Los autores reconocen el apoyo financiero de una subvención ZonMW-VICI 918.11.635 (Países Bajos). Los autores desean agradecer a la tienda de herramientas de la Vrije Universiteit Amsterdam por sus sugerencias prácticas y para la fabricación de los componentes de la instalación y Jarno Voortman de Carl Zeiss Holanda útil para el asesoramiento en la microscopía. Marjolein Blaauboer fue una gran ayuda en el comentario crítico sobre varios borradores del manuscrito.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los experimentos en los Países Bajos Ley de Animales. NOTA: El método del papel de filtro sumergido sándwich se modifica a partir del 1. 1. Filtro de papel sumergido Preparación Sandwich <ol><li> Pannett-Compton (PC): solución salina 27,28 <ol><li> Preparar soluciones madre A (1 L de ultrapura H 2 O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl 2 · H 2 O, y 12,7 g de MgCl 2 · 6H 2 O) y B (1 L de ultrapura H2O, 2,365 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O y 0,188 g de NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) en botellas de 1 l limpias. Almacenarlos a 4 ° C. </li><li> Preparar 1 L de PC-solución salina mezclando 900 ml de ultrapura H 2 O con 40 ml de solución madre de A y 60 ml de la solución madre B (en este orden para evitar la precipitación). Preparar fr recién PC-solución salinaom soluciones madre A y B cada semana. NOTA: Las soluciones madre se pueden almacenar a 4 ° C durante varios meses. El tratamiento en autoclave y / o la adición de antibióticos o antimicóticos no son necesarios. </li></ol></li><li> La incubación de los huevos de gallina fertilizados <ol><li> En un incubador humidificado, poner los huevos de su lado y los incuban a 37,5 ° C hasta que alcancen la edad deseada. NOTA: Guarde los huevos no más de dos semanas (preferiblemente a 12 - 15 ° C) antes de la prueba, ya que el porcentaje de nacimientos disminuirá significativamente </li></ol></li><li> Portadoras de papel de filtro (adaptado de 1) <ol><li> Si está disponible, utilice una máquina de corte láser para cortar las compañías de papel de filtro con forma de reloj de arena de papel de filtro grueso (28 mm x 22 mm). Taper la anchura en el centro de 22 mm a 10,4 mm. Cortar una abertura elíptica central (10,6 mm x 5,5 mm), con el eje más largo de la elipse orientada paralela al lado mayor de la portadora de papel de filtro (Figura 1-M). <ol><li> Opcionalmente, preparar una plantilla de cartón con las dimensiones correctas y transferir su contorno y la de la abertura central de papel de filtración de espesor con un lápiz. Cortar el soporte de papel de filtro con unas tijeras finas. </li></ol></li><li> Cortar dos soportes de papel de filtro idénticos para cada embrión para ser explantado. Preparar las compañías de papel de filtro adicionales como respaldo en caso de un embrión se pierde durante la explantación. </li></ol></li><li> Con control de temperatura del baño de aceite (en el día del experimento) <ol><li> Colocar el vaso de precipitados con control de temperatura en el centro de la xy platina motorizada del microscopio zoom en posición vertical y conectar el vaso de precipitados a su controlador de temperatura. </li><li> Ponga cuatro anillos grandes de acero inoxidable (30 mm de diámetro exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) en una placa de 6 cm Petri para actuar como pesos y colocar el plato en el centro del vaso de precipitados con control de temperatura. NOTA: Este plato Petri simplemente sirve como un marcador de posición para ajustar el aceite level. </li><li> Llenar el vaso de precipitados con control de temperatura con 130 ml de aceite mineral ligero. Ajuste el nivel de aceite si es necesario de modo que termine aproximadamente 3 mm por debajo del borde superior de la 6 cm placa de Petri. </li><li> Retire la placa de Petri de 6 cm desde el vaso de precipitados con control de temperatura y ajustar la temperatura a 