשרים על פני החלבון, אינטראקציות חלבון-חלבון אלקטרוסטטית הם העדיפו. לעומת זאת, מאגרים מבוססי מלח להשפיע על מטען נטו של קבוצות צד חומצת אמינו מחויבות על פני החלבון, ובכך שיש הטיה לכיוון יותר אינטראקציות הידרופוביות מבוסס 28. Co-IP הוא assay ביוכימיים המועסק השכיח ביותר להערכת אינטראקציות חלבון-חלבון במיוחד מרקמות ילידים. החיסרון העיקרי שלה הוא הדרישה נוגדנים ספציפיים מאוד תוקף לשימוש IP ו immunoblotting 10,16,18. לפיכך, חלבונים רקומביננטיים לעתים קרובות מתויגים עם epitope הפפטיד, למשל., Hemagglutinin השפעת (YPYDVPDYA) או cMyc אדם (EQKLISEEDL), עבורו נוגדנים ספציפיים גבוהה זיקה זמינות מסחרי. אם תרצה, הנוגדן immunoprecipitating ניתן מצומדות כימית על חלבון-שרף להימנע elution וזיהוי שלה בשלב immunoblotting כי עלול לטשטש את שיתוף זירז protein 16; כדי להשיג זאת, השתמשנו 24 צולבות מקשר כימי בהצלחה 3,3&#39;-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate). זה הכרחי כי חומר ניקוי מתאים כלול למאגר IP ואת החומר המסיס של תאי הומוגני הוסר על ידי צנטריפוגה כדי למזער מחייב ספציפי שאינו (שלב 3.1.3). הבחירה וריכוז חומר הניקוי הם שיקולים חשובים: דטרגנטים חזקים ו / או ריכוזים גבוהים יותר תפחית באופן משמעותי שאינו ספציפי מחייבים אך ייתכן גם לבטל X: אינטראקצית חלבון Y, בעוד ריכוזים נמוכים או דטרגנטים מתונים עשויות לאפשר אינטראקציה חלשה להיות שנצפתה אך רשאית לגרום מחייב מוגזם שאינו ספציפי. דטרגנטים כוח ביניים עדיפים, למשל, טריטון X-100 ב 0.5 -. ריכוז 1%. כדי לצמצם עוד יותר את הלא ספציפית מחייב, חלבון נייטרלי (למשל, אלבומין בסרום שור ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) יכול להיכלל במאגר IP, ו / או lysate התא ניתן מראש cleareד עם הדגירה מראש עם שרף חלבון-A לבד. מספר השוטף צריך להיות מותאם עבור X: נבדק זוג Y, בדרך כלל שלושה שוטף של 10 דק &#39;עם חיץ IP (שלב 3.1.9). בכל מקרה, מדגם שיתוף IP עם IgG הלא חיסוני כמו נוגדן immunoprecipitating תמיד צריך להיות מעובד במקביל לשרת מלא שלילי (צעד 3.1.6). היתרון העיקרי של cross-linking כימי הוא שזה מודיע על רכב stoichiometric של-oligomer הומו החלבון. Glutaraldehyde הוא מקשר צולב נפוץ כי זה לא דורש ציוד מיוחד שהוא מייצר תרמית וכימי צולבות קישורים יציבים בין חלבוני אינטראקצית 19,20. תרכובות עם קבוצות אמינו חופשיות להשמיטם מ מאגרי assay (שלב 3.2.1) כי הם להרוות את התגובה הכימית. ריכוז Glutaraldehyde ותגובה הזמן (שלב 3.2.4) צריך להיות מותאם מורכב החלבון oligomeric של עניין. החיסרון העיקרי של שיטה זו, especiברית כאשר היא מבוצעת על הכנות תא כולו, הוא-הסגולי אי התגובה הכימית שיכול להניב אגרגטים חלבון מלאכותיים חסרי משמעות ביולוגית. אלטרנטיבי in vivo (למשל., תהודה העברת אנרגיה פלואורסצנטי, דו-מולקולרי פלואורסצנטי או השלמה הארה) ו בטכניקות חוץ גופית (למשל., כרומטוגרפיה הדרה גודל, ultracentrifugation אנליטית, calorimetry טיטרציה בידוד תרמי) זמינים לאפיון ההתאגדות עצמית חלבון והערכה של oligomerization והרכב 29,30. לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות משלה, והוא עשוי להיות מתאים יותר ללימוד חלבון מסוים תלוי טיהור חלבונים / יציבות וזמינה ציוד / מגיב. שלוש השיטות משלימות שתואר כאן בהרחבה, כלומר Y2H, שיתוף IP ו- cross-linking, שימשו בשילוב לספק הוכחות משכנעות RyR2 הומו-oligomeהיווצרות r בבידוד בתוך תא חי.

