Las células de la cresta neural emigran de los pliegues neurales craneales en embriones o cuando se colocan en cultivo. Esto proporciona un método conveniente para aislar las células primarias de la cresta neural migratoria sin disociación celular. Mientras que la migración de la cresta neural ocurre típicamente dentro del entorno embrionario tridimensional, la cultura bidimensional permite la visualización e investigación de los procesos relacionados con la migración.
Aunque existen protocolos de cultivo del pliegue neural craneal, este método requiere entrenamiento y pasos específicos del organismo. Este video demuestra técnicas para facilitar la preparación reproducible de cultivos de pliegues neurales craneales de pollo. Los principiantes a menudo luchan con la disección y el recubrimiento de los pliegues neuronales y la evaluación de los resultados de la cultura.
Seguir las pautas de disección y aplicar el análisis morfométrico aquí descrito permite obtener resultados consistentes y cuantitativos. Para comenzar, coloque los huevos fertilizados en posición vertical dentro de una incubadora humidificada a 38 grados centígrados. Después de retirar los huevos de la incubadora, desinfecte las cáscaras rociando bien etanol al 70% y dejándolas secar.
Para fijar y teñir los cultivos, use cubreobjetos de vidrio colocados en una placa de cultivo de tejido de múltiples pocillos y pipetear suficiente solución de fibronectina para cubrir el fondo del pozo. A continuación, vuelva a colocar la tapa e incubar la placa con una solución de fibronectina en una incubadora humidificada a 38 grados centígrados durante al menos una hora mientras disecciona los pliegues neurales. Use pinzas romas para hacer un pequeño agujero en la cáscara de 1/4 a 1/3 de la longitud del huevo.
Inserte cuidadosamente las pinzas romas en el orificio pequeño, asegurándose de no interrumpir la yema. Luego, corte a través de la cáscara del huevo alrededor del huevo, retire la parte superior de la cáscara del huevo y coloque el embrión para el aislamiento. Prepare el embrión usando suavemente el borde plano de pinzas romas cerradas para limpiar cualquier exceso de albúmina en la superficie de la yema que cubre el embrión.
Use fórceps para colocar un marco de soporte de papel de filtro sobre el embrión, con el embrión en la ventana del marco. Presione suavemente el papel de filtro para adherirse a la yema. Corte alrededor del exterior del marco de papel de filtro con tijeras de disección.
Use fórceps o puntas de tijera para agarrar el borde del marco y levante suavemente el embrión lejos de la yema. Coloque el embrión con el marco de papel hacia abajo en una placa de Petri de 60 o 100 mililitros llena de Ringer con estreptococo por pluma. Mantenga el plato de embriones en hielo si los recolecta para una aplicación posterior sensible al ARN o a las proteínas.
Transfiera un embrión a un plato limpio que contenga la solución pen-estreptocócica de Ringer. Agite suavemente el embrión hacia adelante y hacia atrás para eliminar cualquier yema que oscurezca la vista, e intercambie la solución de estreptococo de Ringer o transfiérala a un plato fresco si se vuelve turbia. Coloque el embrión dorsal y el marco hacia arriba bajo un microscopio de disección.
Deje el embrión en el marco de papel para mantenerlo estirado y mantenido en su lugar. Luego, retire la membrana vitelina, usando fórceps para exponer los pliegues neurales. Incluye tejido caudal a las vesículas ópticas en expansión y rostral al cerebro posterior, donde las constricciones rombomeras apenas comienzan a aparecer.
Usando tijeras de resorte, extirpe cuidadosamente los pliegues neuronales del mesencéfalo. Tenga cuidado de extirpar el aspecto más dorsal del pliegue neural con una contaminación mínima del tubo neural y el ectodermo no neural, y transfiera los pliegues neurales a un plato limpio que contenga la solución pen-estreptocócica de Ringer utilizando una pipeta P20 o una pipeta Pasteur de vidrio estéril enjuagada con yema Solución de estreptococo de Ringer. Almacene los pliegues recolectados en hielo mientras disecciona pliegues adicionales.