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtro de papel sumergido Sandwich Producción <ol><li> El medio de cultivo (en el día del experimento) <ol><li> Verter 30 ml de PC-solución salina (como se ha preparado en los pasos 1.1.1 a 1.1.2) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml llenado con 30 ml de PC-solución salina por cada dos embriones a ser explantado. </li><li> Con cuidado, romper un huevo no incubados en una placa de Petri de 10 cm. </li><li> Cosecha de albúmina fina moviendo una pipeta de transferencia de plástico a lo largo de las paredes de la placa de Petri y la succión en la albúmina fina. Recoger 30 ml albúmina fina en un tubo de centrífuga de 50 ml por cada dos embriones a ser explantado. Asegúrese de obtener sólo el thin albúmina. NOTA: Por lo general, 3 - 4 huevos permiten la cosecha de alrededor de 30 ml de albúmina fina. </li><li> Verter 20 ml de albúmina fina en cada PC-rellenos de solución salina 50 ml tubo de centrífuga (tal como se preparó en el paso 2.1.1). </li><li> Mezclar la PC-solución salina con la albúmina fina invirtiendo suavemente los tubos varias veces. Se deja reposar durante varios minutos y comprobar si la mezcla, llamado medio de cultivo a partir de aquí, está claro. Si el medio de cultivo no está claro, preparar fresca PC-salina de la solución madre y la cosecha de albúmina fina frescas. </li></ol></li><li> Coloque dos pequeños anillos de acero inoxidable (20 mm de diámetro exterior, de 4 mm de altura, espesor de pared de 1,5 mm, 6,5 mm hueco en el anillo) tan distantes como sea posible en un nuevo máximo de 6 cm placa Petri de plástico y llenarlo con 22 ml de cultivo medio (como se ha preparado en los pasos 1.4.1 a 1.4.4) usando una pipeta de plástico 25 ml (Figura 1-H). Asegúrese de que los residuos acumulados en la parte superior del medio se mantiene en el tubo de centrífuga. </li><li> Eliminar los residuos or burbujas a partir del medio utilizando una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Llenar un plato de 10 cm de Petri con 75 ml de PC-solución salina (para ser utilizado en el paso 2,15). </li><li> Retirar un huevo de la incubadora y se deja reposar en el banco en su lado durante 1 minuto para dejar que el embrión llega a la parte superior de la yema. </li><li> Con cuidado, romper el huevo en una placa de Petri (Figura 1-A). Remojar el borde de un pedazo de papel de seda fina en las albúmina gruesa y centrar el blastodermo tirando, si es necesario. </li><li> Eliminar la mayor parte de la albúmina delgado y grueso de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (con la punta cortada para facilitar la absorción de las albúmina gruesa). </li><li> Crear una ventana en la albúmina gruesa alrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un trozo de papel de seda, alejándose del centro (Figura 1-B). Evitar que el papel de seda se adhiera a la membrana vitelina. </li><li> Con unas pinzas, cuidadosamente coloque un soporte de papel de filtro en la Vitemembrana lline alrededor del embrión, con el eje más largo de la abertura elíptica paralelo al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-C). </li><li> Pellizcar una punta de las tijeras de uñas a través de la membrana vitelina cerca del soporte de papel de filtro y cortar rápidamente por todo el portador de papel de filtro (Figura 1-D). </li><li> El uso de pinzas, levantar el portador de papel de filtro fuera de la yema de huevo en una dirección oblicua paralela al eje anterior-posterior del embrión (Figura 1-E). </li><li> Gire el soporte de papel de filtro en torno a tener la cara ventral del embrión en la parte superior y sumergirlo en el PC-solución salina. Sumergir el soporte de papel de filtro a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua. </li><li> Deshacerse de toda la yema todavía unida la membrana vitelina y blastodermo lavando suavemente con PC-solución salina de una pipeta de transferencia de plástico. Mantenga la totalidad del