התכווצות שרירי השלד ואת הלב מופעלת על ידי הרטיקולום sarcoplasmic Ca 2 + שחרור בתיווך RyR. ישנם שלושה isoforms RyR יונק עם הערוץ הפונקציונלי מורכב מארבעה תת יחידות זהות. כל למקטע RyR מורכב חלק N-terminal רגולטוריות ציטופלסמית גדול חלק C- מסוף קטן המכיל את התחומים הטרנסממברני יוצרים נקבוביים מוליכות גבוהות Ca 2+. תוך חריג ואינטראקציות-למקטע היתר בבסיס תפקוד ערוץ RyR ולגרום תוקפת והפרעות לב 1. זיהוי והאפיון של תחומים ספציפיים המעורבים במבנה RyR: יחסי פונקציה חשוב אם כן להבנת הפתופיזיולוגיה RyR. טכניקות אינטראקציה בין חלבוני ביוכימיים מסורתיות דורשות כמויות ניכרות של חלבונים מטוהרים, לעתים קרובות מיוצרות חיידקים. זה לא ריאלי במקרה של RyR, עמ &#39;קרום גדול מאודrotein מורכב ~ 5000 חומצות אמינו, בעוד שברי רקומביננטי שלה לא מקובל בקלות ביטוי חיידקים וטיהור. לפיכך, מערכות ביטוי חלופיות שמקורם בתאי דם מארח איקריוטיים נדרשות עבור חלבונים בממברנה אינטגרליים יונקים. השתמשנו בעבר Y2H, שיתוף IP מבחני cross-linking להפגין באופן קולקטיבי כי tetramerization N- הסופית היא תכונה מבנית כי נשמרת על פני שלושה יונקים RyR isoforms 2,3. חשוב לציין, מצאנו כי מוטציה נקודתית אחת קשורה למחלות לב arrhythmogenic משבש N הסופית--שיוך עצמי ותוצאות ערוץ RyR מתפקדת 4. גם יש לנו ליישם טכניקות אלה ללימודי oligomerization של זנב C- מסוף ציטופלסמית RyR 5, כמו גם את N- הסופית של ערוץ הגירסות התאי Ca 2 + ההומולוגי, הקולטן אינוזיטול טריפוספט 1,4,5 2. ב assay Y2H, את interactiעל בין שני חלבונים (X ו- Y) נמדדו על ידי הכינון מחדש של גורם שעתוק תפקודי (GAL4) ואת ההפעלה שהתפתחה של גני כתב 6-9. שני וקטורי שיבוט שונים משמשים ליצירת תערובות של שני החלבונים נבדקו עם שני להפרדה פיזית, התחומים העצמאיים של GAL4: DNA מחייבת דומיין (DNA-BD) / חלבון X היתוך (פיתיון) ושם תחום ההפעלה (AD) / חלבון Y היתוך (יעד). Y2H ניתן להשתמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת GAL4 DNA-BD ו התכה לספירה של אותו חלבון. מהונדסים גנטיים זני Y2H הם GAL4 ו GAL80 לקויים (חלבון GAL80 הוא מדכא של GAL4), כמו גם TRP1 ו LEU2 הלקוי (כדי לספק מבחר תזונתי עבור פלסמידים פיתיון טרף, בהתאמה). בגרעין השמרים, רקומביננטי פפטידים DNA-BD ו AD מובאים לתוך קרבה פיזית קרובה לייצר גורם שעתוק GAL4 היברידי רק דרך &#39;X בשילובים שלהם: int Yeraction. גישה זו מאפשרת סריקה גנטית מהירה לגילוי אינטראקציות בין חלבונים באמצעות הפעלת תעתיק המקבילה של prototrophic (קידוד HIS3 עבור אנזים הכרחי ביוסינתזה היסטידין) ו chromogenic (קידוד LacZ עבור β-galactosidase (β-גל)) גני כתב. היתרון העיקרי של Y2H הוא כי מדובר assay in vivo מאתר אפילו חלשות או חולפות אינטראקציות חלבון-חלבון. יתר על כן, זיהוי כרוך בשימוש הפשוט של מבחר צמיחה (ב היסטידין חסר מדיה) או של colorimetric (β-גל) assay ללא צורך טיהור של חלבוני פיתיון היעד או הדור של נוגדנים ספציפיים. בנוסף, Y2H יכול לשמש מסך אוסף של שיבוטים ידועים אקראיים (שיבוטי ספריית cDNA התמזגו לספירת GAL4) שותפי מחייב רומן של חלבון פיתיון, גם מתן גישה ישירה אל cDNA של חלבון הספרייה. כדי להאריך את התצפיות Y2H, independיכולות להיות מועסקות טכניקות ביוכימיות אף אוזן גרון. Co-IP מבחני cross-linking בשילוב עם immunoblotting שיטות המשמשות לאיתור עמותות חלבון תערובות מדגם מורכבים, למשל., Lysates תא כולו 10. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לדווח על אינטראקציות בין חלבונים מרקמות ילידים, בניגוד לשיטות אחרות שדורשות שימוש חלבונים רקומביננטיים. חלבוני רקומביננטי יכולים לשמש גם, בדרך כלל לידי ביטוי קו תאים יונק, שם הם צפויים להיות שינויי קונפורמציה ופוסט translational הנכונים שלהם, כמו גם לוקליזציה subcellular. עם זאת, מאז שיתוף IP ו- cross-linking נמצאים מבחני חוץ גופית עושה שימוש בתאי הומוגני, יש צורך לאשר אם שני השותפים חלבון שותף מקומי בתא ללא פגע 11. אנו משתמשים באופן שגרתי transfection של HEK293 תאים יונקים להביע קרום נפרד יונקים זמני וחלבונים cytosolic בשיטת משקעים סידן פוספט 2-4,12-14, שתואר כאן בהרחבה. זוהי דרך זולה כדי לספק את ה- DNA פלסמיד ביעילות בתוך התאים אבל זה תלוי בקו תא מסוים בשימוש מפגש התא, כמו גם על טוהר פלסמיד דנ&quot;א 11,15. את assay שיתוף IP כרוך את בידודה של חלבון היליד או רקומביננטי של עניין מ lysates תא בתנאים שאינם denaturing המאפשרים שיתוף הטיהור של שותפי אינטראקציה משוערים 10,16. זה מחייב שימוש של שני נוגדנים עצמאיים, נוגדן immunoprecipitating לבידוד תרמי של החלבון X, ואת נוגדן immunoblotting לגילוי של י &#39;חלבון שותף זה יכול לשמש כדי לבדוק אם חלבון אינטראקציה עם עצמו על ידי יצירת שני בשילובים שונים עם שתי epitope שונה תגים (למשל., HA ו- cMyc). נוגדן immunoprecipitating מאוגד דרך אזור Fc שלה על-חלבון (או חלבון-G, בהתאם למין החיה, כאשר הנוגדן הועלה), אשרהוא מצומדות כדי agarose (או sepharose) שרף. X חלבון הוא זרז ידי הנוגדן: חלבון-שרף הבא דגירה עם lysate התא, כלומר השבר מסיס חומר הניקוי של תאים הומוגני. חיסוני קומפלקסי חלבונים הם eluted עם SDS המכיל חיץ ובהמשך ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות נוגדן כדי לזהות הנוכחות של חלבון Y 17. Co-IP צריך להתבצע עם חלבונים מסיסים חומר ניקוי כדי למנוע מחייב הלא ספציפית מוגזם. הבחירה של חומר ניקוי ריכוזו, כמו גם את המספר השוטף, צריכה להיות מותאם לכל X: זוג Y 10,16,18. Cross-linking מועסק כדי לקבוע את stoichiometry של מתחם חלבון oligomeric. היא מבוססת על תגובה כימית כדי ליצור קשרים קוולנטיים בין protomers אינטראקציה הסמוך, ולכן, היא מאפשרת בשימור מצב oligomeric של החלבון במהלך הפרדת SDS-PAGE. ישנם cross-linking רב reagents באורכים וכימיה שונים מיקוד קבוצות תגובתי שונה על חלבונים, בדרך כלל אמינים ראשוניים, קרבוקסיליות או קבוצות תיאול. כאן, אנו מתארים את השימוש של glutaraldehyde (OHC (CH 2) 3 CHO), גידול הומו-דו-תפקודי צולב מקשר עם שתי קבוצות אלדהיד משני לשם כך להגיב עם קבוצות אמינו חופשיות נוכחות שאריות ליזין 19,20. Cross-linking הוא המיושמת באופן הריכוז או שהזמן גרמן וכתוצאה מכך היווצרות adduct. תגובת Glutaraldehyde מופסקת עם הידרזין (H 2 NNH 2) דגימות חלבון מנותחים מכן על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting 17 להעריך מדינת oligomerization שלהם. נציין כי cross-linking לא לגרום oligomerization אלא רק יוצר גשרים יציבים בין קומפלקסי חלבונים קיימים. שיקולים חשובים בעת ביצוע ניסויים cross-linking כוללים את הבחירה של מקשר צלב, זמן הריכוז והתגובה שלה 19,20.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