Después de retirar la placa de cultivo de la incubadora, use una pipeta o pipeta Pasteur para extraer la solución de fibronectina de los cubiertos, la placa o el pozo. Después de enjuagar el sustrato recubierto de fibronectina con la solución pen-estreptococo de Ringer, agregue un volumen apropiado de medios de cultivo completos al plato o pozo. Para bloquear el plástico y evitar que el tejido se pegue, use un pipetor P20 o P200 y enjuague la punta de la pipeta con la solución de estreptococo de yema Ringer.
Luego, transfiera los pliegues neurales aislados hacia el centro del resbalón de cubierta recubierto de fibronectina, teniendo cuidado de transferir la menor cantidad posible de solución de estreptococo de Ringer. Después de dejar que los explantes se asienten durante 10 a 15 minutos, colóquelos en una cámara humidificada a 38 grados centígrados llevando lenta y cuidadosamente la placa de cultivo con pliegues neurales plateados. Retire los medios de cultivo con una pipeta Pasteur y enjuague los pocillos con PBS esterilizado por filtro.
Agregue 4% de paraformaldehído y manténgalo en una coctelera de plataforma durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, retire el paraformaldehído, enjuague los pocillos tres veces con PBS y agregue PBST que contenga 5% de suero. Ahora, pipetear 30 microlitros de faloidina conjugada Oregon Green de 200 nanomolares sobre una superficie lisa para cada cubreobjetos.
Usando un par de fórceps, retire el cubreobjetos del PBST que contiene 5% de suero, asegurando la orientación de las células hacia arriba. Absorba el exceso de líquido tocando brevemente el borde de la cubierta con un limpiaparabrisas de tareas delicadas. Coloque suavemente cada lado de la célula deslizante de la cubierta hacia abajo sobre la gota de faloidina diluida e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después del período de incubación, levante el resbalón de la cubierta de la solución de tinción y colóquelo de nuevo en la placa de cultivo, volteándolo para que el lado de la celda quede hacia arriba. Asegúrese de cubrir el cubrebocado con PBST y colóquelo en un agitador de plataforma durante 10 minutos, manteniendo los cubreobjetos cubiertos y en la oscuridad. Retire PBST y repita el lavado de los cubreobjetos dos veces para un total de tres lavados de 10 minutos.
Coloque una gota de medios de montaje en un portaobjetos de microscopio. Monte el lado de la celda deslizante de la cubierta hacia abajo bajando lentamente el deslizamiento de la cubierta en ángulo sobre el medio de montaje para evitar la creación de burbujas y permita que el medio se fije antes de la imagen. Finalmente, cree una imagen de las celdas teñidas y expórtelas como archivos TIFF.
Las células de la cresta neural comenzaron a emerger de los explantes del pliegue neural adherente dentro de las tres o cuatro horas posteriores a la incubación, y la migración se completó después de aproximadamente 20 horas. Las células migratorias de la cresta neural se marcaron con HNK-1, y la mayoría de las células parecían ser positivas para HNK-1. Las células de la cresta neural migradas se visualizaron tiñendo actina filamentosa con faloidina.
Las imágenes de las células teñidas con faloidina se procesaron utilizando ImageJ para producir una imagen de umbral en la que las células aparecían negras con un fondo blanco. Se analizó la imagen umbral y se mostraron varias mediciones en gráficos de barras contrastantes o diagramas de violín. Por ejemplo, el área promedio de las 69 células analizadas fue de aproximadamente 802.11 micrómetros cuadrados, que van desde 60.27 a 2, 664.53 micrómetros cuadrados.
La circularidad refleja la protuberancia de la célula y varía de 0.101 a 0.875. Los valores más bajos indican una forma alargada, mientras que un valor de uno indica un círculo perfecto. La mayoría de las células exhibieron una forma alargada, que se ve más fácilmente en la trama del violín.
Las células migratorias de la cresta neural en este campo tenían una relación de aspecto promedio de aproximadamente 2.13, y una relación de aspecto de uno indica una forma simétrica. La escisión cuidadosa y el recubrimiento de explante son cruciales para el éxito de los cultivos. Permita que los pliegues neurales se asienten cortados hacia abajo durante 10 a 15 minutos, y luego transfiéralos lentamente a la incubadora para fomentar la adhesión.
Las variaciones de estas técnicas incluyen la manipulación genética transitoria antes del cultivo y las imágenes de lapso de tiempo durante la incubación. Además, este protocolo permite la recolección de poblaciones de células de cresta neural premigratorias y migratorias para el análisis a nivel ómico.