soporte de papel de filtro sumergido a unall veces (Figura 1-F). </li><li> Retire el soporte de papel de filtro de la PC-solución salina a lo largo del eje anterior-posterior del embrión en una dirección oblicua y deshacerse del exceso de líquido taponando el borde del soporte de papel de filtro en un papel de seda. </li><li> Mantenga el papel de filtro en posición horizontal, con el lado ventral del embrión hacia arriba, y colocar otro portador de papel de filtro en la parte superior de la primera, el uso de un segundo par de pinzas. Sus aberturas deben coincidir exactamente, intercalando de ese modo el embrión entre las dos capas de papel de filtro (Figura 1-G). </li><li> Inmediatamente sumerja el sándwich de soporte de papel de filtro en el medio de cultivo en una dirección oblicua a lo largo del eje-posterior-anterior del embrión. Colocarlo en la zona que abarca el espacio entre los dos anillos de acero (Figura 1-H). </li><li> Fijar el sándwich de papel de filtro mediante la colocación de dos más anillos de acero en la parte superior de los otros dos, asegurándose de que la abertura con el correombryo permanece completamente cubierto (Figura 1-I). </li><li> Compruebe el nivel medio y asegurarse de que el espaciador superior se acaba sumergido en el medio. Si es necesario, añadir o eliminar pequeñas cantidades de medio. </li><li> Con cuidado, coloque la placa de Petri en el centro del baño de aceite de temperatura controlada y estabilizar el plato lateralmente mediante la colocación de tres grandes anillos de acero inoxidable (diámetro 30 mm exterior, 4 mm de alto, 1,5 mm de espesor de pared) al lado del plato en el aceite . Asegúrese de que los anillos de acero tocan los bordes del plato (Figura 1-J). </li><li> Pipetear lentamente aproximadamente 6 ml de aceite mineral ligero en la parte superior del medio con una pipeta de transferencia de plástico, de modo que el medio está cubierto con una capa continua de aceite mineral (Figura 1-K). </li><li> Configurar la adquisición de lapso de tiempo. NOTA: imágenes de los embriones como panorámicas horizontales de cinco sub-imágenes superpuestas (azulejos) permite obtener imágenes detalladas (objetivo 5X), con un Overvi generalesew de la morfología 29-30. Intervalos de imagen entre 3 y 10 minutos permiten el seguimiento detallado de los cambios morfológicos de 31 años, y la adquisición de pequeñas z-pilas (de cinco a siete diferentes planos con una distancia de 30 micras) compensa la mayor parte del engrosamiento y giro del embrión 30 . Z-planos con el mayor contraste se pueden seleccionar antes del procesamiento adicional de 32 cuadros para formar películas a intervalos (véase la sección Resultados Representante para obtener información detallada sobre la adquisición de imágenes). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Figura 1: Configuración de la Sumergido Sandwich papel de filtro. (A) Un huevo se quebró en una placa de Petri. (B) La mayoría de la albúmina gruesos y finos se retira de la placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico (no mostrado). A continuación, se crea una ventana en la albúmina gruesa unaalrededor del embrión frotando suavemente las albúmina gruesa con un pañuelo de papel. Soporte de papel (C) Un filtro se coloca alrededor del blastodermo en la parte superior de la yema. (D) El soporte de papel de filtro se corta suelto de la membrana vitelina que rodea y (E) retirado de la parte superior de la yema. (F) La yema restante se lava cuidadosamente en un baño de PC-solución salina. (G) El embrión se intercala con un segundo soporte de papel de filtro idénticos. (H) El sándwich de papel filtro se sumerge en el medio y se coloca en los anillos de acero inoxidable de dos metales (embrión dorsal frente o de lado ventral hacia arriba). (I) dos anillos estabilizan el sándwich de la parte superior. (J) La placa de Petri que contiene el embrión se transfiere al baño de aceite de temperatura controlada. anillos de acero inoxidable estabilizan lateralmente la placa de Petri. (K) El medio de cultivo se cubre con una capa de aceite mineral.