במערכת Y2H, הפיתיון: האינטראקציה טרף נבחנת בתחילה על ידי בחירת צמיחת שמרים במדיום חסר (טריפטופן, לאוצין ו) היסטידין ובהמשך הוערך על ידי מבחני הפעילות האנזימטית β-גל (איור 1). שמרים בתרבית היסטידין בינוני חסר יש שיעור צמיחה איטי כי תלוי בחוזק של פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. את assay β-הגל מתבצע בשמרים (בתרבית בינונית חסרה רק טריפטופן לאוצין) או גובר על תמיכה מוצקה (צלחות אגרו) או בתרבות הנוזלת, עם תוצאות כמותיות המניבים האחרונות. השתמשנו בהצלחה את Y2H לזהות אינטראקציות תחום-תחום בתוך RyR2 כמו גם שותפי חלבון רומן 2-4,12,21,22. לדוגמא, אנחנו הקרנו סדרת חופפי בונה פורשת את אורכו של רצף הפפטיד RyR2 לאינטראקציה עם שבר N- מסוף (AD4L: שאריות RyR2 1 - 906 התמזג עם AD GAL4). 3 מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל פיק מושבות שמרים כחולים בצבע חד יחיד עבור BT4L: זוג AD4L (איור 2 א), מראים כי AD4L אינטראקציה עם עצמו, כלומר BT4L לבנות (שאריות RyR2 1 - 906 התמזגה עם GAL4 DNA-BD). מושבות כחולות לבנבן אותרו עבור BT8: זוג AD4L דבר המצביע על עמותה משנית חלשה עם התחום בטרמינל C-הקיצוני (BT8), בעוד שמרים שיתוף הפך עם כל מבנה אחר נשארו לבן ולכן שלילי עבור פיתיון: אינטראקצית חלבון טרף. תוצאות כמותיות, מתקבלות על ידי מבחני β-גל נוזלי (איור 2 ב), מצביעים BT4L החזק: שווה ערך אינטראקצית AD4L בחוזק להתאחדות הידועה בין חלבון p53 (pVA3) ו אנטיגן T הגדול SV40 (pTD1), ואילו BT8: אינטראקצית AD4L ניכר היה חלש (&lt;10% לעומת קבוצת ביקורת). אנו שגרתי לבצע ניסויים-IP שיתוף (איור 3) וollowing ביטוי חולף בקו תא יונק (HEK293), בתור שחקן assay ביוכימיים עצמאי לחזק את ממצאי Y2H 2-4,12-14,21-24. כדי לוודא RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, שני פלסמידים נפרדים קידוד עבור שאריות RyR2 1 - 906 מתויגים עם או את epitope הפפטיד cMyc או HA (BT4L ו AD4L, בהתאמה), היה שיתוף transfected בתאי HEK293 בשיטה משקע סידן פוספט 3. השבר שלאחר הגרעין של תאים הומוגני היה solubilized עם בחורים חומרי ניקוי, ואת החומר מסיס הוסר על ידי צנטריפוגה לייצר lysate התא. Lysate התא, שטופלו dithiothreitol סוכן צמצום, הודגר אז עם Ab HA וחלבון-A חרוזים sepharose כדי immunoprecipitate HA-tagged AD4L. דגימות Co-IP, eluted עם SDS המכילים חיץ, הועמסו על שני ג&#39;לים SDS-PAGE נפרד (1/10 וה 9/10 פיצול ה) ונותחו על ידי immunoblotting עם Ab HA וא.ב. cMyc, respectively. IP הישיר המוצלח של AD4L (~ 100 KDA) על ידי Ab HA אומת על ידי immunoblotting, אך לא השליטה שהלילית באמצעות IgG ארנב הלא חיסוני (איור 4 א). חשוב לציין, cMyc מתויג BT4L (~ 100 KDA) נמצאה רק IP Ab HA, ולא בבקרה שלילית בהיעדר AD4L immunoprecipitated (איור 4B). Y2H מבחני שיתוף IP ספקו הוכחות עקביות עבור RyR2 N הסופית- אינטראקציה עצמית, אבל הם לא הודיעו על מצב oligomerization של תחום N-terminal, כלומר אם הוא יוצר דימרים בלבד או מתחמים גבוהים. יצוין כי מתחמי יהיה לנתק ורק יחידות משנה המהווים יזוהו על ידי SDS-PAGE בגלל SDS- ו denaturation חלבון חום הנגרמת ביטול אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי להתגבר על זה, אנו משתמשים cross-linking (איור 5) כי כימי ביציבות conjoins protei קייםoligomers n, מסה מולקולרית אשר יכול אז להיבדק על ידי הפרדה גודל SDS-PAGE 2-5. לדוגמא, homogenate תא HEK293 להביע cMyc-BT4L, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, היה הגיב glutaraldehyde ונותח על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting באמצעות Ab cMyc (איור 6). בנוסף מונומר (~ 100 KDA), להקת חלבון מסה מולקולרית גבוהה של ~ 400 kDa זוהתה באופן תלוי זמן, המציין היווצרות tetramer RyR2 N הסופית- 3. יש לציין, tetramer היה מינים oligomeric השולט, עם דימר מינימלי ולהקות