Yazarlar ZonMW-VICI hibe 918.11.635 (Hollanda) mali destek kabul. Yazarlar pratik öneriler ve mikroskopi yararlı tavsiyeler kurulum bileşenleri ve Carl Zeiss Hollanda Jarno Voortman üretimi için Vrije Universiteit Amsterdam aracı dükkanı teşekkür etmek istiyorum. Marjolein Blaauboer eleştirel yazının birkaç taslak üzerinde yorum büyük bir destek oldu.

Tüm deney prosedürleri Hayvanlar Yasası üzerinde Hollanda Deneyleri göre yapılmıştır. NOT: batık filtre kağıdı sandviç yöntemi 1&#39;den değiştirilir. 1. Batık Filtre Kağıdı Sandviç Hazırlama <ol><li> Pannett-Compton (PC) -tuz 27,28 <ol><li> Stok çözeltileri A hazırlayın (ultra saf H 1 L 2 O, NaCI 121 gr, KCl 15.5 gr, CaCI2 · H 2 O 10.42 gr ve 12.7 MgCl2 g · 6H 2 O) ve B (1 L ultra saf H2O, 2.365 gr Na 2 HPO 4 · 2H 2, O, ve NaH 2 PO 4 0.188 gr · 2H 2 O), temiz 1 L&#39;lik şişe. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (Çökelmesini önlemek için bu sırayla) stok çözeltisi B 40 stok çözeltisi ilave edildi ve 60 ml ultra saf H2O 900 ml karıştırılarak PC-salin 1 L hazırlayın. PC-tuzlu taze fr hazırlayınom stok solüsyonları A ve B her hafta. Not: Stok çözeltiler birkaç ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Otoklavlama ve / veya ekleme, antibiyotikler veya antimiyotikler gerekli değildir. </li></ol></li><li> Döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka <ol><li> nemlendirilmiş bir inkübatör, kendi tarafında yumurtalarını ve istenilen yaşa gelinceye kadar 37.5 ° C onları kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Mağaza yumurta artık iki hafta daha (tercihen 12 yaşında - 15 ° C) kuluçka anlamlı, deney öncesinde azalacak olarak </li></ol></li><li> Filtre kağıdı taşıyıcıları (1 uyarlanmıştır) <ol><li> Varsa, kalın filtrasyon kağıt (28 mm x 22 mm) kum saati şeklindeki filtre kağıdı taşıyıcıları kesmek için lazer kesme makinesi kullanın. 22 mm ile 10.4 mm arasında, orta genişliği gelmez. Filtre kağıdı taşıyıcının büyük yan (Şekil 1-M elips yönelik paralel uzun ekseni ile, merkezi bir eliptik açıklık (x 5.5 mm 10.6 mm) kesip). <ol><li> İsteğe bağlı olarak, doğru boyutlara sahip bir karton şablon hazırlamak ve bir kalem kullanarak kalın filtrasyon kağıda merkezi deliğinin onun anahat ve aktarın. ince makas kullanarak filtre kağıdı taşıyıcı kesin. </li></ol></li><li> Her embriyo Eksplante edilecek için iki özdeş filtre kağıdı taşıyıcıları kesin. Bir embriyo eksplantasyonu sırasında kaybolması durumunda yedek olarak ekstra filtre kağıdı taşıyıcıları hazırlayın. </li></ol></li><li> Sıcaklık kontrollü (Deney gününde) yağ banyosu <ol><li> dik zoom mikroskop motorlu xy-sahnenin merkezinde sıcaklık kontrollü behere koyun ve sıcaklık kontrol için beher bağlayın. </li><li> ağırlık olarak hareket ve sıcaklık kontrollü beherin ortasına çanak yerleştirmek için 6 cm Petri kabı içine dört büyük paslanmaz çelikten halkalar (30 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm duvar kalınlığı) koyun. NOT: Bu Petri kabı sadece petrol leve ayarlamak için bir yer tutucu olarak hizmet vermektedirl. </li><li> hafif mineral yağ, 130 ml ısı kontrollü beher. Gerekirse, 6 cm Petri kabı üst kenarının altına yaklaşık 3 mm biter böylece eğer yağ seviyesini ayarlayın. </li><li> sıcaklık kontrollü beher 6 santimetrelik bir petri tabağına çıkarın ve 40 ° C sıcaklığı ayarlamak. </li></ol></li></ol> 2. Batık Filtre Kağıdı Sandwich Üretimi <ol><li> (Deney günü) kültür ortamı <ol><li> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne (adım 1.1.2 1.1.1 gibi hazırlanan), PC-salin 30 mi dökün. Her iki embriyo eksplante edilecek PC-salin, 30 ml ile doldurulmuş bir 50 ml santrifüj tüpü hazırlayın. </li><li> Dikkatlice 10 cm Petri kabı içine olmayan inkübe yumurta çatlak. </li><li> Petri kabı duvarlar boyunca plastik bir transfer pipet hareket ve ince albümin de emerek ince albümin hasat. Her iki embriyo eksplante edilecek bir 50 ml santrifüj tüpü içinde 30 mi, ince albümin toplayın. Sadece t elde etmek için emin olunalbümin hin. NOT: Genellikle 3-4 yumurta, ince albümin yaklaşık 30 ml hasat verir. </li><li> (Adım 2.1.1 gibi hazırlanan) her PC-tuzlu su içine ince bir albümin 20 ml dökün 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doldurulmuş. </li><li> nazikçe boruları birkaç kez ters yüz edilerek ince albümin PC-tuzlu su karıştırın. birkaç dakika yerleşmek ve burada itibaren kültür ortamı denilen karışım, berrak olup olmadığını kontrol edelim. Kültür ortamı değil açık ise, stok solüsyonu taze PC-tuzlu su hazırlamak ve taze ince albümin hasat. </li></ol></li><li> taze 6 cm&#39;lik plastik Petri kabındaki kadar birbirlerinden mümkün iki küçük paslanmaz çelik halkalar (20 mm dış çapa, yüksekliği 4 mm, 1.5 mm duvar kalınlığı, halka içerisinde 6,5 mm boşluk) yerleştirin ve kültür 22 ml ile doldurun