(L) Esquema del sándwich de filtro sumergido. (M) Las dimensiones de los soportes de papel de filtro utilizados para el sándwich de papel de filtro sumergido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Como una nueva variante de la cultura CE bien establecida-1, el sándwich de papel filtro sumergida facilita la adquisición de campo claro y campo oscuro películas de lapso de tiempo a largo plazo de la temprana del embrión de pollo ex ovo haciendo una temperatura y humedad controlada alrededor de la incubadora el microscopio prescindible. En lugar de ser cultivadas en un semi-sólido inferior agar-albúmina, los embriones se mantienen totalmente sumergidos en un medio de cultivo simple que consiste en PC-solución salina y albúmina fina. La evaporación y la pérdida de calor se reducen al mínimo por una capa de aceite mineral flotando en la superficie del medio de cultivo. Los embriones pueden cultivarse fácilmente, ya sea dorsal o lateral ventral hacia arriba, sin diferencias visibles en la calidad. Como se muestra aquí, los embriones en el sándwich de papel filtro sumergido son accesibles para intervenciones de microcirugía, como la aplicación de los granos de morfogenes empapado. Las futuras aplicaciones incluyen fluorescencia en vivo de imágenes, microinyección y electroporación, y silenciamiento de genes a manipulate y el estudio de una amplia gama de eventos morfogenéticos durante el desarrollo ventral (por ejemplo, corazón temprano y somitogenesis) y dorsal (por ejemplo, la gastrulación tardía, cierre del tubo neural, y principios del cerebro). Un tratamiento con fármacos dependiente del tiempo es factible si la placa de Petri que contiene el sándwich de papel de filtro se reemplaza con una cámara de perfusión, que permite el intercambio del medio de cultivo por debajo de la capa de aceite mineral. El filtro de papel sándwich sumergida va a desarrollar su potencial completo de imágenes en combinación con imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión. Algunas dificultades con la preparación del bocadillo de papel de filtro sumergido se abordarán en los siguientes párrafos. A pesar de que requiere sólo una cantidad moderada de la formación para transferir un embrión de la yema en el sándwich de papel de filtro, varios pasos todavía pueden influir significativamente en la calidad del embrión en el cultivo. Antes de que el portador de papel de filtro escolocado en la yema de huevo, la membrana vitelina en todo el embrión debe ser liberado de cualquier albúmina de espesor. Sólo entonces la conexión entre el papel de filtro y la membrana vitelina ser lo suficientemente fuerte para soportar el lavado en PC-solución salina. El papel de filtro que lleva el embrión debe cruzar la interfaz líquido / aire lo menos posible para reducir al mínimo la tensión en las membranas. Una vez introducidos en el PC-solución salina para lavar, todo el portador de papel de filtro debe estar completamente sumergido en todo momento. El tiempo en el baño de PC-solución salina debe limitarse a aproximadamente 30 - 60 seg, como la membrana vitelina se iniciará la liberación del papel de filtro. Aún así, la limpieza del embrión debe ser ejecutado muy a fondo, como restos de yema posteriormente ocultar la vista del embrión. Durante el lavado, nunca apunte la corriente de la pipeta de transferencia directamente sobre el embrión, pero siempre radialmente fuera de ella. Después de la eliminación del embrión desde el PC-solución salina, asegúrese de mantener el papel de filtro en posición horizontal para reducir al mínimola tensión en las membranas embrionarias. Entonces, estabilizar el embrión con el segundo soporte de papel de filtro. Una vez que se coloca el segundo portador de papel de filtro, evitar la creación de cualquier tensión lateral, lo que