Este método facilita la disección reproducible y el corte de troncos cerebrales de roedores para el análisis capturado de la Red Respiratoria Medular Mirian. Esta técnica ofrece una gran flexibilidad experimental, lo que permite preparar un desbloqueo in vitro o una preparación de la rebanada para la grabación. Este método se puede utilizar para experimentos de electrofisiología para explorar el circuito de control neural que genera ritmos respiratorios y para comprender la patología y la desregulación de la respiración en roedores modificados genéticamente.
Después de la disección de la neuraxis, transfiera rápidamente el tronco aislado del animal a una cámara de disección aireada bajo un microscopio de disección y coloque el lado dorsal del tejido hacia arriba, con el extremo rostral mirando hacia la parte delantera de la cámara. Ancle el tejido en los hombros y el extremo más caudal de la médula espinal y hacer una incisión midsagittal a través del cráneo después de la sutura parietal para evitar dañar la corteza y el tronco encefálico subyacente al cráneo. Comenzando en la sutura sagital y trabajando lateralmente, cortar las suturas occipitales del cráneo para crear colgajos de hueso que pueden reflejarse y fijarse para anclar y estabilizar la parte rostral del cráneo.
Después de reflejar ambos colgajos del cráneo, excúbica el resto de la corteza cerebral, dejando la porción caudal del cerebelo relativamente intacta para realizar una laminectomía dorsal. Utilice tijeras y fórceps de micro resorte para eliminar la musculatura que rodea el cráneo y la columna vertebral. Retire el tejido a lo largo del lado dorsal de la caja torácica, dejando las costillas intactas y cortando cuidadosamente los procesos laterales de la lámina vertebral.
Después de cortar cualquier tejido que sobresoje los pons y la médula, el vermis, cerebelo, pons y el comienzo de la médula espinal, serán claramente visibles. Para realizar una laminectomía ventral, coloque el lado dorsal del tejido hacia abajo y el alfiler en la caja torácica y el extremo más caudal de la columna vertebral. Usa los colgajos del cráneo para fijar el lado rostral del tejido y extraer la mitad ventral de la caja torácica, incluyendo el esternón y todos los órganos abdominales.
Diseccionar el tejido blando unido a la caja torácica para exponer las costillas y la médula espinal y eliminar la lengua, el esófago, la tráquea, la laringe y todo el otro tejido blando y la musculatura sobre la base del cráneo y la columna vertebral. Para identificar el palet duro, disecciona el tejido que sobresote esta placa rectangular de hueso en la base del cráneo, que incluye una sangría en forma de V. A continuación, corte a lo largo de la línea media de la paleta, levantando cuidadosamente el tejido hacia arriba y realizar un corte transversal para eliminarlo.
Para comenzar una laminectomía ventral, extraiga la lámina, exponiendo la superficie ventral del tronco encefálico y la médula espinal desde la primera vértebra cervical hasta aproximadamente la vértebra torácica siete y corte de cinco a 10 milímetros a lo largo de ambos lados de la columna vertebral en la lámina. Cuando la médula espinal ha sido expuesta, corta las raíces aproximadamente de 20 a 25 milímetros bilateralmente, a lo largo de la columna vertebral a aproximadamente T7 y levanta cuidadosamente el borde rostral de C1, C2 y C3 con fórceps enganchados o doblados para permitir el corte por debajo del hueso para la extracción de las tres vértebras. Cuando la longitud deseada de la médula espinal se haya aislado de la columna vertebral, haga un corte transversal para extraer el tejido de la médula espinal.
Después de eliminar la dura, coloque el tronco encefálico en el centro de la plataforma de parafina en el bloque de corte de plástico y utilice pasadores finos de insectos, recortados a no más de un centímetro de longitud para fijar el extremo caudal del tronco encefálico a través de la médula espinal distal. A continuación, alinee el bloque de corte cubierto de parafina con el tronco encefálica anclado en el soporte del bloque Vibratone, de modo que la hoja corte perpendicular a la cara rostral del tronco encefálica. A continuación, haga una rebanada inicial para eliminar de 200 a 300 micrómetros de tejido extraño desigual en el extremo rostral más del tejido, haciendo pequeños ajustes según sea necesario para asegurar la linealidad PARP y pequeños cortes para eliminar cualquier tejido desigual.
Las raíces glossofaríngeas se harán visibles en el borde lateral del tronco cerebral, cortarán una rebanada de 300 a 500 micrómetros de tronco cerebral de estos marcadores neuroanatómicos rostrales para capturar el complejo pre-Botzinger y el circuito de transmisión asociado. Todos los pasos del procedimiento de corte son críticos para crear una rebanada reproducible y viable, con todos los circuitos neuronales necesarios en la orientación correcta para producir un ritmo robusto. Todos los elementos de circuito neural mínimamente necesarios para generar y transmitir ritmo inspiratorio se pueden capturar en una rebanada delgada utilizando este método.
Incluyendo el complejo pre-Botzinger, neuronas pre-motor que se proyectan a las neuronas motoras hipoglossales y las raíces nerviosas hipoglossas. El complejo pre-Botzinger, el hipoglossal o 12o neumo nervioso craneal rootlets y las raíles nerviosas C4 se pueden utilizar para la grabación inspiratoria. El aspecto clave de este procedimiento es el cuidadoso aislamiento de las rootletas y la confirmación de que el tronco encefálica no está dañado antes de cortar la rebanada final.
Después de este procedimiento, las grabaciones de electrofisiología se pueden realizar utilizando métodos de abrazadera de parche, grabaciones celulares adicionales o electrodos de succión para registrar la actividad eléctrica producida por la red. Los protocolos publicados anteriormente han proporcionado poco detalle paso a paso, lo que dificulta que los nuevos investigadores utilicen este método sin viajar a otro laboratorio y pasar tiempo con un investigador experimentado.
