Este trabalho foi financiado pela British Heart Foundation de Bolsas de SZ (FS / 08/063 e FS / 15/30/31494).

<ol>
	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels.">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li><li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors.">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li><li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors.">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li><li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail.">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li><li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interactions:+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations.">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li><li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast:+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits.">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li><li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies:+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system.">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li><li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system.">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li><li>Elion, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8,+Detection+of+protein-protein+interactions+by+coprecipitation.">Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9,+Calcium+phosphate+transfection.">Chapter 9, Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2003).</li><li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+(TPC)-binding+protein.">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain.">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease.">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li><li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation.">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes.">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li><li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaraldehyde:+behavior+in+aqueous+solution,+reaction+with+proteins,+and+application+to+enzyme+crosslinking.">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li><li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis.">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6.">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li><li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin.">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li><li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein.">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li><li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart.">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li><li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+oligomerization:+how+and+why.">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li><li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+oligomerization,+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states.">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li><li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration:+lessons+from+the+Alzheimer's+amyloid+beta-peptide.">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li><li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution:+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation.">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li><li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization.">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li><li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors:+biochemical+and+biophysical+methods.">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A formação de homo-oligómeros de proteínas é um processo biológico fundamental que regula a actividade de factores de transcrição, enzimas, canais iónicos e receptores 25,26. Importante, oligomerização proteína tem também implicações patológicas incluindo neurodegeneração e doença cardíaca arritmogênica 4,27. As metodologias descritas neste artigo são usados ​​para identificar interações de domínio do domínio de mediação proteína auto-associação e oligomerização. Abaixo, destacamos nas etapas críticas dentro de cada protocolo, e discutimos considerações importantes, limitações e solução de problemas. O sistema Y2H pode ser utilizado pela primeira vez para o rastreio de potenciais parceiros de proteína interagindo por causa de sua relativamente alta throughput screening, facilidade de uso e resultados altamente reprodutíveis. procedimentos y2h são realizadas em um laboratório de microbiologia com incubadoras padrão (placa ou shaker) e instalações de sala de contenção. A utilização de FRcélulas competentes preparadas eshly (passo 1.1.8) é crítica para a transformação de levedura de alta eficiência, enquanto que para obter os melhores resultados em ensaios β-Gal, recém colónias de levedura crescido (até 5 dias de idade) deve ser utilizada (passo 1.2.3). Sistemas baseados em outros do que GAL4 e / ou genes repórter adicionais / alternativas fatores de transcrição estão disponíveis e, portanto, isca e plasmídeos presa deve ser combinado com a estirpe Y2H adequado. Algumas estirpes devem ser cultivadas na presença de 3-amino-1,2,4-triazole, um inibidor competitivo da proteína HIS3, de modo a extinguir qualquer expressão constitutiva do gene repórter HIS3 de 7,8. Expressão de proteínas de fusão de iscas e de destino deverá ser verificada por imunotransferência 17. No caso de isca / proteínas de fusão de presa são tóxicos para as leveduras, os níveis mais baixos de proteína toleráveis ​​poderia ser conseguido por clonagem em diferentes vectores de isco, onde / é presa expressão conduzido por um promotor diferente. Além disso, é essencial para assegurar tproteínas de fusão de isca / rapina chapéu não exibem a atividade do gene repórter autónoma. activação do gene repórter Autónoma pode ser resgatado por modificar a construção para remover a região responsável, ou trocando o GAL4 DNA-BD e fusões AD para as duas proteínas testadas. Além disso, os domínios transmembranares são melhor omitido de construções de isca / presa porque pode induzir misfolding ou mislocalization de proteínas de fusão em compartimentos de membrana intracelular. Com efeito, a principal desvantagem do sistema Y2H é que as proteínas isco e alvo estão localizadas no núcleo de levedura de distância da sua localização subcelular fisiológico e potencialmente desprovido modificações pós-traducionais específicas, resultando em falsos-positivos ou falsos negativos interacções 6-9 . Os sistemas de expressão heterólogos de mamífero são mais adequados para o estudo de proteínas de membrana integrais de mamífero em termos de conformação, de modificações pós-traducionais e localização subcelular.Um dos métodos de transfecção celular mais utilizado é a precipitação de fosfato de cálcio, principalmente por causa do equipamento mínimo e reagentes necessários 11,15. Métodos alternativos, ou seja, electroporação, lipos somas, lípidos catiónicos e polímeros, podem originar uma maior eficiência de transfecção, dependendo da linha celular e construção utilizada. Em geral, os factores que afectam a eficiência da transfecção primárias são a qualidade do ADN de plasmídeo e de células de saúde / viabilidade. Os melhores resultados são obtidos quando o DNA de plasmídeo de mais alta pureza (260 nm / 280 nm Taxa de absorção de ~ 1,8) e células que se dividem activamente são utilizados. As células devem, portanto, ser transfectado em não mais do que 60 - 70% de confluência (passo 2.1.2), porque a capacidade de tomar-se DNA estranho está relacionada com a área de superfície da célula exposta ao meio 11. Além disso, a inclusão de antibióticos no meio de cultura durante a transfecção (passo 2.1.3) não é aconselhável devido a um aumento da morte celular 15. Fou precipitação com fosfato de cálcio, em particular, a preparação, cuidadosa e ajustamento do pH (de 7,05 precisamente) da solução de HBS 2x (passo 2.1.1), e a formação correcta de DNA plasmídeo / cálcio / fosfato complexos por mistura vigorosa (passo 2.1.5) são passos críticos para alta transfecção eficiência. Tipicamente, a expressão da proteína por picos de transfecção transiente dentro de 24-72 horas. Uma vez que as células são colhidas, procedimentos subsequentes devem ser realizadas a 4 ° C para minimizar a actividade de protease, e adição de inibidores de protease é recomendado. homogeneização celular deve ser seguido por um passo de centrifugação para remover os núcleos porque o ADN cromossómico pode aumentar a viscosidade da solução e aumentar a ligação não específica. Assim, homogeneização por meios mecânicos em um tampão iso-osmótico é preferido, usualmente na (0,3 M) de sacarose, ou (150 mM) de NaCl. De um modo geral, os tampões à base de sacarose são conhecidos para melhorar a estabilidade da proteína e reduzir a agregação de proteínas não-nativo potencial, mas devido a phidratação referencial na superfície da proteína, as interacções proteína-proteína electrostáticas são favorecidos. Por outro lado, tampões à base de sal influenciar a carga líquida de grupos laterais de aminoácidos carregados na superfície da proteína, tendo assim um viés para mais interações hidrofóbicas à base 28. Co-IP é o ensaio bioquímico mais vulgarmente empregues para avaliar as interacções proteína-proteína, especialmente a partir de tecido nativo. Sua principal desvantagem é a exigência de anticorpos altamente específicos validados para uso em IP e immunoblotting 10,16,18. Assim, as proteínas recombinantes são frequentemente marcado com um epítopo de péptido, por exemplo., Hemaglutinina da gripe (YPYDVPDYA) ou cMyc humana (EQKLISEEDL), para o qual os anticorpos específicos de elevada afinidade estão disponíveis comercialmente. Se desejado, o anticorpo imunoprecipitação pode ser quimicamente conjugados para a Proteína-A resina para evitar a sua eluição e detecção durante a fase de imunotransferência que podem obscurecer o co-precipitado PRotein 16; Para conseguir isso, temos utilizado com sucesso o agente de ligação cruzada química 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. É imperativo que um detergente apropriado está incluído no tampão de IP e o material insolúvel das células homogeneizadas é removido por centrifugação para minimizar a ligação não específica (passo 3.1.3). A escolha e a concentração de detergente são considerações importantes: detergentes fortes e / ou concentrações mais elevadas reduzem substancialmente não específico de ligação, mas podem também abolir X: interacção proteína Y, enquanto que concentrações mais baixas ou detergentes mais leves pode permitir uma interacção fraca para ser observada, mas pode resultará em ligação não-específica excessiva. Detergentes força intermediários são os preferidos, por exemplo, Triton X-100 a 0,5 -. 1% de concentração. Para reduzir ainda mais a ligação não específica, uma proteína neutro (por exemplo, albumina de soro bovina a 100 ug / ml) pode ser incluído no tampão de IP, e / ou do lisado celular pode ser pré-Cleared com incubação prévia com resina de Proteína-A sozinho. O número de lavagens devem ser optimizados para a X: Y par testado, tipicamente três de 10 min lavagens com tampão IP (passo 3.1.9). Em qualquer caso, uma amostra de co-IP com IgG não-imune, como o anticorpo imunoprecipitar deve sempre ser processados ​​em paralelo para servir de controlo negativo (passo 3.1.6). A principal vantagem de reticulação química é que informa sobre a composição estequiométrica da proteína de homo-oligómero. O glutaraldeído é um agente de ligação cruzada comumente usado, porque não requer equipamento especializado e gera termicamente e quimicamente ligações cruzadas estáveis ​​entre proteínas que interagem 19,20. Os compostos com grupos amino livres deve ser omitido dos buffers de ensaio (passo 3.2.1), porque eles vão parar a reacção química. a concentração de glutaraldeído e tempo de reacção (passo 3.2.4) deve ser optimizado para o complexo de proteína oligomérica de interesse. A principal desvantagem desta técnica, especialiado quando realizada em preparações de células inteiras, é a não especificidade da reacção química que poderia produzir agregados de proteínas artificiais que não têm significado biológico. Alternativa in vivo (por ex., Fluorescência de ressonância de transferência de energia, a fluorescência bi-molecular ou de complementação de luminescência) e em técnicas in vitro (por ex., Cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica, de titulação isotérmica calorimetria) estão disponíveis para a caracterização da proteína de auto-associação e de avaliação de oligomerização estequiometria 29,30. Cada método tem as suas próprias vantagens e desvantagens, e que pode ser mais adequado para o estudo de uma proteína específica, dependendo de purificação de proteína / estabilidade e disponibilidade do equipamento / reagente. Os três métodos complementares aqui descritos em detalhe, nomeadamente Y2H, co-IP e a ligação cruzada, têm sido utilizados em combinação para fornecer evidências convincentes para RyR2 homo-oligomeR formação isoladamente e dentro de uma célula viva.