podría cambiar los soportes de papel de filtro con relación a otra y desgarrar las membranas embrionarias. Cuando el sándwich de papel de filtro se pone en el medio de cultivo, sino que también debe cruzar la interfaz aire / líquido sólo una vez para minimizar la tensión en las membranas. El segundo par de anillos de acero inoxidable utilizados para estabilizar el sándwich de papel de filtro de la parte superior debe ser colocado muy lentamente y sin ningún tipo de presión para reducir al mínimo la compresión de las membranas embrionarias. Pequeñas rupturas de la zona opaca del embrión normalmente se curan durante la primera hora de la cultura, sino un embrión dañado pueden y deben siempre ser reemplazados por una nueva muestra antes de la capa de aceite se pipeta en la parte superior del medio de cultivo. A la imagen de un embrión completo o varias muestras para alta resolución películas a intervalos, el micrófonoROSCOPE debe estar equipado con un xy platina motorizada, controlado por el software microscopio. Es de crucial importancia para que el movimiento xy escenario con una velocidad mínima para evitar daños a los embriones y turbulencias en el medio de cultivo y el aceite, lo cual disminuirá la calidad de la imagen. Para la adquisición de las películas a intervalos presentados aquí, xy platina motorizada movía con una velocidad aproximada de 1,75 mm / seg. En el futuro, la imagen podría mejorarse aún moviendo primero la etapa en la posición deseada y la adquisición de la imagen después de un breve período de descanso para permitir que las vibraciones y las turbulencias se desvanecen. Como limitación, los usuarios potenciales deben ser conscientes de la distancia de trabajo relativamente largo (aproximadamente 1 cm) necesaria para este método de cultivo si se utiliza un microscopio vertical y sin objetivos de inmersión. Esta distancia de trabajo los resultados de la capa de medio y de aceite mineral en la parte superior del embrión. En la placa de 6 cm de Petri, la capa de aceite tiene un thickness de aproximadamente 1 a 1,5 mm, y el embrión se sumerge aproximadamente 4 mm de profundidad en el medio de cultivo. Dependiendo del diámetro del objetivo, el borde superior de la placa de 6 cm Petri también podría limitar el acceso al embrión. Esto podría evitarse mediante el uso de un plato más grande. La distancia de trabajo de la parte superior puede ser ligeramente reducido al minimizar los espesores de las capas líquidas. Además, la distancia de trabajo desde abajo podría reducirse al mínimo por lo que el embrión más abajo a la parte inferior de la placa de Petri y la reducción del espesor de la ventana de cristal del vaso de precipitados se calienta. Mientras que el protocolo se ha optimizado para trabajar con un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical, que podría ser instalado en un microscopio invertido así. Los futuros usuarios deben tener en cuenta que sumergir el embrión demasiado profundamente en el medio de cultivo podría dar lugar a O 2 -diffusion problemas, aunque los experimentos preliminares sugieren que la difusión limitada no parece ser un problem, siempre y cuando el embrión está rodeado por una suficientemente a gran reservorio de medio de cultivo y el papel de filtro intercalada no se presiona a la parte inferior de la placa de Petri. Otra limitación es la de control de temperatura. Mediante el ajuste de la temperatura del controlador para el vaso de precipitados se calentó a 40 ° C, la temperatura en el medio se equilibra a 37,5 ° C alrededor de los embriones cuando el medio está cubierto con aceite mineral. Esto muestra que algo de energía se pierde entre la parte inferior del vaso de precipitados, donde se encuentran los elementos de calefacción y el sensor de temperatura, y la ubicación de los embriones. El control de temperatura puede ser optimizado mediante la reubicación del sensor y la redistribución de los elementos de calentamiento.