trimer ציין. כדי לקבוע מסה מולקולרית לכאורה שלה, oligomer BT4L הופרד עד 4 - 15% שיפוע SDS-PAGE ג&#39;לים 3. הפקנו עקומת סטנדרט מולקולרי מסה / ג&#39;ל פיגור באמצעות סטנדרטים חלבון עם מגוון של 30 - 460 kDa, ו חישבנו את oligomer להיות 358 kDa 15 (n = 4). מסה מולקולרית לכאורה זו עולה בקנה אחד עם tetramer BT4L מסודרבצורה מעגלית סגורה ולא בצורה ליניארית, כצפוי מן הסידור של ארבע יחידות משנה בתוך ערוץ RyR2 ילידים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה Y2H. שמרים, שיתוף הפך עם פלסמידים הפיתיון היעד, נבחרה לצמיחה במדיום חסר היסטידין ו / או assayed עבור β-גל הפעילות האנזימטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> איור 2. Y2H ממליץ RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה. (א) סכמטי המתאר את (הפיתיון) סדרת שברי חלבון חופפים האדם RyR2 נבדק במערכת Y2H עבור<html> אינטראקציה עם מבנה RyR2 N-terminal AD4L (טרף). לתוצאות בדיקות איכותיות מתקבלות על ידי מבחני מושבה מתיח מסנן נייר β-גל מסומנות ב &quot;+&quot; בכפולות או &quot;-&quot; לאינטראקציה שלילית (ב) מבחני כמותי נוזלי β-גל מנורמל נגד הבקרה החיובית (pVA3 מקודד עבור GAL4 DNA-BD. היתוך עם חלבון p53; pTD1 מקודד עבור היתוך לספירה GAL4 עם אנטיגן T גדול SV40). שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> איור 3. Co-IP תרשים זרימה. בתאי יונקים, שיתוף transfected עם פלסמידים X ו- Y, הם הומוגני-solubilized דטרגנט לייצר lysate התא בשימוש assay שיתוף IP, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> איור 4. Co-IP מציין RyR2 N הסופית- דומיין עצמית אינטראקציה בתאי יונקים. HEK293 התאים היו שיתוף transfected עבור שיתוף ביטוי חולף של cMyc מתויג (BT4L) ו HA-tagged (AD4L) RyR2 N הסופית- מושלם ( שאריות 1 - 906). AD4L היה immunoprecipitated עם Ab HA מ בחורים-solubilized ו lysate HEK293 שטופל dithiothreitol, ואילו שליטה שלילי, מבחנים-IP שיתוף בוצעו עם IgG הארנב הלא חיסוני. חלבוני immunoprecipitated חוממו על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על 20 מילים-אמפר עבור 3 שעות באמצעות ג&#39;לים 6% SDS-PAGE נפרד עמוס 1/10 ה או 9/10 ה של דגימות ה- IP. העברת חלבון לאחר ב 80 V עבור שעה 2 על polyvinyקרום lidene difluoride, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab HA (A) או Ab cMyc (B), בהתאמה, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1: 10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Aliquot של lysate תא, 1/50 ה מנפח מעובד בדגימות IP, נכלל גם לשרת רגיל מסה מולקולרית כמו. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> איור 5. Cross-linking תרשים זרימה. בתאי יונקים, טרנספקציה עם פלסמיד X, הם הומוגני נתון התגובה עם glutaraldehyde ב assay cross-linking, ואחריו SDS-PAGE ו immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> איור 6. Cross-linking מציין RyR2 N הסופית- דומיין tetramer גיבוש HEK293 התאים היו transfected עבור ביטוי חולף של מתויג cMyc (BT4L) RyR2 N הסופית- מושלם (שאריות 1 - 906).. homogenate הסלולרי, שטופל dithiothreitol סוכן הצמצום, הודגר עם glutaraldehyde עבור נקודות זמן המצוינות. דוגמאות היו מחוממות על 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והחליטו על ידי SDS-PAGE (6% ג&#39;ל) ב 20 mA עבור 3 שעות. בעקבות העברת חלבון ב 80 V עבור שעה 2 על קרום difluoride polyvinylidene, ניתוח immunoblotting בוצע באמצעות (1: 1,000 דילול) Ab cMyc, ואחריו IgG עכבר אנטי peroxidase מצומדות חזרת (1:10,000 דילול) וזיהוי chemiluminescence משופרת (1 חשיפה דקה). Monomeric (M: ~ 100 KDA) ו tetrameric (T) צורות מסומנות על ידי החצים. שונה מ 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study at JoVE.com

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.6K Views.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Video: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Biochemistry

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Bioengineering

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, specifically to study the function of new genes/proteins associated with a disease, identified during the genetic diagnosis. For the development of such cell lines, two major issues have to be untangled: insertion of the CRISPR tools (the Cas9 and the guide RNA) with high efficiency into the chosen cells, and restriction of the Cas9 activity to the specific deletion of the chosen gene. The protocol described here is dedicated to the insertion of the CRISPR tools in difficult to transfect cells, such as muscle cells. This protocol is based on the use of lentiviruses, produced with plasmids publicly available, for which all the cloning steps are described to target a gene of interest. The control of Cas9 activity has been performed using an adaptation of a previously described system called KamiCas9, in which the transduction of the cells with a lentivirus encoding a guide RNA targeting the Cas9 allows the progressive abolition of Cas9 expression. This protocol has been applied to the development of a RYR1-knock out human muscle cell line, which has been further characterized at the protein and functional level, to confirm the knockout of this important calcium channel involved in muscle intracellular calcium release and in excitation-contraction coupling. The procedure described here can easily be applied to other genes in muscle cells or in other difficult to transfect cells and produce valuable tools to study these genes in human cells.

The protocol describes how to generate knock-out myoblasts using CRISPR/Cas9, starting from the design of guide-RNAs to the cellular cloning and characterization of the knock-out clones.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Genetics

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Chemistry

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Neuroscience

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Medicine

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

גישות גנטיות ביוכימיים עבור

Summary

Explore More Videos