ortam, 25 ml plastik pipet (Şekil 1-H) kullanılarak (adım 1.4.4 1.4.1 gibi hazırlanan). orta üstünde biriken enkaz santrifüj tüpüne kalır emin olun. </li><li> Herhangi bir enkaz o kaldırınr plastik transfer pipet kullanarak ortamdan kabarcıklar. </li><li> PC-tuz 75 ml ile 10 santimetrelik bir petri tabağına doldurun (adım 2.15 kullanılmak üzere). </li><li> inkübatör bir yumurta çıkarın ve embriyo sarısı üstüne gelmesine izin 1 dakika boyunca yan bankta dinlensin. </li><li> Dikkatli bir şekilde Petri kabı içine yumurta (Şekil 1-A) çatlak. Kalın akı ince dokulu kağıt parçasının kenarı daldırın ve gerektiğinde, çekerek blastodermin merkezi. </li><li> (Kalın albümin alımını kolaylaştırmak için kesilmiş ucu ile) plastik transfer pipet kullanarak Petri kabı ince ve kalın albümin en çıkarmak. </li><li> Yavaşça, doku kağıt parçası ile kalın albümin silerek merkezine (Şekil 1-B) uzaklaşarak embriyo etrafında kalın akı bir pencere oluşturun. vitellin membran takılarak gelen kağıt mendil önleyin. </li><li> cımbız kullanarak, dikkatle Vite bir filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirinEmbriyo (Şekil 1-C) ön-arka eksenine eliptik diyafram paralel uzun ekseni ile embriyo yaklaşık lline membran. </li><li> Filtre kağıdı taşıyıcıya yakın ve hızlı bir şekilde tüm filtre kağıdı taşıyıcı (Şekil 1-D) etrafında kesilmiş vitellin zarından tırnak makası bir ucu sıkıştırın. </li><li> Cımbız kullanarak, embriyo (Şekil 1-E) ön-arka eksene eğik bir doğrultuda paralel olarak kaldı sarısından filtre kağıdı taşıyıcı kaldırın. </li><li> üst embriyonun ventral tarafı var ve PC-tuzlu su içinde daldırın etrafında filtre kağıdı taşıyıcı çevirin. eğik bir doğrultuda embriyo ön-arka eksen boyunca filtre kağıdı taşıyıcı bırakın. </li><li> tüm sarısı kurtulun hala vitellin membran ve yavaşça plastik bir transfer pipet PC-tuzlu su ile yıkayarak blastoderm bağlı. bir de batık filtre kağıdı taşıyıcı tamamını tutmakll kez (Şekil 1-F). </li><li> eğik bir yönde embriyonun ön-arka eksen boyunca PC-tuzlu filtre kağıdı taşıyıcısını çıkarın ve bir kağıt mendil üzerine filtre kağıdı taşıyıcı kenarına dabbing aşırı sıvı kurtulmak. </li><li> cımbız, ikinci bir çifti kullanılarak, yukarı bakacak şekilde embriyonun ventral yüzü yatay filtre kağıdı tutun ve birincinin üstüne başka bir filtre kağıdı taşıyıcısını yerleştirin. Bunların delikler ve böylece de filtre kağıdı, iki katman (Şekil 1-G) arasındaki embriyo sandviç, tam olarak aynı olmalıdır. </li><li> Hemen embriyo ön-arka ekseni boyunca eğik bir doğrultuda kültür ortamına filtre kağıdı taşıyıcı sandviç daldırın. Iki çelik halkaları (Şekil 1 -H) arasındaki boşluğu saran alanına yerleştirin. </li><li> emin olun, diğer ikisinin üstünde iki tane daha çelik halkalar koyarak filtre kağıdı sandviç düzeltmek o e diyaframmbryo tamamen (Şekil 1-I) ortaya kalır. </li><li> orta seviyesini kontrol edin ve üst boşluk sadece orta batık olduğundan emin olun. Gerekirse, ekleme ya da ortam ile az miktardaki. </li><li> Dikkatle sıcaklık kontrollü yağ banyosu merkezinde Petri kabı koyun ve yağ yemeğin yanında üç büyük paslanmaz çelik halkalar (30 mm dış çapı, yüksekliği 4 mm, 1,5 mm et kalınlığı) koyarak çanak yanal stabilize . Çelik halkalar çanak (Şekil 1-J) kenarlarına dokunduğundan emin olun. </li><li> Orta mineral yağ sürekli bir tabaka (Şekil 1-K) ile kaplanmış, böylece yavaşça, plastik bir transfer pipeti ile ortam üzerine hafif mineral yağ, yaklaşık 6 ml pipetle. </li><li> Time-lapse edinimi ayarlayın. NOT: Beş örtüşen alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak embriyolar Görüntüleme genel overvi ile ayrıntılı görüntüleme (5X hedefi) izin verirmorfoloji 29-30 arasında ew. 3 ve 10 dakika arasında görüntüleme periyotları morfolojik ayrıntılı izleme için 31 ve küçük z yığınlarının elde etme (30 um&#39;lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak) embriyo 30 kalınlaşma ve dönme çok telafi sağlamak . En yüksek kontrasta sahip Z-uçakları (görüntü alımı ile ilgili detaylı bilgi için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakınız) time-lapse film içine tek kare daha fazla işlem öncesi 32 seçilebilir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Şekil 1: Batık Filtre Kağıdı Sandviç kurma. (A), bir yumurta, bir Petri kabı içerisine termal olarak ayrılmaktadır. (B), kalın ve ince albümin çoğu plastik bir transfer pipeti ile Petri kabı çıkarılır (gösterilmiyor). Ardından, kalın ak bir pencere oluşturulan biryavaşça bir kağıt mendil ile kalın albümin uzakta silerek embriyo yuvarlak. (C) bir filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstüne blastodermin etrafına yerleştirilir. (D), filtre kağıdı, taşıyıcı sarısı üstünden kaldırıldı Çevre vitellin membran ve (E) gevşek kesilir. (F) Kalan yumurta sarısı özenle PC-tuzlu su uzakta yıkanır. (G), embriyo, bir ikinci denk filtre kağıdı taşıyıcı ile sıkıştırılır. (H) filtre kağıdı sandviç ortamında batık ve (yukarı embriyo bakan dorsal veya ventral yüzü) iki metal paslanmaz çelik halkalar üzerinde konumlandırılmıştır. (I) İki yüzük üstten sandviç stabilize. (J), sıcaklık kontrollü yağ banyosuna aktarılır embriyolu Petri kabı. Paslanmaz çelik halkalar yanal Petri kabı stabilize. (K) kültür ortamına mineral yağ tabakası ile kaplanmıştır.Batık filtre sandviç (L) şematik. (M) batık filtre kağıdı sandviç için kullanılan filtre kağıdı taşıyıcıların boyutları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Köklü AK kültürü 1 yeni varyantı olarak, batık filtre kağıdı sandviç etrafında bir ısıya ve nem kontrollü inkübatör yaparak erken civciv embriyosu ex uzun vadeli aydınlık ve karanlık alan time-lapse film satın ovo kolaylaştırır vazgeçilebilir mikroskop. Daha ziyade, bir yan-katı agar ak alt kültüre edildikten daha embriyolar tam PC-tuzlu su ve ince albümin oluşan basit kültür ortamı içine daldırılmış olarak saklanmaktadır. Buharlaştırma ve ısı kaybı kültür ortamının üstte yüzen bir mineral yağ tabakası ile en aza indirgenmiştir. Embriyolar kalitesinde gözle görülür farklılıklar olmadan, kolayca dorsal veya ventral yüzü yukarı ya yetiştirilebilir. Burada gösterildiği gibi, batık filtre kağıdı sandviç embriyolar morfojen batırılmış boncuklar uygulaması gibi, mikrocerrahi girişimlere erişilebilir. Gelecekteki uygulamalar ma susturma canlı floresan görüntüleme, microinjections ve elektroporasyon ve geni içerennipulate ve ventral (örneğin, erken kalp ve somitogenesis) ve dorsal (örneğin, geç gastrulasyon, nöral tüp kapanma ve erken beyin) gelişimi sırasında morfogenetik olaylar geniş bir yelpazede çalışma. Filtre kağıdı sandviç içeren Petri kabı madeni yağ tabakasının altında kültür ortamının değişimi sağlayan bir perfüzyon odasının değiştirilmesi durumunda bir zamana bağlı ilaç tedavisi uygulanabilir. batık filtre kağıdı sandviç ve daldırma hedefleri (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme ile birlikte tam görüntüleme potansiyelini geliştirecek. batık filtre kağıdı sandviç hazırlama ile bazı güçlükler aşağıdaki paragraflarda ele alınacaktır. bu filtre kağıdı sandviç sarısından bir embriyo transfer eğitim sadece ılımlı bir miktar gerektirmekle birlikte, birkaç adım hala önemli ölçüde kültüründe embriyo kalitesini etkileyebilir. Filtre kağıdı taşıyıcı öncesarısı üzerine yerleştirilir, embriyo etrafında Vitellin zar herhangi bir kalın akı kurtulmuş olmalıdır. Ancak o zaman filtre kağıdı ve vitellin membran arasındaki bağlantı PC-tuzlu su içinde yıkamaya dayanacak kadar güçlü olacaktır. Mümkün olduğunca az sıvı / hava arayüzü geçmelidir embriyo taşıyan filtre kağıdı zarlar üzerinde gerginliği en aza indirmek için. Yıkama PC-tuzlu getirilen kez, tüm filtre kağıdı taşıyıcı tamamen her zaman batık kalmak zorundadır. Vitellin membran filtre kağıdı serbest başlayacak şekilde, 60 saniye - PC-tuz banyosu içinde süresi yaklaşık 30 ile sınırlı olmalıdır. sarısı kalıntıları daha sonra embriyonun görünümü belirsiz gibi hala, embriyonun temizleme, çok iyice idam edilmelidir. yıkama sırasında, radyal ondan her zaman doğrudan embriyo üzerine transfer pipeti akışı işaret ama olmadı. PC-tuzlu embriyo çıkardıktan sonra, en aza indirmek için yatay filtre kağıdı tutmak emin olunembriyonik zarlar üzerinde gerginlik. Sonra, ikinci filtre kağıdı taşıyıcı ile embriyo stabilize. İkinci filtre kağıdı taşıyıcı yerleştirilir sonra, birbirlerine göre filtre kağıdı taşıyıcıları vardiya ve embriyonik membranlar gözyaşı herhangi bir yanal gerginlik, oluşturmaktan kaçının. Filtre kağıdı sandviç kültür ortamına getirildiğinde, membranların gerilimi en aza indirmek için, sadece bir kez hava / su ara-yüzünün geçmelidir. Üstten filtre kağıdı sandviç stabilize etmek için kullanılan paslanmaz çelik halkalar ikinci çift çok yavaş yerleştirilir ve embriyonik zarların sıkıştırma en aza indirmek için herhangi bir baskı olmadan yapılmalıdır. Embriyonun alan Opaca Küçük yırtıkları genellikle kültürün ilk saat içinde iyileşir, ancak yağ tabakası kültür ortamının üstüne pipetle önce hasarlı embriyo ve her zaman yeni bir numune ile değiştirilmesi gerektiğini olabilir. Resme bir bütün embriyo ya da yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmleri için çoklu numuneler, mikrofonroscope mikroskop yazılımı tarafından kontrol edilen bir motorlu xy sahne, ile donatılmış olmalıdır. Bu görüntü kalitesini azaltacaktır kültür ortamında ve yağda embriyolar ve çalkantılar, zarar görmesini önlemek için bir asgari hız ile xy aşamalı hareket olması büyük önem taşımaktadır. Burada sunulan time-lapse film alımı için, motorlu xy aşamalı yaklaşık 1.75 mm / sn hızında taşındı. Gelecekte, görüntüleme ayrıca birinci istenen pozisyona sahne hareketli ve titreşimler ve türbülanslar kaybolup izin kısa dinlenme süresinden sonra görüntüyü alarak geliştirilebilir. daldırma hedefleri olmadan dik mikroskop kullanılması durumunda bir sınırlama olarak, potansiyel kullanıcılar bu kültür yöntemi için gerekli nispeten uzun çalışma mesafesi (yaklaşık 1 cm) farkında olmalıdır. Embriyonun üzerine orta tabakası ve mineral yağ bu çalışma mesafesi oluşur. 6 santimetrelik bir petri tabağına, yağ tabakası kalınlıkta olanYaklaşık 1 S - 1.5 mm, ve embriyo kültür ortamında derinliği yaklaşık 4 mm batırıldı. objektif çapına bağlı olarak, 6 cm Petri kabı üst kenarı da embriyo erişimi sınırlayabilir. Bu daha büyük bir çanak kullanılarak aşılabilir. üst çalışma mesafesi hafif sıvı tabakaların kalınlıkları en aza indirerek azaltılabilir. Buna ek olarak, aşağıdaki çalışma mesafesi daha aşağı Petri kabı alt embriyo getiren ve ısıtılmış beher camın kalınlığının azaltılması ile minimize edilebilir. protokol dik uzun çalışma mesafesi zoom mikroskop ile çalışmak üzere optimize edilmiş olsa da, aynı zamanda ters bir mikroskop monte edilebilir. Ön deneyler sınırlı difüzyon bir prob olarak görünmüyor düşündürmektedir rağmen gelecek kullanıcılar, kültür ortamı içinde çok derinden embriyo daldırarak O 2 -diffusion sorunları yol açabileceği akılda tutulmalıdırlem sürece embriyo kültür ortamı ve sıkıştırılmış filtre kağıdı yeterince geniş rezervuar tarafından çevrelenmiş olarak Petri kabı alt basılı değildir. Başka bir sınırlama sıcaklık kontrolü. 40 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı beher için kontrol sıcaklığının ayarlanması ile, orta sıcaklık ortamı mineral yağ ile kaplanmıştır embriyoların yaklaşık 37.5 ° C dengeler. Bu, bazı enerji ısıtma elemanları ve sıcaklık sensörü bulunan beher, alt ve embriyo arasında yer kayıp olduğunu gösterir. sıcaklık kontrol sensörü taşındıktan ve ısıtma elemanları dağıtarak optimize edilebilir.

Embriyogenezis tarihinin başlangıcından bu yana adam hayran oldu. Nasıl bir embriyo yapısı ve morfolojisi böyle bir iyi tanımlanmış zamansal ve mekansal bir şekilde gelişiyor? civciv embriyo çeşitli nedenlerle embriyogenezin klasik omurgalı hayvan modellerinden biri haline gelmiştir: anne dışında gelişen gibi, deneysel manipülasyonlar için kolayca ucuz, mevcut erken aşamalarında şeffaf ve erişilebilir. Ayrıca, bu tür kalp ve beyin oluşumu, gastrulasyon, nörülasyon ve somitogenesis 15 gibi erken morfogenetik olaylar sırasında neredeyse düz bir geometriye sahiptir. bu tür time-lapse görüntüleri satın alma yoluyla olduğu gibi, dinamik okudu eğer morfogenetik süreçler iyi anlaşılabilir. Civciv embriyo ovo 16 ama deneysel manipülasyonlar ve iletim ışık mikroskobu görüntüleme için sınırlı görüş için kötü erişilebilirlik ile görüntülendi olabilir. Bu nedenle, sever19 veya eksplant kültürleri 1,20 olarak - - 23 el teknikleri ex ovo, ya bütün sarısı kültür sistemlerinde 13,17 kültür civciv embriyolar öne sürülmüştür. Bütün sarısı kültür sistemlerinde, embriyo sağlam sarısı üzerinde kalır ve yumurta tüm içeriği inkübasyon için başka bir kaba aktarılır. Bu kap bir taşıyıcı yumurta kabuk 17, bir petri çanağı 19, ya da plastik sarılmak sargı 13,18 yapılmış bir hamak olabilir. Bütün sarısı kültürlerinde Embriyolar ideal kuluçka kadar kültüre ve micromanipulations erişilebilir olabilir. Bu teknikler, genç embriyo görselleştirmek için sabit kalırken, (kontrastını arttırır) kan dolaşımının başlandıktan sonra embriyo gelişimini incelemek için özellikle yararlıdır. Onlar sarısından çıkarıldı ve in vitro eksplant olarak kültüre eğer bu erken dönem embriyolarının en iyi görüntülü olabilir. eksplantlar deney için kolayca erişilebilirEl manipülasyonlar ve kültür için daha az yer gerektirir. Uzun yıllar boyunca, 1955 ve varyasyonları Denis Yeni öncülük ettiği bir tekniktir ve böylece time-lapse mikroskopi ve mikrocerrahi müdahalelerde 20,21 embriyo erişilebilir hale civciv embriyoları için eksplant kültürü yöntemleri altın standartları vardı. onun büyük başarısına rağmen, New&#39;in teknik nispeten zorlu ve zaman alıcıdır. Blastodermin taşıyan Vitellin membran, uygun gerilimi 1 elde etmek için, bir cam halka etrafında gerildiğinde blastoderm genellikle ayırır. Dahası, embriyo ventral yüzü yukarı bakacak şekilde sadece kültüre edilebilir. AT (Erken civciv) kültürü, Chapman ve Collignon 1 tarafından geliştirilen daha yeni bir teknik, merkezi bir açıklığı olan bir filtre kağıdı taşıyıcı kullanılarak Vitellin zarın gerilmesi aşılmaktadır. Filtre kağıdı ve böylece doğal gerilimi muhafaza, vitellin membran bağlanır ve bir resim çerçevesi 1 gibi embriyo çevreler.Embriyolar genellikle ventral yüzü yukarı gelecek şekilde, bir agar-ak alt kültürlenir. Sırt tarafı yukarı Kültürleme HH8 15 yaş ve üstü embriyo için sadece mümkün görünmektedir. Birçok grup bu tür cerrahi dikiş lifleri 24 veya zar 25 kaplanmış bir kollajen yapılmış bir destek ile agar-ak dibe değiştirerek olarak ihtiyaçlarına filtre kağıdı taşıyıcı adapte var. Genellikle, New&#39;in tekniği ile veya EC kültürü ile kültür embriyolar oksijen difüzyonunu 1,20 kolaylaştırmak için havaya onların dorsal veya ventral yüzeyi ile, maruz kalmaktadır. Bu eksplant kültürleri, ortam buharlaşmasını önlemek ve kurumasını embriyo önlemek için nemli bir atmosferde muhafaza edilmesi gerekir. Bu nemli kağıt mendil 1 ihtiva eden daha büyük bir Petri kabındaki eksplant kültürü ile çanak inkübe edilmesi ile elde edilir. Bu embriyoların zaman atlamalı görüntülerin elde edilmesi, tüm mikroskop ya da bir kıvama etrafında iklim kontrollü inkübatör kullanılmasını da gerektirirçalıçtırdıgınızda kontrollü ışık yolu 14 yoğunlaşmayı önlemek için ısıtılmış bir kapaklı konteyner. Tamamen, filtre kağıdı kültürleri 25 olarak kültür ortamında batık New&#39;in tekniği 2,21 arasında adaptions ağır mineral yağ ve albümin bir tabaka arasında sıkışmış, ya da &quot;Cornish Pasty Kültür katlanmış blastoderm eksplant olarak ovo Ancak civciv embriyolar da eski gelişebilir &quot;23,26, hava ile doğrudan temas olmadan. batık filtre kağıdı sandviç filtre kağıdı taşıyıcı tekniğinin yeni bir çeşididir. Civciv embriyolar ex ovo kültüre daha erken bilgi birleştirerek, iklim kontrollü inkübatör ve vazgeçilebilir ısıtmalı kapak yapar. Içeren kontrollü bir sıcaklıkta Embriyo iki aynı (lazer kesim) filtre kağıdı taşıyıcılar 24 ve kültürlendi, tam (2 oranında bir 3 Pannett-Compton tuzlu su 27,28 ince albümin) basit bir kültür ortamı içinde su altı arasında sandviçer. Ortamın üstünde yüzen hafif mineral yağ tabakası buharlaşma 2,21 önler ve çevreye ısı kaybını en aza indirir. kabın alt cam pencere vardır ve tüm kurulum dik uzun çalışma mesafesi zum mikroskop üzerinde gerçekleştirilir. Hamburger Hamilton bu kurulum 28-hücre gruplarının sahne erken ilkel çizgi aşamasından değişen embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat yüksek çözünürlüklü aydınlık ve karanlık alan time-lapse film edinilmesini izin verir (eşdeğer 16, HH5-16 için 5 aşamalarını ) 15. Embriyolar kendi ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde eşit derecede iyi kültüre edilebilir. (- 5, ve erken beynin 9-13, örneğin geç gastrulasyon 2, nöral tüp kapanma 3) geliştirme nedenle, embriyolar gözlem ve ventral (örneğin, erken kalp 7,8 ve somitogenesis 6) ve dorsal manipülasyonu için erişilebilir. batık filtre kağıdı sandviç pmikro boncuk implantasyonu, mikro enjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon çalışmaları için basit ve kararlı bir ortam rovides. Onun görüntüleme potansiyeli ve daldırma hedefleri (ışık-sac mikroskopi dahil) lazer tabanlı görüntüleme kullanarak çok daha fazla itilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Kalp 7 bükme, 5, somitogenesis 6 - nedeniyle doluluk durumuna, düşük maliyetli, düz geometri ve şeffaflık, civciv embriyo ex ovo gibi gastrulasyon 2 olarak morfogenetik olayların çalışma için önemli bir omurgalı hayvan modeli, nörülasyon 3 haline gelmiştir erken embriyogenez sırasında 13 - 8, ve beyin oluşumu 9. morfogenetik süreçlerinin anlaşılması için anahtar time-lapse görüntüleme ile dinamik olarak takip etmektir. Civciv embriyogenez eski ovo zaman atlamalı filmleri toplama embriyo yaklaşık 14 sıcaklık ve nemi kontrol etmek için bir inkübatör kısa süre pencereleri veya ihtiyaca ya sınırlı kalmıştır. Burada, kültür civciv için yeni bir teknik iletilen ışık mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için ex ovo embriyolar sunuyoruz. batık filtre kağıdı sandviç köklü filtre kağıdı taşıyıcı techn bir çeşididiriQue (AT-kültür) 1 ve klima kabini gerek kalmadan piliç embriyoları kültür sağlar. Embriyo iki aynı filtre kağıdı taşıyıcılar arasında sandviç ve tam hafif mineral yağ tabakası ile kaplı basit, sıcaklık kontrollü bir ortam içinde daldırılmış tutulur. En az 28-hücre gruplarının evre (HH16) 15 kadar ilkel çizgi aşamasında (Hamburger-Hamilton aşamada 5 HH5) 15 dan başlayarak, embriyolar ya da ventral ya da dorsal yüzü yukarı bakacak kültüre olabilir. Bu embriyonik gelişim yaklaşık 30 saat kapsayan time-lapse film edinilmesini sağlar. Temsili time-lapse çerçeveleri ve filmler gösterilmektedir. Embriyolar standart AT-kültürde kültüre bir embriyo morfolojik karşılaştırılır. batık filtre kağıdı sandviç erken dorsal ve ventral morfojenetik süreçleri incelemek için istikrarlı bir ortam sağlar. Aynı zamanda, mikro, boncuk imp olarak, canlı flüoresan görüntüleme ve micromanipulations sağlarlantation, mikroenjeksiyon, gen susturma ve elektroporasyon ve güçlü bir potansiyele sahip (ışık sayfalık mikroskobu dahil) lazer tabanlı görüntüleme için daldırma hedefleri ile kombine edilecek.

<img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg" /> Şekil 2: AK Kültür 1 ve Dalgıç Filtre Kağıdı Sandviç Kültür Embriyolar arasındaki morfolojik karşılaştırılması. Seçilen zaman atlamalı çerçeveler 3 saat aralıklarla embriyolar göstermektedir. Çerçeveler tam embriyo morfolojisi genel bir bakış vermek için yeniden boyutlandırılır. Embriyolar 7-hücre gruplarının evre (HH9) 15 yaş uyumlu bulundu. 0 saat, her deney başlangıcını gösterir. Ön sol her zaman. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. 1,33 alt agar-albümin EC kültürü 1, kültürlü ventral yüzü yukarı (A) Embriyo. Embriyo z-yönünde sınırlı olarak yüksek kaliteli görüntü, elde edilebilir. (B ve C) batık filtre kağıdı sandviç kültüre İki embriyolar: (B) yukarı ventral tarafı ve (C) sırt tarafı yukarı.Filtre kağıdı sandviç Embriyolar en az 27 saat süreyle nitel farklılıklar olmadan gelişebilir. Onlar fonksiyonel kan dolaşımı ve kranial ve servikal bükülmesine geliştirmek ve başarılı bir şekilde çevirin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Time-lapse edinimi mevcut mikroskop sistemine bağlıdır. Bu çalışmada, uzun bir çalışma mesafesi içinde, dik zoom mikroskop kullanıldı. yakınlaştırma faktörü 5X için kuruldu. Mercek 16X büyütme ile birlikte, bu (mikroskop yazılımı belirtildiği gibi) 1.3 mm / piksel teorik çözünürlüğü 30, 80X toplam büyütme sonuçlandı. alan-view arttırmak için, embriyolar beş alt görüntüleri (fayans) yatay manzaraları olarak görüntülendi. Bu nedenle, beş örtüşen çini oluşan bir çini bölgesi, 29 tanımlandı. Bu karo bölgesitam olarak yatay uzantı (- 0 saat Şekil 2B) filtre kağıdı taşıyıcının eliptik açıklığı kapsayacak şekilde yerleştirilmiştir. Her kiremit yaklaşık 2.7 mm&#39;lik bir alan-of-view kapsayan 2.048 x 2.048 piksel boyutu vardı ve fayans sonuçlanan% 10 örtüşme ile elde edildi saha-view yaklaşık 12 mm x 2.7 mm toplam panorama. Motorlu xy aşamalı ayrı karoların 29 edinimi arasında yaklaşık 1.75 mm / sn hızında amaca göre hareket. Canlı görüntü ön presomitic mezoderm ve en yakın zamanda oluşmuş Somitlerin (Grubumuzun araştırma odağı) üzerinde duruldu. Z-doğrultusunda embriyoların kalınlaşma ve kıvırma telafi etmek için, küçük bir Z-yığınlarının (30 um&#39;lik bir mesafe ile, beş ila yedi farklı uçak), her bir zaman noktasında 30 elde edildi. Bunlar presomitic mezodermin ön ucu odak düzlemi etrafında seçildi. Zaman atlamalı ACQ süresiuisition 50 saat için ayarlandı ve 3, 4, veya 10 dakika görüntüleme periyotları 31 seçilmiştir. 10 saat ve yeni optimum odak düzlemi etrafında z-yığını yeniden tanımlıyor - time-lapse edinimi kalitesi her 5 refocusing ile geliştirilebilir. Deney sonunda, bütün zaman serisi elle düzenlendi ve en iyi odak z-düzlemi içeren görüntülerin alt grupları oluşturulur ve ayrı bir klasöre 32 kaydedildi. Görüntülerin Bu alt kümeler zaman dikişli optimum odak görüntülerin tam bir zaman serisi oluşturmak için vardı. Bu tam bir zaman serisi her görüntünün fayans dikişli ve gölgeleme düzeltme 30 olmadan kaynaşarak ve zaman atlamalı çerçeveleri% 100 büyüklüğü ve% 95 sıkıştırma 32 JPEG görüntüleri olarak ihraç edildi bulundu. Time-lapse çerçeveleri profesyonel video düzenleme yazılımı içine bir görüntü dizisi olarak ithal edildi. Ayrıntılı% 100 yakınlaştırır stabilize edilmiş ve genel kontrast bizim sevme ayarlandı. Nihai zaman ihmaller kodlamak vardıH.264 codec d ve MPEG-4 konteyner ihraç etti. Filmler 15 kare / sn (fps) ve 1.920 x 1.080 piksel çözünürlükte bir kare hızında görüntülenir. Şekil 2 EC kültür 1 (Şekil 2A) embriyo ve batık filtre kağıdı sandviç kültürü iki embriyolar, bir varlık kültürlü ventral yüzü yukarı (Şekil 2B) ve diğeri dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) arasında bir karşılaştırma gösterir. Tüm embriyo aynı yaştaki yedi hücre gruplarının aşama (HH9) 15 ve 4 dakika (Şekil 2A ve B) ya da 10 dakika (Şekil 2C) bir zamansal çözünürlüğü ile görüntülendi. 3 saat aralıklarla seçilen kareler tasvir edilmektedir. AK kültürü (Şekil 2A) nedeniyle 1,33 alt istikrarlı bir agar-albümin dayanan embriyo çok kararlı görüntüleme izin verdi. Tüm embriyo t boyunca bir odak düzlemi kaldıo bütün zaman atlamalı. Bu kısa deneyler (birkaç saat) ve çok erken embriyolar için yararlı olabilir, ama muhtemelen uzun vadede başarılı üç boyutlu gelişimini engelleyen z-yönünde embriyo, güçlü bir hapis ile birlikte geliyor. Başlangıçta, hapsetme sadece ventral yüzü yukarı (0 saatte Şekil 2A ve 2B karşılaştırın) ile batık filtre kağıdı sandviç kültüre bir embriyo ile karşılaştırıldığında embriyonun kafasının hafif yanal düzleşme sonuçlandı. Daha sonra, baş dönüm (Şekil 2A - 21 saat) engelli ve kalp atışları yavaşladı. Kan dolaşımı neredeyse durdu. AK kültüründe embriyonun tam time-lapse için ek Movie 1 Bkz. sol alt paneli tam çözünürlükte kalp gelişimini görüntüler ise bu filmde üst panel, embriyo tam bir özetini göstermektedir. Somitlerin içine presomitic mezodermin segmentasyon se olabilirAlt sağdaki ayrıntılı olarak tr. batırılmış filtre kağıdı sandviç Embriyolar, diğer yandan, sadece bunları çevreleyen zarların doğal gerilim ile, üç boyutlu bir genişleme sınırlıydı. Bunlar ventral (Şekil 2B) ya da dorsal tarafına kadar (Şekil 2C) ile ya da kültür olabilir. Her iki durumda da, embriyolar sürekli somitogenesis gösterdi ve onların başları döndü. Bu kafa ve boyun eğme ve fonksiyonel kan dolaşımını geliştirdi. Başın parçaları yavaş yavaş mezodermin segmentlere kısmı odak kalırken embriyolar, büyüdü kalınlaşmış ve dönmeye başladı olarak odak dışına böylece filtre kağıdı sandviç Her iki embriyolar, bölümleme mezodermin odaklanarak görüntülendi (21 saat 27 saatte Şekil 2B ve 2C karşılaştırın). Ek Film 2 tasvir embriyonun tam time-lapse film gösterirŞekil 2B. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Bu filmin üst panel embriyo tam bir bakış gösterir. Embriyonun gelişimi nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm ardışık üzerinde 46 saat görüntülendi, ama yaklaşık 30 saat sonra, bölümleme mezodermin odak kayboldu. Sol alt panel edinilen time-lapse kare tam çözünürlükte kalbin erken gelişim gösterir. orta hatta her iki tarafında eşleştirilmiş kardiyak primordia füzyonu ile, hemen hemen düz bir boru biçimindeki bir yapı, daha sonra dayak ve sağa doğru eğilmeye başlar ki, meydana getirilir. Sağ alt paneli en son oluşmuş somitler ve tam çözünürlükte presomitic mezodermin ön ucu gösterir ve zamanla yeni Somitlerin oluşumunu izler. Ek Film 3 kültüre başka embriyo gösterir ve batık filtre kağıdı sandviç yukarı ventral tarafı görüntülenmiş. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. Film th kapsarevre HH5-6 yaklaşık embriyonun e gelişimi, HH14 15 kültür süresi boyunca yaklaşık 27 saat sahne. Baş formları kat ve posterior ilerler. ikili primordiasında kalp şekilleri, dayak ve sağa eğilir başlar. ilk üç ile dört Somitlerin eş zamanlı olarak oluşturur. Ek Somitlerin presomitic mezodermin ön ucundan sırayla kapalı tomurcuk. alt panel yüksek detaylı baş kat ve erken kalp oluşumu gözlem izin tam çözünürlükte embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Nedeniyle embriyonun şeffaflık, nöral tüpün kapanması gelecek kafa bölgesinde görülebilir. Alt panelde tam görüntüleme zamanla tam çözünürlükte aynı embriyoda Ek Film 4 görüntüler hücre gruplarının oluşumu. Ek Film 5 embriyo kültüre sırt tarafı yukarı (Şekil 2C) tam time-lapse gösterir. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. upp ikener paneli yaklaşık sahneye HH16-17 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) embriyo gelişimini gösterir, alt panel tam çözünürlükte bu aşamada erken beyinde morfolojik değişiklikleri görüntülemek için kırpılır. Nöral tüpün yerel şişlik daha sonra 13 aşamaları embriyonik beyin beş alt bölgelere bölmek olacaktır ön beyin, orta beyin ve Beyin ve bölgeselleşme, yol izlenebilir. Buna ek olarak, optik veziküllerin büyümesi açıkça görülebilir. kültüründe yaklaşık 30 saat sonra, embriyo ölüyor. mikrocerrahi manipülasyonlar ile su altında filtre kağıdı sandviç uyumluluk birkaç polistiren mikro-göstermek için (~ çapı 40 um) içine veya daldırılmış filtre kağıdı sandviç kültürünün bir tavuk embriyo presomitic mezoderm yakın yerleştirildi. mikro-saklama tamponu ve implan uzaklaştırmak için PBS içinde yıkandıted önce hafif mineral yağ tabakası ile kültür ortamının kapsayan (protokol bölümünün 2.18 adıma karşılaştırın). Bir cam Pasteur pipet mikroskop göz mercekleri ile gözlem altında, embriyo yüzeyine boncuk transferi için kullanılmıştır. Beş delik yavaşça bir akupunktur iğnesi ile kazıyarak endoderm yaratılmıştır. germe ve bir alev bir cam Pasteur pipeti bükme tarafından oluşturulan bir ısmarlama J-şekilli araç, boncuk işlemek ve onlar hareketsiz hale gelene kadar deliklere dikkatle itmek için kullanılmıştır. Üç delikli bir tanesi, her bir ile doldurulmuştur (Şekil 3A - 0 saat ve 3B *) ve iki boncuk her biri için (Şekil 3A - 0 saat), iki delik açın. Şekil 3a, seçilen zaman atlamalı dilimlerinde, tanelerin mikro implantasyondan sonra civciv embriyo gelişimi. Üç takviye kanadının başarılı bir şekilde istenen konuma dokusuna dahil edilmiştir, ve hareketleri boyunca görüntülenmiştiryüksek detay (Şekil 3B) deney ders. Embriyonun gelişimi manipülasyon ya da boncukların varlığı ile değer düşüklüğüne görünmüyordu. Tam time-lapse film için Yan Sinema 6&#39;ya bakınız. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg" /> Şekil 3: microbead İmplantasyonu sonra Time-lapse Görüntüleme. Proof-of-prensibi deney microbead implantasyonu ile batık filtre kağıdı sandviç uyumluluk gösteren. Embriyonun başı solunda, ancak, bu deney sırasında görüntüsü değildi. Görüntüler karanlık alan aydınlatma kullanılarak elde edildi. (A) Seçilen time-lapse yedi mikroboncuk implantasyonu sonrası 3 saat aralıklarla manipüle embriyo gösteren çerçeveleri (~ 40 mikron çapında). Sürekli uzatılmış ve embriyo ilave somit oluşturulanes. Üç boncuk düzgün bağlanmış ve kültür 18 saat içinde doku akışı ile medial taşınmış gibi görünüyor. Diğer dört boncuk 6 ila 9 deliklerinden dışarı kültürünün hr attı ve posterior sürüklendi. Deneyin başında (0 saat, B *) ve inkübasyon 12 saat sonra (B **) de presomitic mezoderm içine implante (B) üç tek boncuk Ayrıntılı görünüm (B3 B1). Sadece oluşturan Somitlerin sayısı (B B * daki S9 ve S18 **) belirtilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg" /> Ek Film 1: AT-kültür ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının sahneye itibaren bir agar-ak botto üzerinde (HH9) 15 1, kültürlü ventral yüzü yukarı AK kültüründe Embriyo,m 1,33. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman sol üst köşesinde görüntülenir. Embriyo z-doğrultusunda sınırlı olduğu gibi yüksek kaliteli görüntüler, kazanılmış olabilir. 21 saat sonra, kalp atışı ve kan akımı neredeyse tutuklandı ve embriyo parçalamak başlamıştı. alt paneller tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) &#39;de presomitic mezoderm (sağ panel) kalp gelişimini (sol panel) ve segmentasyon görselleştirmek ederken üst panel, embriyo bir yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg" /> Ek Film 2: Batık Filtre Kağıdı Sandviç ventral Side Up. Yedi hücre gruplarının aşamasında (HH9) 15 itibaren, ventral sid gelen batık kağıt sandviç kültüre embriyoe yukarı bakacak. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel arka arkaya, 46 saat boyunca embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. Sol alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) görüntü alımı ilk 10 saat boyunca erken kalp gelişimini görüntüler. Sağ alt paneli odak nedeniyle genel kalınlaşma ve embriyonik doku dönüm kaybetti kadar tam çözünürlükte (% 100 zoom) gelişme yaklaşık 30 saat boyunca mezoderm segmentlere betimlediği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg" /> Ek Film 3: Baş Katlama oluşumu. dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı oreklam süreç / kafa kat aşaması (HH5-6) 15 yaklaşık 22 hücre gruplarının sahne (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 zoom) embriyonun baş bölgesini göstermektedir. Baş kat ve erken kalp ve nöral tüp kapanması oluşumu görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 4" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg" /> Ek Film 4: Somitogenesis. Baş-işlem / kafa kat aşamada (HH5-6) den batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı 15Yaklaşık 22-hücre gruplarının evre (HH14) kültür süresi 15 yılı aşkın kabaca 27 saat için. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman 24 saat sonra yeniden başlatmayı, saat ve dakika olarak sol üst köşesinde görüntülenir. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) &#39;de segmentlere paraxial mezoderm göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg" /> Ek Film 5: Batık Filtre Kağıdı Sandviç Sırt Side Up. Yaklaşık HH16-17 sahneye 15 yedi hücre gruplarının aşamada (HH9) 15 dan batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür dorsal yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 10 dk oldu. göreli zaman görüntülenirsaat ve dakika içinde sol üst köşesinde, 24 saat sonra yeniden başlatmayı. üst panel embriyonun gelişiminin yeniden boyutlandırılmış özetini göstermektedir. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) erken beyinde morfolojik değişiklikler göstermektedir. embriyo kültüründe yaklaşık 30 saat sonra öldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a> <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg" /> Ek Film 6: microbeads İmplante. Dokuz hücre gruplarının aşamada (HH9-10) 15 başlayarak yaklaşık 19 saat için batık filtre kağıdı sandviç Embriyo kültür ventral yüzü yukarı. Görüntüleme aralığı 4 dakika idi. göreli zaman h ve min sol üst köşesinde görüntülenir. Yedi mikroboncuklarının pr içine implante ile üst panel kuyruk bölgenin yeniden boyutlandırılmış genel bakışını gösteriresomitic mezoderm. alt panel tam çözünürlükte (% 100 yakınlaştırma) implante mikro boncuklar ile bölgeyi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(Sağ indirmek için tıklayın).</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.1K Görüntüleme.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...