Embriogénesis ha fascinado al hombre desde el comienzo de la historia. ¿Cómo la estructura y morfología del embrión se desarrollan de manera temporal y espacial, bien definido? El embrión de pollo se ha convertido en uno de los modelos animales vertebrados clásicos para la embriogénesis por varias razones: Es fácilmente disponible, barato, transparente en sus primeras etapas, y accesible para las manipulaciones experimentales, ya que se desarrolla fuera de la madre. Además, tiene una geometría casi plana durante los eventos morfogenéticos tempranas, tales como el corazón y la formación del cerebro, la gastrulación, neurulación, y somitogenesis 15. procesos morfogenéticos pueden entenderse mejor si se estudian de forma dinámica, como por ejemplo a través de la adquisición de imágenes con lapso de tiempo. El embrión de pollo se puede visualizar in ovo 16 pero con mala accesibilidad para las manipulaciones experimentales y visibilidad limitada para obtener imágenes de microscopía de luz de transmisión. Por lo tanto, cortarAL técnicas se han propuesto a los embriones de pollo de cultivo ex ovo, ya sea en sistemas de cultivo de yema enteros 13,17 - 19 o como cultivos de explantes de 1,20 - 23. En sistemas de cultivo de yema de enteros, el embrión permanece en la parte superior de la yema intacta, y todo el contenido del huevo se transfiere a otro recipiente para la incubación. Este recipiente puede ser una cáscara de huevo sustituto 17, una placa de Petri de 19, o una hamaca hecha de plástico se aferran abrigo 13,18. Los embriones en cultivos de yema enteros pueden ser, idealmente, se cultivaron hasta la eclosión y son accesibles a micromanipulaciones. Estas técnicas son especialmente útiles para el estudio del desarrollo de los embriones después de la iniciación de la circulación de la sangre (que aumenta el contraste), mientras que los embriones más jóvenes permanecen difícil de visualizar. Estos embriones tempranos se pueden obtener imágenes mejor si se escindieron de la yema y se cultivaron como explantes in vitro. Los explantes son fácilmente accesibles para el experimentoAL manipulaciones y requieren menos espacio para el cultivo. Durante muchos años, una técnica iniciada por Denis nuevo en 1955 y sus variaciones fueron las normas de oro de los métodos de cultivo de explantes de embriones de pollo, con lo que el embrión accesible para la microscopía de lapso de tiempo y las intervenciones de microcirugía 20,21. A pesar de su gran éxito, la técnica de nuevo es relativamente exigente y consume mucho tiempo. Blastodermo menudo se separa cuando la membrana vitelina, que lleva el blastodermo, se estira alrededor de un anillo de vidrio para lograr la tensión adecuada 1. Por otra parte, el embrión sólo puede ser cultivado con su lado ventral hacia arriba. El cultivo CE (Early polluelo), una técnica más reciente desarrollada por Chapman y Collignon 1, evita el estiramiento de la membrana vitelina mediante el uso de un soporte de papel de filtro con una abertura central. El papel de filtro se une a la membrana vitelina, lo cual mantiene su tensión natural, y rodea al embrión como un cuadro 1.Los embriones se cultivan a continuación en una parte inferior de agar-albúmina, por lo general con su lado ventral hacia arriba. El cultivo dorsal hacia arriba parece sólo es posible para los embriones en HH8 15 años o más. Muchos grupos han adaptado el soporte de papel de filtro para sus necesidades, tales como mediante la sustitución de la parte inferior agar-albúmina con un soporte hecho a partir de fibras de sutura quirúrgica 24 o un colágeno de la membrana 25 recubierto. A menudo, los embriones cultivados con la técnica de Nuevo o con la cultura CE están expuestos, con su aleta dorsal o ventral de aire para facilitar la difusión de oxígeno de 1,20. Estos cultivos de explantes tienen que ser mantenidos en una atmósfera humidificada para evitar la evaporación del medio y para evitar que el embrión se sequen. Esto se consigue mediante la incubación de la cápsula con la cultura explante en un plato más grande de Petri que contiene un pañuelo de papel humedecido 1. La adquisición de imágenes con lapso de tiempo de estos embriones requiere o bien el uso de una incubadora con temperatura controlada alrededor de todo el microscopio o un temperamentoATURALEZA controlado recipiente con una tapa térmica para evitar la condensación en la trayectoria luminosa 14. Sin embargo, los embriones de pollo también pueden desarrollar ex ovo completamente sumergido en medio de cultivo en forma de cultivos de papel de filtro 25, emparedada entre una capa de aceite mineral pesado y la albúmina en adaptaciones de la técnica de New 2,21, o como explantes blastoderm plegables en la &quot;Cornish Pasty Cultura &quot;23,26, sin contacto directo con el aire. El sándwich de papel de filtro sumergido es una nueva variante de la técnica de soporte de papel de filtro. Al combinar el conocimiento anterior sobre el cultivo de embriones de pollo ex ovo, hace que la incubadora de temperatura controlada y la tapa térmica prescindible. El embrión se intercala entre dos portadores de papel idéntico (cortado con láser) de filtro 24 y se cultivaron totalmente sumergido en un medio de cultivo sencillo (Pannett-Compton solución salina 27,28 y albúmina fina en una proporción de 3: 2) en una temperatura controlada contenerer. Una capa de aceite mineral ligero que flota en la parte superior del medio impide 2,21 evaporación y minimiza la pérdida de calor al ambiente. El fondo del contenedor tiene una ventana de vidrio, y toda la configuración se lleva a cabo en un microscopio distancia zoom largo de trabajo en posición vertical. Esta configuración permite la adquisición de alta resolución de campo claro y campo oscuro películas a intervalos de aproximadamente 30 h de desarrollo embrionario, que van desde la etapa temprana línea primitiva a la etapa 28 somitas (equivalente a las etapas de Hamburger y Hamilton 5 a 16, HH5-16 ) 15. Los embriones pueden cultivarse igualmente bien con su ventral o dorsal hacia arriba. Por lo tanto, los embriones son accesibles a la observación y manipulación de ventral (por ejemplo, 7,8 cardíaca temprana y somitogenesis 6) y dorsal (por ejemplo, a finales de la gastrulación 2, cierre del tubo neural 3 - 5 de, y principios de cerebro 9 - 13 de) el desarrollo. El filtro sumergido papel sándwich provides un entorno sencillo y estable para la microcirugía, la implantación de bolas, la microinyección, el silenciamiento de genes, y los estudios de electroporación. Su potencial de formación de imágenes puede ser empujado mucho más mediante el uso de imágenes basado en láser (incluyendo microscopía de hoja de luz) y objetivos de inmersión.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Debido a su disponibilidad, bajo coste, la geometría plana, y la transparencia, la ex ovo embrión de pollo se ha convertido en un importante modelo animal vertebrado para el estudio de la morfogénesis eventos, tales como la gastrulación 2, neurulation 3 - 5 de, somitogenesis 6, corazón doblado 7, 8, y el cerebro la formación de 9 - 13 de, durante la embriogénesis temprana. La clave para entender los procesos morfogenéticos es seguir de forma dinámica por la imagen de lapso de tiempo. La adquisición de películas a intervalos de polluelo embriogénesis ex ovo se ha limitado ya sea a las ventanas de tiempo cortos o a la necesidad de una incubadora para controlar la temperatura y la humedad en todo el embrión 14. A continuación, presentamos una nueva técnica para la cultura de pollo embriones ex ovo de alta resolución de imagen de lapso de tiempo utilizando microscopía de luz transmitida. El sándwich de papel de filtro sumergida es una variante de la Techn portador de papel de filtro bien establecidaique (EC-cultivo) 1 y permite el cultivo de embriones de pollo sin la necesidad de una cámara climática. El embrión se intercala entre dos soportes de papel de filtro idénticos y se mantiene totalmente sumergido en un medio simple, con control de temperatura cubierto por una capa de aceite mineral ligero. A partir de la fase de línea primitiva (Hamburger-Hamilton etapa 5, HH5) 15 hasta al menos la etapa 28 somitas (HH16) 15, los embriones pueden ser cultivadas ya sea con su ventral o dorsal hacia arriba. Esto permite la adquisición de películas a intervalos que cubren aproximadamente el 30 hr del desarrollo embrionario. se muestran cuadros y películas a intervalos representativos. Los embriones se comparan morfológicamente a un embrión cultivado en las CE-cultivo estándar. El sándwich de papel filtro sumergido proporciona un entorno estable para estudiar dorsal principios y procesos morfogenéticos ventrales. También permite la formación de imágenes de fluorescencia en vivo y micromanipulaciones, tales como la microcirugía, imp granolantation, microinyección, el silenciamiento de genes, y la electroporación, y tiene un gran potencial para ser combinados con los objetivos de inmersión para la formación de imágenes basada en láser (incluyendo microscopía de lámina de luz).

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.1K vistas.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo

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Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un

Optimizado

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

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Un

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A largo plazo de imágenes en vivo

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra