Este protocolo es significativo ya que permite la manipulación dirigida en tiempo específico de placentas de ratón utilizando CRISPR. Esto permitirá a los investigadores dilucidar funciones genéticas específicas durante la mitad y el final del embarazo. Las manipulaciones genéticas que causan sobreexpresión dentro de la placenta del ratón son muy poco comunes.
La principal ventaja de esta técnica es que permite una serie de cambios en la expresión génica dentro de la placenta. No se desanime si los términos preliminares que tiene esta técnica no tienen éxito. Como esta técnica es desafiante, requiere bastante tiempo para practicar para dominarla.
Para comenzar, coloque la madre anestesiada en decúbito supino con un cono nasal para mantener la anestesia en el área de preparación. Afeite bien el abdomen de la presa. Para evitar el secado de la córnea, coloque gel lagrimal artificial sobre ambos ojos de la madre.
Luego use aplicadores estériles con punta de algodón para desinfectar el sitio quirúrgico con al menos tres rondas alternas de una solución de povidona yodada, seguido de etanol al 70% con una capa final de solución de povidona yodada. Después de la preparación, mueva la presa con el cono nasal de anestesia al área de cirugía designada. Para la laparotomía uterina, coloque la madre supina en la mesa de operaciones y asegure el cono nasal en su lugar con cinta adhesiva.
Coloque una almohadilla térmica debajo de una almohadilla absorbente ajustada a 45 grados centígrados. Después de confirmar la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflujo de pellizco del dedo del pie, use fórceps y tijeras para hacer una incisión aproximada de dos centímetros en la línea media a través de la piel de la tienda. Luego haga una incisión vertical a través del peritoneo usando fórceps estériles, suavemente alejados de los cuernos uterinos.
Masajee ambos cuernos uterinos presionando a ambos lados del abdomen con los dedos para guiarlos. Coloque el útero expuesto encima de cortinas quirúrgicas estériles colocadas sobre la parte inferior del abdomen y manténgalo húmedo con gotas de solución salina estéril tibia según sea necesario. Una vez que el útero está expuesto, seleccione tres pares de placentas para su manipulación.
Registrar la ubicación de las manipulaciones placentarias y la organización de los embriones dentro de los cuernos uterinos. Para la inyección placentaria del plásmido de control, cargar una cantidad suficiente del plásmido de control apropiado para tres inyecciones utilizando una micropipeta calibrada. Realizar todas las inyecciones entre la decidua y la zona de unión a una profundidad de aproximadamente 0,5 milímetros lateralmente en la placenta.
Después de la inyección, pero inmediatamente antes de la electroporación, cubra los lugares de contacto con solución salina estéril, aplicando la solución salina con precisión en los tres sitios de la pared uterina y las paletas con un gotero o jeringa. Dentro de los dos minutos posteriores a la inyección, realice la electroporación utilizando un par de paletas de tres milímetros conectadas a una máquina de electroporación. Para garantizar la eficiencia de incorporación de CRISPR y la viabilidad de los embriones, ajuste la configuración a 30 voltios, pulso de 30 milisegundos, dos pulsos, pulso de 970 milisegundos apagado y unipolar.
Presione suavemente las paletas de electroporación sobre las paredes uterinas en los lados laterales de la placenta. Coloque la paleta del ánodo sobre el lugar de inyección y el cátodo directamente enfrente. Presione el pulso en la máquina de electroporación y espere a que se completen los dos pulsos antes de retirar las paletas de electroporación.
Luego proceder a la inyección placentaria del plásmido experimental como se demostró anteriormente. Realizar la electroporación de las tres placentas inyectadas experimentales dentro de los dos minutos posteriores a la inyección como se realizó para el grupo de control. Una vez que se complete la manipulación placentaria, masajee suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal usando solo los dedos para manipular directamente los cuernos uterinos.
Realice suturas interrumpidas en la capa del peritoneo utilizando suturas solubles recubiertas y trenzadas de 45 centímetros de largo con una aleación de aguja circular de 13 milímetros y tres octavos. Después de suturar la capa de peritoneo, suture la piel con suturas solubles utilizando el mismo tipo de suturas solubles utilizadas para el peritoneo. Una vez que se complete la sutura, aplique adhesivo tisular a las suturas en la piel.
Cuando el adhesivo tisular se haya secado, apague el vaporizador y transfiera la presa del área de la cirugía a una jaula de soporte en su espalda. Las placentas fueron inyectadas con un plásmido de control CRISPR Cas9 general y un plásmido de activación CRISPR de control o un plásmido de activación SAM IGF-1. Las imágenes representativas posteriores a la necropsia no mostraron daño notable o cambio en la apariencia fenotípica en ningún grupo de tratamiento.
La tasa de supervivencia de los embriones no tratados en camadas manipuladas disminuyó a un promedio de 79.05%, mientras que hubo una disminución significativa en la supervivencia de los embriones manipulados con un promedio de 55.56%No hubo diferencias significativas en el peso placentario de ningún grupo. No hubo diferencias significativas en el aumento de peso materno inmediatamente después de la cirugía en comparación con las cirugías simuladas. Muchas madres embarazadas mostraron una ligera disminución o ningún cambio en el peso el día después del procedimiento, probablemente debido a la interrupción de la alimentación durante y brevemente después de la cirugía.
La mayoría de las presas mostraron un aumento de peso en E14.5, pero ocasionalmente se observó una disminución en el peso. La qPCR mostró un aumento significativo en la expresión de IGF-1 en las placentas de sobreexpresión de IGF-1 frente a las placentas control. La evaluación ELIZA de las placentas E14.5 mostró un aumento significativo en los niveles de proteína IGF-1 en las placentas de sobreexpresión de IGF-1 en comparación con las placentas de control.
La autofluorescencia verde demostró las subregiones de la interfaz placentaria materno-fetal con marcado rojo Cas9 solo en la placenta de sobreexpresión de IGF-1, lo que indica una incorporación exitosa de CRISPR en las tres subregiones de la placenta. El fluorescente en el etiquetado de hibridación C2 confirmó la incorporación del plásmido de activación de IGF-1 sin migración a placentas no tratadas. La zona decidual y laberíntica podría identificarse rodeando la zona de unión roja marcada por la tinción de Prl8a8.
Recuerde registrar el tipo de manipulación y la ubicación de las placentas y los embriones correspondientes. Se recomienda encarecidamente registrar la ubicación del cuello uterino y los embriones dentro de los cuernos uterinos. Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de la placenta, el embrión y la madre.
Esto permitirá una mayor comprensión de los roles específicos de los genes placentarios en el embarazo, la función placentaria y el desarrollo embrionario.
