1. Los preparativos de levadura <ol><li> Transformar las cepas de levadura con un plásmido que lleva un casete de GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts). </li><li> Crecer la levadura en medios sintéticos que contienen 2% de rafinosa durante 24 horas y de nuevo se diluyó a 2% de galactosa para medios que contienen 16 hr o O / N. Incubar las células a 30 ° C con agitación a 200 rpm. </li><li> A la mañana siguiente, se diluye la cepa consulta a OD 600 = 0,2. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) hasta que el cultivo alcanza una DO600 = 0,8-1,0. </li><li> Para reprimir la expresión (así como para supervisar sólo la piscina ya traducido y doblado de GFP-Ubc9 ts), los medios de cambio a medio sintético suplementado con 2% de glucosa (SD) 30 min antes de la imagen. </li><li> Tratamiento - choque térmico de las células durante 20 min a 37 ° C para inducir plegamiento incorrecto, o continuamente en microscopio incubadora a seguir la agregación de proteínas en condiciones de choque térmico. Nota - Si está utilizando el microscopio a cualquier temperatura por encima de RT, pre-calentar for aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura a lo largo del cuerpo del microscopio y los objetivos (ver más abajo). </li></ol> 2. Plate \ portaobjetos <ol><li> Elige placa apropiada. La principal consideración es la capacidad para mantener la atención durante la adquisición de imágenes. Los siguientes puntos son fundamentales para la formación de imágenes 4D y no por lapsos de tiempo de imagen en 2D o 3D. <ol><li> Multiple pocillos de placa de la parte inferior de los diferentes pozos puede no ser homogéneo (es decir, los pozos será a diferentes alturas con respecto al objetivo). Esto hará que sea difícil mantener el enfoque a través de puntos XY y puntos de tiempo, independientemente de la técnica de enfoque automático que se utiliza. </li><li> Material de la transparencia: vidrio plástico vs. Portaobjetos de vidrio de fondo son más z-homogénea entre los pozos, pero son más caros. </li><li> Espesor de la parte inferior de la placa: se suelen utilizar placas de fondo cubreobjetos índice de 1,5, pero el índice 1 es también aceptable, dependiendo del objetivo. </li></ol></li><li> Cover parte inferior de la placa de \ diapositiva con ConA (0,25 mg / ml) durante 10 min. ConA se usa para adherir las células al portaobjetos, lo que permite después de una sola celda con el tiempo. </li><li> Retire ConA e incubar el portaobjetos en una campana química de modo que el exceso de ConA se evaporará. </li><li> Placa de 200 l de muestra de levadura (OD 600 = 0,5) en el ConAed bien. </li><li> Incubar durante 15 min, para permitir que las células se adhieren a la superficie de la placa. </li><li> Extraer el medio, y se lavan tres veces con medio nuevo para obtener una capa de células. Nota: si un lapso de tiempo está previsto, sembrar las células escasamente de modo que los nuevos brotes no se llena y interrumpir la región de interés. </li></ol> 3. Preparados para microscopio <ol><li> Nosotros usamos un microscopio confocal Nikon A1Rsi con algunas modificaciones no estándar. Para imágenes de levadura se utiliza hasta 4 láseres (405 nm, 50 mW láser CUBE; 457-514 nm, 65 mW láser de ion argón; 561 nm, 50 mW láser de zafiro, y 640 nm, 40 mW CUBE láser), y hasta 4 PMTs equipados confiltros. La mayor parte de nuestra imagen se realiza con un conjunto de filtro verde para EGFP y un juego de filtros rojo para mCherry y tdTomato. Con GFP y mCherry casi no hay bleedthrough, por lo tanto, que a menudo utilizan la comprobación simultánea. Sin embargo, de exploración lineal también se puede utilizar para prevenir bleedthrough cuando ocurre. Nuestra confocal también está equipado con una etapa PInano Piezo (MCL), que puede hacer que 3 mseg en z, permitiendo 2-3 z-pilas (30-50 secciones) por segundo. El sistema también tiene un detector espectral, enfoque perfecto (láser de desplazamiento), y dos escáneres - un escáner galvano y un escáner resonante. </li><li> Elige objetivo apropiado. Consideraciones principales: <ol><li> Agua / aceite / aire objetivo: la principal consideración es el índice de refracción del medio formador de imágenes vs el medio de la muestra. <ol><li> Ventajas del aceite de objetivos: <ol><li> Objetivos de petróleo pueden tener mayores aperturas numéricas (aceite ligero descansos más que el agua, y por lo tanto más fotones volver al objetivo). Objetivos del petróleo puede tener hastaa NA 1,49, en comparación con 1,27 para el agua. (Sin embargo, esto no es realmente una gran diferencia en la resolución). </li><li> El índice de refracción del aceite coincida con el índice de refracción del vidrio, por lo tanto, no se pierden fotones pasando de la muestra, a través del cristal, para el objetivo. (Nota - eligió un aceite de inmersión que tiene un índice de refracción que es apropiado para su objetivo y su cubreobjetos). </li><li> Petróleo permite sin problemas de tiempo largo lapsus, ya que no se evapora. </li></ol> Desventajas de aceite Objetivo: <ol><li> La mayor resolución habilitado por la NA más alta de los objetivos de aceite se degrada rápidamente si la luz tiene que viajar a través de un medio acuoso (tal como una célula). </li><li> Imágenes suelen tener las aberraciones esféricas y más un &quot;estirado&quot; efecto en 3D. </li><li> El petróleo es pegajoso, sucio, y un peligro para los objetivos. </li></ol></li><li> Ventajas objetivas de agua <ol><li> La propia célula es acuosa, por lo tanto hay menos distorsiones en Z, Aª de la resolución sigue siendo alta profundamente en una muestra acuosa. </li><li> Limpie y fácil de usar. Agua desventajas objetivas: se evapora rápidamente, por lo tanto, no es adecuado para películas largas sin arreglos especiales realizados para bombear agua continuamente al objetivo. </li></ol></li><li> Aire ventajas objetivas: 1. Ningún material se pierde / se evapora durante la adquisición de múltiples puntos o una película larga. 2. Limpie y fácil de usar. Desventaja: baja resolución y sensibilidad de señal baja. </li></ol></li><li> La temperatura ambiente y la incubadora: temperatura cambiante afecta propiedades de la materia, y en sistemas delicados cambia el enfoque. La temperatura debe ser ajustado antes de la elección de puntos de adquisición. Cambio de la temperatura durante la adquisición de imágenes se interrumpen y se traducirá en la pérdida de concentración. Dejamos que nuestro sistema de microscopio equilibrar durante 2 horas a la temperatura deseada antes de formación de imágenes. </li><li> Collares de corrección: Objetivos Muchos vienen con un anillo de corrección que permiteel objetivo que se ha ajustado para un determinado cubreobjetos espesor. Le recomendamos que ajuste el collar de corrección durante el uso de perlas fluorescentes para visualizar la función de dispersión de punto. Esto asegurará ajustes correctos para cada muestra. </li><li> Titulares estables de ejemplo: nos encontramos con que la mayoría de los soportes de muestra disponibles en el mercado son la parte más débil del microscopio. Son a menudo inestable y no directamente. Esto es un desastre para la alta resolución, multi-punto de imagen 4D. Diseñamos nuestros propios soportes de muestra que son rectas y bien ajustados al escenario. También puede ser atornillada en caso necesario. </li><li> Multipunto adquisición: nuestro sistema de imagen está equipada con la Nikon &quot;enfoque perfecto&quot; del sistema, que es básicamente una impresora láser de enfoque automático mecanismo. Sin embargo, el enfoque automático no es necesariamente necesario con imágenes de 4D, especialmente si el sistema no va a la deriva mucho. </li></ol></li></ol> 4. Proyección de imagen <ol><li> Encienda el sistema: láseres, estadio, controlador, cámara y computer software. </li><li> Coloque la placa de soporte de la platina, debidamente asegurada y estabilizada. </li><li> Utilizar el puerto ojo para determinar la ubicación y la orientación de la levadura. </li><li> Uso de campo claro, evaluar la salud y la viabilidad celular de acuerdo con la forma y textura. </li><li> Encienda la luz epifluorescente de acuerdo con el fluoróforo relevante (por ejemplo FITC filtro para GFP), y se centran en las células que presentan el fenotipo que es objeto de su investigación. Las células que son altamente fluorescente en más de una longitud de onda puede estar muerto y por lo tanto autofluorescente. Visualizamos el núcleo con un fluoróforo tdTomato fusionado a una señal de NLS SV40 (NLS-TFP). TFP es dos veces el tamaño de la GFP, y es por lo tanto por encima del límite de difusión del núcleo, por lo tanto, funciona muy bien como un marcador nuclear. También puede excitar la PTF con un verde (488 nm) láser simultáneamente como GFP, pero recoger las emisiones de verde y rojo en dos PMTs separadas para la resolución espectral. </li><li> Realice los siguientes ajustes para minimizar el ruidoy sobresaturación: <ol><li> Potencia del láser - photobleaching y fototoxicidad vs brillo de la imagen debe ser considerado. </li><li> Ganancia: afecta sensibilidad de la cámara, así Relación señal a ruido. </li><li> Diámetro del agujero de alfiler - debe ser ajustada de acuerdo con el láser con la longitud de onda más corta. El diámetro del agujero de alfiler determina el espesor (altura) de la sección óptica imágenes. Por lo tanto, la apertura del agujero de alfiler recogerá más luz (y mucho más fotones), pero disminuirá la resolución en z (menos confocalidad). </li></ol></li><li> Consejos útiles: <ol><li> Si diferentes fluoróforos emiten longitud de onda congruentes, utilizar la función de detector espectral que permite la elección de los filtros virtuales. Tenga en cuenta que los detectores espectrales son menos sensibles que los PMT regulares. </li><li> Si diferentes fluoróforos son excitadas por el mismo láser, utilice la función de escaneado de línea. </li><li> Un escáner de Galvano permite más sensibilidad, pero tiene un mayor riesgo de fotoblanqueo. Un escáner de resonancia permite un rápidocquisition, reduciendo así el riesgo de fotoblanqueo, pero es menos sensible. </li><li> Promedio de entre 2 y 16 imágenes, que mejora la relación señal-ruido, pero hace que la adquisición más lento y, por supuesto, implica una mayor exposición de la muestra al láser. </li><li> Duración de la adquisición depende de la pregunta biológica (por ejemplo JUNQ y formación IPOD toma aproximadamente 2 horas). Hemos fotografiado la levadura con el escáner de resonancia para un máximo de 30 horas en 3D de lapso de tiempo. </li><li> Lapso de tiempo-intervalos más pequeños intervalos va a crear una película más coherente, pero podría causar fotoblanqueado y por lo tanto la pérdida de señal. </li></ol></li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Nuestras intuiciones sobre los procesos bioquímicos se derivan de experimentos de mesa de laboratorio en los que se permite una solución bien mezclada de los reactivos y productos para alcanzar el equilibrio en un vaso de precipitados. En tal entorno, la concentración de una especie química dada se puede expresar como un número único, que es la relación de la cantidad molar de las moléculas a un volumen macroscópico. Mucho de lo que sabemos acerca de la estructura y función de proteínas se deriva del uso de métodos que reflejan la imagen clásica, la reacción a granel: transferencias Western, centrifugaciones y mediciones espectrofotométricas realizadas en los extractos de los homogeneizados de toda la población de células. A medida que la tecnología que utilizamos para observar las células bajo magnificación aumenta a pasos agigantados, se hace cada vez más claro que las condiciones en las que las reacciones bioquímicas tienen lugar más en vivo soportar sólo el más mínimo parecido con las del escenario de sobremesa clásico. No sólo es el interior de la celLa densa medio ambiente, en el que los efectos apiñamiento sustancialmente alterar las actividades de diversos reactivos, también es todo lo contrario de bien mezclada. Esto explica la disparidad frecuente entre in vitro e in vivo de la eficiencia en una amplia gama de reacciones macromoleculares complejas. En ninguna parte son intuiciones que surgen desde lo clásico en experimentos in vitro bioquímicos más propensos a engañar como en las cuestiones relacionadas con el plegado en vivo, mal plegamiento y la agregación de las proteínas. Considerando que los estudios de química de proteínas en las reacciones a granel puede tratar el problema de plegado para una proteína dada como un simple sí o no cuestión, cualquier intento de rastrear la dinámica de poblaciones enteras de macromoléculas en una célula viva debe ser sensible a la distribución total de posible resultados conformacionales disponibles para una cadena polipeptídica, y en particular con el riesgo de mal plegamiento y la agregación. Por ejemplo, podríamos examinar una célula Ly mayorEstado de agregación de una proteína por Western Blot, y determinar que la proteína es principalmente insoluble y no ubiquitinated. Sin embargo, en la célula viva una discreta sub-población de la proteína, difíciles de detectar cuando un promedio sobre muchas células, puede ser soluble y ubiquitinated en un compartimiento particular, cuando la concentración local de la especie es extremadamente alta. El último escenario puede tener consecuencias más importantes para la viabilidad de la célula que el bulto de mayor tamaño sub-población. Además, mientras que chaperones mostrar una variedad de comportamientos pleiotrópicos y funciones in vitro, se está haciendo evidente que en la célula de sus funciones discretas están espacial y temporalmente limitado. En el paradigma emergente para la comprensión de la bioquímica, la concentración se convierte en una propiedad variable de cada específico nano-medio ambiente en la célula, y los eventos moleculares que subyacen a los procesos biológicos deben analizarse no sólo en el tiempo, sino también en space. El enfoque de las imágenes de 4D que aquí se presenta permite el modelado sensible de mal plegamiento de proteínas en células vivas, aunque puede ser utilizada para estudiar cualquier número de otros procesos biológicos y cómo se regulan en el espacio, el tiempo, y como consecuencia de variaciones en las condiciones ambientales. En este trabajo se utiliza el sensor Ubc9 ts plegado, lo que efectivamente demuestra las etapas y las opciones para hacer frente a la aparición de la agregación de proteínas en el citosol. Además de ilustrar la biología celular de control de calidad de agregación, este enfoque puede servir como una herramienta poderosa para descifrar el efecto de las perturbaciones específicas o mutaciones genéticas en proteostasis (por ejemplo Ubc9 ts se puede utilizar para medir la tensión de plegado de proteínas en respuesta a la oxidación, la expresión de un agregado tóxico, o mutaciones en la vía de control de calidad). 4D formación de imágenes es también esencial para determinar con precisión la localización de proteínas o colocalización entre dos proteínas diferentess, y para la detección de fenómenos que tal vez ser transitorios, pero importante. Por ejemplo, especialmente en un organismo esférico pequeño tal como una levadura, puede parecer ser el caso de que una estructura o agregado tiene localización yuxtanuclear, mientras que las imágenes de 4D puede revelar que este es simplemente un artefacto del ángulo de inspección. En el experimento de ejemplo que presentamos aquí, se demuestra el uso de un modelo misfolded proteínas, Ubc9 ts, de seguir el control de agregación de calidad en el tiempo y el espacio en el citosol. A la temperatura permisiva, Ubc9 ts se dobla y se difunde en el núcleo y el citosol. Al calor inducido por mal plegamiento, inicialmente se forma rápidamente difunden pequeños focos de tensión agregados que son procesados ​​por la degradación proteasomal. Cuando el proteasoma se inhibe parcialmente, estos focos de tensión se convierte en JUNQ y inclusiones iPOD en el transcurso de aproximadamente 2 horas. Si la degradación mediada por ubiquitina no está disponible como una opción de control de calidad, Ubc9 ts es inmediatamente redirigido a la inclusión IPOD para la agregación de protección. Estas herramientas ofrecen increíbles oportunidades para descubrir nuevos factores genéticos que intervienen en el control de calidad de agregación y de explorar su regulación espacial y temporal en la célula.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

Una de las tareas fundamentales de toda célula viva es mantener el correcto plegamiento de las proteínas recién sintetizadas frente a las siempre cambiantes condiciones ambientales y un ambiente intracelular que está estrechamente empaquetados, pegajosa y peligrosas para la estabilidad de la proteína 1. La capacidad de balancear dinámicamente la producción de proteínas, plegamiento y la degradación demanda altamente especializada maquinaria de control de calidad, cuya absoluta necesidad se observa mejor cuando funciona mal. Las enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica, Alzheimer, Parkinson, y ciertas formas de fibrosis quística tienen un vínculo directo con plegamiento de proteínas componentes de control de calidad 2, y por lo tanto el desarrollo terapéutico futuro requiere un conocimiento básico de los procesos subyacentes. Nuestro desafío experimental es entender cómo las células integrar señales de daños y organizar respuestas que se adaptan a diversas circunstancias. La razón principal por la cual mal plegamiento de proteínas representa un thre existencialen que la célula es la propensión de las proteínas incorrectamente plegadas a agregarse, lo que provoca una perturbación global de la gente y delicado ambiente intracelular plegable 1. La salud de plegado, o &quot;proteostasis&quot;, del proteoma celular se mantiene, incluso bajo la presión del envejecimiento, el estrés y el daño oxidativo, mediante la acción coordinada de las diferentes unidades mecánicas en un sistema de control de calidad elaborada 3,4. Una maquinaria especializada de las chaperonas moleculares puede unir no nativos polipéptidos y promover su plegamiento en el estado nativo 1, a orientar para la degradación por el sistema de la ubiquitina-proteasoma 5, o directamente a inclusiones de agregación de protección 6-9. En eucariotas, la calidad citosólica agregación de control de carga se reparte entre dos compartimientos 8-10: El compartimiento de control de calidad juxtanuclear (JUNQ) y el depósito de proteína insoluble (IPOD) (Figura 1 - Modelo).Las proteínas que están ubiquitinadas por la proteína de la maquinaria de plegamiento de control de calidad se entregan a la JUNQ, donde son procesados ​​para su degradación por el proteasoma. Proteínas mal plegadas que no se ubiquitinadas se desvían a la IPOD, donde se agregan activamente en un compartimiento protector. Hasta este punto, el paradigma metodológico de células vivas microscopia de fluorescencia ha sido en gran medida a las proteínas de la etiqueta y el seguimiento de su ubicación en la celda específica en los puntos de tiempo y por lo general en dos dimensiones. Como las nuevas tecnologías han empezado a conceder experimentadores acceso sin precedentes a la escala submicrónica en las células vivas, la arquitectura dinámica del citosol ha llegado a la vista como una frontera desafiante nuevo para la caracterización experimental. Se presenta un método para el rápido seguimiento de las distribuciones espaciales en 3D de múltiples proteínas marcadas fluorescentemente en el citosol de levadura con el tiempo. Timelapse 3D (4D imagen) no es sólo un desafío técnico, rataella, sino que también facilita un cambio dramático en el marco conceptual utilizado para analizar la estructura celular. Utilizamos una proteína citosólica sensor plegable en levaduras vivas para visualizar los destinos distintos de las proteínas mal plegadas en el control de calidad de la agregación celular, utilizando una rápida visualización en 4D fluorescente. El mutante sensible a la temperatura de la proteína Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) es extremadamente eficaz tanto como un sensor de proteostasis celular, y un modelo fisiológico para el control de seguimiento de la calidad de agregación. Al igual que con la mayoría de las proteínas ts, ts Ubc9 es totalmente plegada y funcional a temperaturas permisivas por activos chaperonas celulares. Por encima de 30 ° C, o cuando la célula se enfrenta a estrés misfolding, Ubc9 misfolds ts y sigue el destino de una proteína globular nativa que ha sido plegadas incorrectamente debido a la mutación, la desnaturalización por calor, o el daño oxidativo. Por fusión a GFP o otros fluoróforos, que pueden ser rastreados en 3D como forma estrés Foci, o es dicorregida a JUNQ o IPOD.

<html><img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Figura 1. Modelo:. Compartimentación subcelular de las proteínas mal plegadas maquinaria de control de calidad dirige las proteínas mal plegadas en compartimentos distintos con funciones distintas: las proteínas solubles, destinada a la degradación, se someten a poli-ubiquitination y se envían al compartimiento xta Ju-N NUCLEAR control Q alidad (JUNQ ). Las proteínas insolubles que no se pueden ubiquitinadas son enviados para el secuestro de protección a la I nsoluble Pr Otein D eposit (IPOD), adyacente a la vacuola, donde son sometidos a la agregación activo. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Modelado de mal plegamiento de proteínas con GFP-Ubc9 ts. En condiciones normales, GFP-Ubc9 ts (verde) está plegado de forma nativa, y se localiza de manera difusa en el núcleo y el citosol. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). Expresión de Ubc9 ts se apagó por la adición de 2% de glucosa antes de exponer en todos los experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <ol><li> Tras el cambio de temperatura a 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (verde) está mal plegada y forma Foci estrés citosólica. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). </li><li> Tras la recuperación de choque térmico a 23 ° C, el térmicamente desnaturalizado GFP-Ubc9 ts se degrada, como se indica por la disminución del nivel de fluorescencia. </li><li> A cambio de la temperatura a 37 ° C y la inhibición del proteasoma con MG132 80 Mm, GFP-U<html> FC9 ts está mal plegadas y se transforma en JUNQ e inclusiones iPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). </li><li> Tras el cambio de temperatura a 37 ° C y la inhibición de ubiquitinación, ts GFP-Ubc9 se misfolded y se procesan en la inclusión IPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). La proteasa ubiquitina 4 (Ubp4) se sobreexpresa para bloquear ubiquitination Ubc9 ts. </li></ol><img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Figura 3. Lapso de tiempo de JUNQ y formación IPOD. Tras el cambio de temperatura a 37 ° C y la inhibición del proteasoma MG132 con 80 Mm, GFP-Ubc9 Foci Estrés ts se procesan en JUNQ y inclusiones iPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). Imágenes en 3D fueron adquiridos a intervalos de 4 min. (Ver también la película 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ampliar la figura.

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4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt;, Por proteostasis seguimiento y control de calidad en la agregación de células vivas mediante microscopía 4D.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K vistas.  Hebrew University of Jerusalem. La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado, Ubc9 Ts, Por proteostasis seguimiento y control de calidad en la agregación de células vivas mediante microscopía 4D.

Video: 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Investigación

Biología

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopía 4D de levadura

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

FLIM-FRET Mediciones de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...