A contração do músculo esquelético e cardíaco é desencadeada por retículo sarcoplasmático Ca 2+ liberação mediada por RyR. Existem três isoformas RYR de mamífero com o canal funcional composta de quatro subunidades idênticas. Cada subunidade consiste de RyR uma grande porção N-terminal citoplasmático reguladora e uma pequena parte do terminal C contendo os domínios de transmembrana que formam uma alta condutância Ca 2+ poro. Intra anormal e inter-subunidades interações subjacentes disfunção canal RyR e resultar em doenças neuromusculares e cardíacos 1. A identificação e caracterização de domínios específicos envolvidos na estrutura RyR: relação de função é, portanto, crucial para a compreensão da fisiopatologia RyR. técnicas de interacção proteína-proteína bioquímicos tradicionais exigem quantidades substanciais de proteína purificada, muitas vezes produzidos em bactérias. Isto não é possível no caso de o RyR, uma muito grande membrana de protein composto de ~ 5000 aminoácidos, enquanto que os seus fragmentos recombinantes não são facilmente passível de expressão bacteriano e purificação. Assim, são necessários sistemas de expressão alternativos que envolvem células hospedeiras eucarióticas para as proteínas de membrana integrais de mamífero. Temos anteriormente empregue Y2H, co-IP e ensaios de ligação cruzada para demonstrar que colectivamente N-terminal de tetramerização é uma característica estrutural que é conservado entre os três isoformas de mamífero RyR 2,3. Mais importante, verificou-se que uma única mutação de ponto associado à doença cardíaca arritmogénica perturba N-terminal de auto-associação e resulta em um canal de RyR disfuncional 4. Também têm aplicado estas técnicas para estudos de oligomerização do RyR cauda citoplasmática de terminal-C 5, bem como o N-terminal do canal de Ca2 + intracelular homólogo de libertação, o receptor de inositol trifosfato 1,4,5 2. No ensaio Y2H, o interactiem entre duas proteínas (X e Y) é medido pela reconstituição de um factor de transcrição funcional (GAL4) e a activação subsequente de genes repórter 6-9. Dois vectores de clonagem diferentes são usados ​​para gerar fusões das duas proteínas testadas com os dois domínios fisicamente separáveis, independentes de GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteína de fusão X (isca) e Activação de domínio (AD) / proteína Y fusion (alvo). O Y2H pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de fusões de AD da mesma proteína GAL4 DNA-BD e. Geneticamente modificada estirpes Y2H são GAL4 e GAL80 deficiente (GAL80 a proteína é um repressor de GAL4), bem como TRP1 e LEU2 deficiente (para proporcionar selecção nutricional para isco e presa plasmídeos, respectivamente). No núcleo de levedura, os péptidos de DNA-BD e Ad recombinantes são postos em proximidade física para produzir um factor de transcrição de GAL4 híbrido apenas através das suas fusões X: Y interaction. Esta abordagem permite o mapeamento genético rápida para detectar interacções proteína-proteína de activação da transcrição através do paralelo da prototrófica (codificação de HIS3 de uma enzima necessário para a biossíntese de histidina) e cromogénico (LacZ que codifica para β-galactosidase (β-Gal)) genes repórter. A principal vantagem do Y2H é que é um ensaio in vivo que detecta interacções proteína-proteína, mesmo fracas ou transitórios. Além disso, a detecção envolve a utilização simples de seleção de crescimento (em meio sem histidina) ou de um ensaio colorimétrico (β-Gal), sem necessidade de purificação das proteínas isco e de destino ou a geração de anticorpos específicos. Além disso, o Y2H pode ser utilizado para rastrear um conjunto de clones desconhecidos aleatórios (clones biblioteca de ADNc fundido com GAL4 AD) para novos parceiros de ligação de uma proteína isco, também dão acesso directo ao ADNc da proteína biblioteca. Para estender as observações y2h, independtécnicas bioquímicas ent pode ser empregue. Os ensaios de ligação cruzada combinados com imunotransferência co-IP e são métodos utilizados para detectar associações de proteínas em amostras de misturas complexas, por exemplo., Lisados ​​de células inteiras 10. A sua principal vantagem é que eles relatam em interacções proteína-proteína a partir de tecido nativo, ao contrário de outros métodos que requerem a utilização de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes podem também ser utilizados, normalmente expressos numa linha de células de mamífero, onde eles são susceptíveis de ter as suas modificações de conformação correcta e pós-tradução, assim como a localização subcelular. No entanto, uma vez que a co-IP e a ligação cruzada são, em ensaios in vitro fazendo uso de células homogeneizadas, é necessário confirmar se os dois parceiros de proteína são co-localizada na célula intacta 11. Rotineiramente usar a transfecção de células de mamífero para expressar HEK293 transientemente integral da membrana de mamíferos e de proteínas citosólicas usando o método de precipitação com fosfato de cálcio 2-4,12-14, Aqui descrito em detalhe. Esta é uma forma barata para entregar eficazmente o DNA de plasmídeo dentro das células, mas é dependente da linha de célula particular utilizado e a confluência celular, bem como a pureza do ADN do plasmídeo 11,15. O ensaio de co-IP envolve o isolamento da proteína nativa ou recombinante de interesse a partir de lisados ​​de células em condições não desnaturantes, permitindo a co-purificação de parceiros de interacção 10,16 putativos. É necessária a utilização de dois anticorpos independentes, o anticorpo para o isolamento de imunoprecipitar a proteína X, e o anticorpo para a detecção de imunotransferência Y. parceiro de proteína que ele pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de dois diferentes fusões com dois epitopo diferente marcações (por exemplo., HA e cMyc). O anticorpo é ligado imunoprecipitação através da sua região Fe em Proteína-A (ou proteína-G, dependendo das espécies de animais em que o anticorpo foi produzido), queestá conjugado a agarose (ou sefarose) resina. Proteína X é precipitado pelo anticorpo: Proteína-A resina após a incubação com o ligado de células, ou seja, a fracção solúvel em detergente de células homogeneizadas. Proteína imuno-complexos são eluídas com tampão contendo SDS e depois analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência, utilizando um anticorpo para detectar a presença da proteína Y 17. Co-IP deve ser realizado com proteínas solúvel em detergente para evitar excessiva ligação não-específica. A escolha do detergente e da sua concentração, bem como o número de lavagens, deve ser optimizado para cada X: Y par 10,16,18. A ligação cruzada é empregue para determinar a estequiometria do complexo de proteína oligomérica. Ele baseia-se numa reacção química para criar ligações covalentes entre protï¿½meros interagindo adjacentes, e por conseguinte, permite a preservação do estado oligomérico da proteína durante a separação por SDS-PAGE. Existem inúmeros REAGE cross-linkingNTS de vários comprimentos e química dirigidos a diferentes grupos reactivos em proteínas, aminas primárias, tipicamente carboxílico ou grupos tiol. Aqui, nós descrevemos o uso de glutaraldeído (OHC (CH2) 3-CHO), um agente de reticulação homo-bi-funcionais, com dois grupos aldeído em ambas as extremidades que reagem com grupos amino livres presentes em resíduos de lisina 19,20. A reticulação é seguido de um modo dependente da concentração-tempo ou resultando na formação do aduto. Glutaraldeído reacção é parada com hidrazina (H 2 NNH 2) e amostras de proteína são, então, analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting 17 para avaliar o seu estado de oligomerização. Devemos notar que a ligação cruzada não induz oligomerização, mas apenas cria pontes estáveis ​​entre complexos de proteínas pré-existentes. Considerações importantes ao realizar experiências de ligação cruzada incluem a escolha do agente de reticulação, a sua concentração e tempo de reação 19,20.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

No sistema Y2H, a isca: presa interacção é inicialmente testado por selecção em meio de crescimento de levedura falta (triptofano, leucina e) histidina e, subsequentemente, avaliadas por β-Gal ensaios de actividade enzimática (Figura 1). Levedura cultivadas em histidina falta médio tem taxa de crescimento lento, que depende da força da isca: interação proteína presa. O ensaio β-Gal é levada a cabo em levedura (cultivadas em meio sem triptofano e leucina única) seja crescente no suporte sólido (placas de agar) ou em cultura líquida, com os últimos resultados quantitativos rendimento. Nós temos utilizado com sucesso o Y2H para identificar as interações domínio de domínio dentro do RyR2, bem como novos parceiros de proteína 2-4,12,21,22. Por exemplo, nós analisamos uma série de construções de sobreposição abrangendo todo o comprimento da sequência do péptido RyR2 para a interacção com um fragmento N-terminal (AD4L: RyR2 resíduos 1-906 fundido com GAL4 AD). 3 ensaios filtros Colony-elevador de papel β-Gal produzida vivas colónias de levedura de cor azul única para o BT4L: par AD4L (Figura 2A), mostrando que AD4L interage com ele mesmo, ou seja, a BT4L construir (resíduos RyR2 1-906 fundidos com GAL4 DNA-BD). Pálidos colónias azuis foram detectados pela BT8: par AD4L sugerindo uma associação mais fraca secundário com o domínio C-terminal extremo (BT8), enquanto leveduras co-transformada com qualquer outra construção permaneceu branca e, portanto, negativo para isco: a interação proteína presa. Os resultados quantitativos obtidos através de ensaios de β-Gal líquidos (Figura 2B), indicado BT4L robusta: equivalente interacção AD4L em força para a conhecida associação entre a proteína p53 (pVA3) e o antigénio T grande de SV40 (pTD1), ao passo que o BT8: interacção AD4L foi consideravelmente mais fracos (&lt;10% em comparação com o controlo). Nós rotineiramente realizar experiências co-IP (Figura 3) fepois expressão transiente numa linha de células de mamíferos (células HEK293), como um ensaio bioquímico independente para reforçar as conclusões Y2H 2-4,12-14,21-24. Para verificar a RyR2 N-terminal de auto-interacção, dois plasmídeos separados que codificam para os resíduos de RyR2 1-906 marcadas com tanto o epitopo péptido cMyc ou HA (BT4L e AD4L, respectivamente), foram co-transfectados em células HEK293 utilizando o método de fosfato de cálcio precipitação 3. A fracção pós-nuclear de células homogeneizadas foi solubilizado com os detergentes CHAPS, e o material insolúvel foi removido por centrifugação para produzir o lisado celular. O ligado de células, tratadas com o agente redução de ditiotreitol foi então incubado com Ac de HA e esferas de Proteína-A Sepharose para imunoprecipitar AD4L marcada com HA. Amostras co-IP, eluídas com tampão contendo SDS, foram carregadas em dois geles de SDS-PAGE separadas (1/10 e 9/10 de divisão) e analisados ​​por imunotransf erência com Ab HA e Ab cMyc, respectively. Bem sucedido IP directa de AD4L (~ 100 kDa) por Ab HA foi verificada por imunotransferência, mas não no controlo negativo utilizando IgG de coelho não imune (Figura 4A). Importante, cMyc-tagged BT4L (~ 100 kDa) foi recuperado apenas no HA IP Ab, e não no controlo negativo na ausência de AD4L imunoprecipitado (Figura 4B). ensaios y2h e co-IP forneceram evidências consistentes para RyR2 N-terminal de auto-interação, mas eles não informam sobre o estado de oligomerização do domínio N-terminal, ou seja, se ele faz apenas dímeros ou complexos mais elevados. Deve notar-se que os complexos se dissociam e apenas as subunidades compreendendo será detectada por SDS-PAGE, devido a SDS e a desnaturação de proteínas induzida pelo calor, que suprime interacções proteína-proteína. Para ultrapassar esta situação, podemos utilizar a reticulação (Figura 5) que quimicamente e estavelmente conjuga protei pré-existenten oligómeros cuja massa molecular, pode então ser analisada por SDS-PAGE tamanho separação 2-5. Por exemplo, homogenato de células HEK293 que expressam cMyc-BT4L, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi feita reagir com glutaraldeido e analisaram-se por SDS-PAGE e imunotransferência utilizando Ab cMyc (Figura 6). Em adição ao monómero (~ 100 kDa), uma banda de proteína de elevada massa molecular de ~ 400 kDa foi detectada de uma forma dependente do tempo, indicando RyR2 N-terminal tetrâmero formação 3. Notavelmente, tetrâmero foi a espécie predominante oligoméricas, com dímero mínimo e bandas trimer observados. Para determinar sua massa molecular aparente, o oligômero BT4L foi separado por meio de 4-15% de gel de gradiente de SDS-PAGE 3. Produzimos a massa / gel de curva padrão retardo molecular utilizando padrões de proteínas com uma gama de 30-460 kDa, e calculou-se o oligómero de ser 358 kDa 15 (n = 4). Esta massa molecular aparente está de acordo com um tetrâmero BT4L dispostos numaforma circular fechada em vez de na forma linear, como esperado a partir da disposição das quatro subunidades dentro do canal RyR2 nativa. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Y2H Fluxograma. Yeast, co-transformada com isca e de destino plasmídeos, é selecionada para crescimento em meio sem histidina e / ou testado quanto à actividade enzimática β-Gal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H Sugere RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção. (A) Representação esquemática que descreve a série (isca) de fragmentos de proteínas humanas sobreposição RyR2 testados no sistema para Y2H<html> interacção com o constructo AD4L RyR2 N-terminal (presa). Os resultados qualitativos obtidos por meio de ensaios de papel β-Gal filtro colónia-lift estão indicados em &quot;+&quot; múltiplos ou &quot;-&quot; para a interação negativa ensaios (B) líquidos Quantitative β-Gal normalizados contra o controle positivo (pVA3 codifica para GAL4 DNA-BD. fusão com a proteína p53; pTD1 codifica para a fusão AD GAL4 com antigénio T grande SV40). Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP fluxograma. As células de mamíferos, co-transfectadas com plasmídeos que X e Y, são homogeneizados e para produzir o lisado celular utilizada no ensaio de co-IP, seguido de SDS-PAGE e imunotransferência solubilizada por detergente.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção em células de mamífero. As células HEK293 foram co-transfectados para a co-expressão transitória de cMyc-etiquetado (BT4L) e marcada com HA domínio (AD4L) RyR2 N-terminal ( os resíduos 1-906). AD4L foi imunoprecipitada com Ab HA de solubilizadas em CHAPS e tratado com ditiotreitol HEK293 lisado, enquanto que os ensaios de controle, co-IP como negativos foram realizados com IgG de coelho não imune. As proteínas imunoprecipitadas foram aquecidos a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas em 20 mA durante 3 horas através de géis de SDS-PAGE 6% separadas carregadas com 1/10 ou 9/10 de amostras IP. Na sequência da transferência de proteína a 80 V durante 2 h para polyvinymembrana de difluoreto de lidene, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab HA (A) ou Ab cMyc (B), respectivamente, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (diluição de 1: 10.000) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Uma alíquota de lisado celular, 1/50 do volume processado em amostras IP, também foi incluído para servir como padrão de massa molecular. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. Fluxograma de reticulação. As células de mamíferos, transf ectadas com o plasmídeo X, são homogeneizados e submetido a reacção com o glutaraldeído no ensaio de reticulação, seguido por SDS-PAGE e immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. A ligação cruzada Indica RyR2 N-terminal Domínio A formação Tetrâmero células HEK293 que foram transfectadas para a expressão transitória de cMyc-tagged domínio (BT4L) RyR2 N-terminal (resíduos 1 - 906).. homogenato celular, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi incubada com glutaraldeído para os pontos de tempo indicados. As amostras foram aquecidas a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas por SDS-PAGE (gel de 6%) a 20 mA durante 3 horas. Após a transferência de proteína, a 80 V durante 2 horas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab cMyc, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (1:10000 diluição) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Monomérico (H: ~ 100 kDa) e formas tetramérica (T) são indicados pelas setas. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study at JoVE.com

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.4K visualizações.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Vídeo: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Bioquímica

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

Análise da Membrana Tubular Networks em Cardiac Miócitos de átrios e ventrículos

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Bioengenharia

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, specifically to study the function of new genes/proteins associated with a disease, identified during the genetic diagnosis. For the development of such cell lines, two major issues have to be untangled: insertion of the CRISPR tools (the Cas9 and the guide RNA) with high efficiency into the chosen cells, and restriction of the Cas9 activity to the specific deletion of the chosen gene. The protocol described here is dedicated to the insertion of the CRISPR tools in difficult to transfect cells, such as muscle cells. This protocol is based on the use of lentiviruses, produced with plasmids publicly available, for which all the cloning steps are described to target a gene of interest. The control of Cas9 activity has been performed using an adaptation of a previously described system called KamiCas9, in which the transduction of the cells with a lentivirus encoding a guide RNA targeting the Cas9 allows the progressive abolition of Cas9 expression. This protocol has been applied to the development of a RYR1-knock out human muscle cell line, which has been further characterized at the protein and functional level, to confirm the knockout of this important calcium channel involved in muscle intracellular calcium release and in excitation-contraction coupling. The procedure described here can easily be applied to other genes in muscle cells or in other difficult to transfect cells and produce valuable tools to study these genes in human cells.

The protocol describes how to generate knock-out myoblasts using CRISPR/Cas9, starting from the design of guide-RNAs to the cellular cloning and characterization of the knock-out clones.

Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Genética

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Química

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologia

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Neurociência

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Medicina

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Abordagens genéticas e bioquímicas para

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo