Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.

Toda la investigación animal fue aprobado por la Universidad de California, San Francisco Comité de Investigación Animal y se llevó a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Departamento de Salud y Servicios Humanos, Publicación No. 85-23, 1985 EE.UU. ). Los animales fueron seguidos de cerca por los veterinarios del Comité Institucional Animal UCSF Cuidado y Uso (IACUC), acreditado por AAALAC. Se obtuvo una hembra Sprague-Dawley con un 8 días de edad camada (10 crías por camada). La madre y sus crías se les dio comida y agua ad libitum y se alojaron en una instalación de cuidado de los animales de la temperatura y controlado por la luz con el enriquecimiento de todos los días, de acuerdo al protocolo de IACUC, hasta que los cachorros fueron 10 días de edad. Todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en este procedimiento se trataron en autoclave para asegurar la esterilidad. Esterilidad de puntas del instrumento se mantiene durante toda la cirugía. 1. Medio oclusión de la arteria cerebral <ol><li> Pesar el cachorro y garantie que es el peso adecuado (19-21 g). Anestesiar al cachorro en 3% de isoflurano en 100% O 2 y asegurarse de que no hay respuesta a una pizca pie. Mantener la temperatura de superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C con el uso de una almohadilla de calefacción bajo el escenario quirúrgico. </li><li> Asegurar el animal en posición supina con cinta a través de las regiones de los hombros. El uso de bastoncillos de algodón estériles, limpie el área cervical anterior con una solución de povidona-yodo seguido por un hisopo de 70% de etanol en agua bidestilada, alternando entre cada solución durante cuatro hisopos totales. </li><li> Localmente infiltrarse bupivacaína al 0,25% en el lugar de la incisión planeada. El uso de un estereoscopio, hacer una línea media incisión cervical 5 a 7 mm anterior para exponer la arteria carótida común (CCA). Coloque 2-4 retractores para mantener la cavidad abierta y la arteria expuesta. </li><li> Localizar la arteria carótida interna (ICA), arteria occipital (OA), y la arteria carótida externa (ACE). El novio de las arterias para obtener una visión clara. Ser autoeful no perturbar el nervio vago. NOTA: Para cachorros con operación simulada, el inicision se deja abierta y las arterias están expuestos, después de lo cual la incisión se sutura cerrado. El tiempo total de la anestesia es equivalente a la de la cirugía de la oclusión. </li><li> Cortar 1,5 cm de seda 6-0 hilo de sutura trenzado. Destrenzar la sutura, sacando hebras individuales. Asegúrese de que las cadenas individuales están ordenadas y no deshilachado. NOTA: Si es necesario, smoothe los extremos deshilachados por inmersión de la cadena sencilla en agua estéril y el aseo la hebra con puntas de fórceps. </li><li> Mientras sostiene el hilo de sutura con una pinza de 45 grados, mover las pinzas en un movimiento de arco de barrido a pasar por debajo de la ICA para que las puntas de fórceps surgen entre el ICA y OA. NOTA: Si la disección se hace bien, este paso será relativamente fácil. Si la ACI y la OA se tocan, tenga cuidado de no romper las arterias cuando el uso de los fórceps para aislar el ICA. Si se produce sangrado, aplicar presión a la arteria con las pinzas hastael sangrado se detiene. Absorber la sangre con una gasa estéril. </li><li> Tome el extremo del hilo de sutura que es retenido por la pinza y tire de ella para que el extremo es de fácil acceso. Soltar la hebra a partir de los fórceps y una copia de las pinzas de debajo de la ICA, invirtiendo el movimiento en el paso 1.5 (Figura 1A). </li><li> Atar una ligadura temporal alrededor de la ACI en la base, más cercano a donde se separa de la CCA. NOTA: Es importante para atar el nudo para que el extremo de la hebra que se sacó para eliminar el nudo es lo suficientemente largo (superior a 1 mm, de menos de 3 mm) para agarrar fácilmente con fórceps, garantizando al mismo tiempo que existe una cantidad apropiada de hilo de sutura en el otro lado del nudo para la retracción. </li><li> retraer con cuidado la ICA lateralmente y utilizar un clip para asegurar la hebra para el exceso de piel cerca de la región axila en el lado opuesto de la incisión. Asegúrese de que este hilo de retracción es lo suficientemente tenso para detener el flujo de sangre antes de proceder a la siguiente etapa, aminimizar el riesgo de hemorragia no controlada. Observe que la arteria es plana y pálido. NOTA: No se exceda en retracción, ya que puede causar una rotura parcial o total de la ACI. La retracción puede ajustarse justo antes de hacer la arteriotomía tirando de la hebra en el lado opuesto al clip. </li><li> Usar 45 ° pinzas para agarrar otra hebra de sutura sin trenzar y el bucle por debajo y alrededor de la ICA, como en el paso 1.5. Posición esta hebra lateral a la cadena de retracción (Figura 1B). NOTA: Este paso también se puede hacer antes de la retracción. Si no está seguro acerca de la calidad de la retracción, este nudo puede ser muy libremente atado antes del siguiente paso. </li><li> Cortar una mitad de camino arteriotomía 0,2 mm entre las ligaduras atadas y no vinculadas, errar más cerca de la ligadura atado. NOTA: La sangre restante en la arteria atado-off puede vaciar a través de la arteriotomía, pero no debe exceder de 5 l. Si el sangrado continúa, tire con cuidado de la hebra de retracción para aumentar la retracción, con la atención a unavoid dañar la arteria de la tensión excesiva. </li><li> Usando una regla métrica, medir la sutura oclusiva y cortar la sutura con una asignación adicional de 2-3 mm para la eliminación del oclusor durante la reperfusión. Mantenga el oclusor con pinzas de 45 grados y el uso de fórceps rectas para crear una curva en la longitud apropiada para alcanzar el MCA, marcando un punto de parada para el adelanto. NOTA: A 10 mm de longitud de la oclusión desde el extremo de la punta de silicona a la curva se usa para P10 Sprague Dawley o Long Evans crías de rata en este rango de peso. </li><li> El uso de 45 ° fórceps, alimentar la sutura oclusión nylon recubierto de silicona en la arteriotomía y avanzar la sutura a la curva que marca la distancia predeterminada a la MCA (Figura 1C). Asegurar que el avance se siente suave; parar inmediatamente avance si se sienta resistencia. Durante el avance, el objetivo de la sutura en una dirección que es paralela a la CC / ECA, hacia la cabeza. NOTA: Si la sutura dorsal es avanzada, haciala columna vertebral del animal, que se puede ejecutar en la arteria pterigopalatina (PTA). Si la resistencia se sentía después de 3-5 mm de avance, la sutura ha afectado a la unión PTA. Copia del oclusor fuera de la arteria hasta que la cabeza de silicona es cerca de la arteriotomía antes de ajustar la dirección de avance. No es necesario eliminar por completo el oclusor de la arteriotomía. </li><li> Asegurar el oclusor atando una ligadura temporal, usando la hebra de la etapa 1.10 (Figura 1D). </li><li> Retire el clip retractor. Recortar las hebras de las dos ligaduras temporales de manera que la hebra del nudo que se tira para retirar el nudo es fácil de agarrar con pinzas rectas y es más larga que la hebra que se tira para apretar el nudo. NOTA: Los hilos deben ser lo suficientemente corto para que no se enreden en la cavidad después del cierre. </li><li> Eliminar los retractores y cerrar la cavidad usando 6-0 seda trenzada para crear tres a cuatro suturas interrumpidas. </li><li> Retire el cachorro deanestesia y lo coloca sobre una almohadilla de calentamiento en aire ambiente. Supervisar el cachorro hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para mantener decúbito esternal y asegúrese de que se ha recuperado completamente antes de volver a la presa. Asegúrese de que el cachorro mantiene una temperatura de la superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C. </li><li> Durante la oclusión, la resonancia magnética de difusión ponderada (DW-MRI) bajo anestesia con isoflurano se puede utilizar para verificar la inducción apropiada de la lesión. La Figura 2 demuestra la lesión isquémica en curso detectada por DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: giro imagen planar eco ponderada-Diffusion se lleva a cabo de 10-15 minutos antes de la reperfusión. todo el cerebro se forma la imagen con 2 mm de espesor secciones coronales en serie usando los siguientes ajustes de la secuencia de impulsos: TR / TE = 5.000 / 60 ms, 4 promedios, campo de visión = 35 mm, matriz de datos = 128x128, duración gradiente de difusión = 20 ms, separación = 29,7 ms, amplitud = 70mt / m, y b-factor = 1.045 s / mm2.Animales que presentan una falta de implicación cortical o lesión isquémica atípico, tal como en el tronco cerebral, están excluidos. </li></ol> 2. La reperfusión NOTA: La oclusión se lleva a cabo durante 3 h para producir una cantidad de moderada a grave de lesión que involucra el cuerpo estriado y la corteza. <ol><li> En aproximadamente 2 h y 50 min después de la oclusión de la MCA, anestesiar el cachorro en 3% de isoflurano en 100% O 2. Mantener una temperatura de superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C con el uso de una almohadilla de calefacción bajo el escenario quirúrgico. </li><li> Retire las suturas interrumpidas desde el paso 1.16 y localizar la unión, que está marcado por las dos ligaduras y el extremo de cola de la sutura oclusiva. NOTA: los animales con operación simulada se inducen y permanecen bajo anestesia durante un período de tiempo equivalente a los animales ocluidos. La incisión se abre una vez más y se sutura cerrado. Para los animales con operación simulada, continúe con el paso 2,11. </li><li> Con cuidado, desateel nudo más lateral previamente atado en el paso 1.14 tirando de la cadena más larga. NOTA: Si hay resistencia en desatar el nudo, deja de asegurar que la hebra correcta del nudo se está tirando. Si la resistencia continúa, aumentar la ampliación para una mejor visión. Tenga cuidado cuando la desvinculación, ya que es posible dañar la arteria durante este paso. </li><li> Retire el hilo de sutura de la cavidad. </li><li> Exactamente a 3 h después de la oclusión de la ACM, lentamente la sutura oclusiva de la arteria. No habrá ninguna resistencia. NOTA: En la mayoría de los casos, no habrá sangrado. Si se produce una pequeña cantidad de sangrado, aplicar presión a la arteria en el sitio arteriotomía. </li><li> El uso de fórceps para aplicar presión a la arteriotomía, como el siguiente paso restablece el flujo sanguíneo ICA para la reperfusión. </li><li> Cuidadosamente desatar el nudo medial usando el mismo método que en el paso 2.3. </li><li> Retire el hilo de sutura desde el cuerpo y aplicar un agente hemostático a la arteriotomía para detener el sangrado. </li&gt; <li> Asegúrese de que el sangrado se detenga. NOTA: El Retorno forma original de la arteria y el rojo confirma que el flujo sanguíneo ICA ha sido restaurada. </li><li> Eliminar los retractores y cerrar la cavidad con tres a cuatro suturas interrumpidas de 6-0 seda trenzada. </li><li> Retire el cachorro de la anestesia y colocarlo sobre una almohadilla térmica en el aire de la habitación. Monitorear hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal y garantizar la plena recuperación antes de devolverla a la presa. Asegúrese de que el cachorro mantiene una temperatura de la superficie corporal entre 35,5 ° C y 37 ° C. </li><li> Inspeccionar las crías al día durante 5 días. Recprd sus pesos e inspeccionar los sitios de incisión de cerca para la curación adecuada. Retire las suturas después de 7-14 días. Lesiones post-tMCAO se pueden obtener imágenes con resonancia magnética, si se desea 9. NOTA: Los animales pueden perder hasta 1 g de peso en el primer día, pero normalmente recuperar el peso sin la intervención y estar dentro de un similares sopesart rango a los controles por día 4-5. En raras ocasiones, un cachorro puede perder el exceso de peso o tienen dificultades para alimentarse, lo que requiere de una sonda oral alimenta durante 2-3 días. </li><li> En P21, lesión se puede evaluar de manera fiable con las pruebas de comportamiento sensoriomotoras, tales como rotarod o la cría de cilindro. Las pruebas cognitivas se puede realizar tan pronto como 4-6 semanas de edad usando evaluaciones tales como el reconocimiento de objetos novedosos o el laberinto de agua de Morris 13. </li><li> La eutanasia a las ratas por inyección intraperitoneal de Euthasol (50 mg / kg) para la cosecha cerebro 11, 12. </li><li> El análisis histológico para evaluar el volumen de lesión o respuesta a las intervenciones pueden llevarse a cabo con violeta de cresilo o tinción H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Los pasos críticos en el protocolo En primer lugar, es importante para mantener la normotermia desde la iniciación de la anestesia hasta la recuperación completa, ya que hay efectos tanto de la hipotermia y la hipertermia 17 18 en la progresión de la lesión cerebral en animales inmaduros y maduros a conocer. En segundo lugar, asegurando al mismo tiempo el animal y retraer la incisión, un posicionamiento óptimo de monitor de respiración y para garantizar que la tráquea está libre de compresión es esencial. En tercer lugar, evitar apretar o estirar el nervio vago, ya que esto puede causar cambios en la frecuencia cardíaca con la estimulación vagal. En cuarto lugar, debido a la retracción de la ICA es necesario para controlar el sangrado durante la arteriotomía, se debe prestar atención al grado de tensión durante la retracción para evitar dañar la arteria. Si la arteria no lágrima de retracción, o si hay una mala incisión arteriotomía, el animal debe ser excluido del análisis debido al riesgode la hemorragia y la mala reperfusión. Modificaciones y solución de problemas El uso de MRI como una guía, la longitud de la sutura puede ser optimizada para asegurar que la punta de silicona ocluye correctamente la MCA para crear la isquemia focal. Si la RM no está disponible, las crías pueden ser sacrificados antes de la reperfusión para la disección para visualizar la colocación de la sutura. Ajustar la longitud de sutura según sea necesario. El peso de las crías altamente correlaciona con los requisitos de longitud de oclusión de sutura. El tiempo de oclusión se puede modificar para ajustar el grado de gravedad de la lesión. Además, la forma de la sutura y la longitud son críticos. Para P10 ratas Sprague-Dawley y Long Evans que pesaban 19-21 g, 10 mm es la longitud óptima de la inserción en nuestra experiencia. Además la inserción de la sutura oclusiva puede resultar en la perforación de la MCA. Además, la consistencia en la forma del filamento de oclusión en cada cirugía resultará en un aumento de la consistencia de la lesión pattern 19, 20. Por esta razón, se recomienda el uso de suturas fabricadas profesionalmente para este propósito específico. También es importante tener en cuenta que el patrón de lesión puede diferir entre los profesionales debido a las diferencias aparentemente hora en la técnica. Limitaciones de la técnica La realización de esta técnica en una pequeña, el desarrollo de roedores requiere experiencia significativa. Si se realiza correctamente, el cirujano es capaz de provocar un patrón de lesión muy consistente a través de animales de diferentes tamaños y alcanzar una tasa de supervivencia mayor que 95%. Además, las herramientas quirúrgicas adecuadas son esenciales. Los instrumentos quirúrgicos deben estar bien mantenidos para asegurar que todas las puntas de los instrumentos se aproximan adecuadamente. Importancia de esta técnica con respecto a los métodos existentes o alternativos Mientras que la hipoxia-isquemia, o el Rice-Vannucci modelo 2 </sup&gt;, se utiliza más comúnmente para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, es importante tener en cuenta que este modelo de tMCAO es distinta de HI en que existe una isquemia focal transitoria y sin hipoxia global, seguida de una fase de reperfusión cuando el se elimina la obstrucción y el flujo sanguíneo se restaura. Esto causa una lesión más consistente y reproducible y es más clínicamente de traslación haciendo que un patrón de lesión similar a la observada en el ictus neonatal a término. Esto permite el estudio de los patrones de lesiones focales y respuestas compensatorias en el tejido sano. Las aplicaciones futuras después de dominar esta técnica Este modelo es similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en los neonatos humanos, un trombo oclusivo transitorio que se produce durante el período perinatal 11, 21. La etiología no está del todo claro y es más probable multifactorial, pero se presume en la mayoría de los casos to ser el resultado de émbolos que pasan de la placenta 11. Además, muchos recién nacidos con accidente cerebrovascular perinatal presunta menudo se presentan con la actividad convulsiva tarde o examen neurológico focal sutiles anormalidades 22. Esto hace que el uso de un modelo de lesión consistente, traslacional para identificar los mecanismos de progresión de lesiones y posibles estrategias terapéuticas cruciales.

Accidente cerebrovascular durante el período neonatal es una causa importante de muerte y discapacidad, se produce en hasta 1 de cada 2.300 nacidos vivos 1. Esto conduce a la alteración del desarrollo del sistema nervioso central y aumenta la morbilidad a largo plazo, incluyendo el aumento de la incidencia de la epilepsia, retraso mental parálisis cerebral, y otros tipos de motor o la disfunción cognitiva. Los efectos de por vida de un derrame cerebral a principios hacen modelos animales de traslación esencial para el examen de los mecanismos de lesión y reparación en esta población, incluyendo estrategias para proteger el cerebro lesionado o para potenciar la reparación. Diferentes modelos de isquemia se han utilizado para estudiar la lesión cerebral en los animales adultos, y mientras el arroz-Vannucci (Modificado Levine) 2 procedimiento se utiliza comúnmente para estudiar lesión hipóxico-isquémica en el cerebro en desarrollo, focal isquemia-reperfusión es un mecanismo distinto de la lesión causando lesiones focales, con un núcleo y penu lesionadambra y el tejido no lesionado remoto. Los modelos Koizumi 3 y 4 Longa se desarrollaron en ratas adultas para lograr oclusión de la arteria cerebral media transitoria a través de la arteria carótida común (CCA) y la arteria carótida externa (ACE), respectivamente. En ambos modelos, la ligadura permanente y cauterización de ramas de la arteria son importantes para minimizar el sangrado y para simplificar el procedimiento quirúrgico, que también causa efectos adversos sobre la capacidad del animal para alimentar y para aumentar de peso después de una lesión. Además, hay mecanismos de lesión distintas en el cerebro inmaduro y los patrones específicos de lesión visto como resultado. Más recientemente, el accidente cerebrovascular photothrombotic (prueba Rosa Bengala-) 5 y la ligadura de MCA permanente 6 se han utilizado para estudiar derrame cerebral neonatal y adulto. Tanto accidente cerebrovascular photothrombotic y la ligadura de MCA crear cambios permanentes en el flujo sanguíneo cerebral que dan lugar a una falta de reperfusion. La reperfusión es un componente crítico del desarrollo y la progresión de la lesión focal, con un aumento de la excitotoxicidad, formación de radicales libres, y la producción de óxido nítrico que conduce a la célula retardada muerte que implica las cascadas que son distintas de la fase isquémica 7 de señalización. Hipoxiaisquemia implica la ligadura de la carótida unilateral permanente seguido de hipoxia global, que también difiere de la causa del daño hipóxico-isquémica en el ser humano y no causa un patrón de lesión focal constante, por lo que el estudio del núcleo lesionado y penumbra más difícil. Hemos descrito previamente un modelo de accidente cerebrovascular por isquemia-reperfusión no hemorrágico en la rata inmadura usando oclusión de la arteria cerebral media transitoria (MCAO) 8, 9, 10. Este es un método menos invasivo que accede y ocluye la MCA a través de la arteria carótida interna sin ligati permanenteo cauterización. Esto proporciona un modelo de lesión similar a la causa más común de accidente cerebrovascular en el período perinatal 11, 12. Este modelo de isquemia-reperfusión de lesión resulta en daños en el cuerpo estriado ipsilateral y la corteza parieto-temporal. Este modelo de tMCAO también permite el control sobre la gravedad de la lesión mediante la variación de la duración de la oclusión. El examen de las vías de señalización y los cambios histológicos en el núcleo lesionado y penumbra y en el tejido ipsilateral y contralateral ileso puede aclarar aún más los mecanismos de la lesión y la reparación en el cerebro inmaduro. Este estudio demostrará este modelo de lesión importante para el cerebro en desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Isoflourane</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>anesthetic, at 3%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trinocular Surgioscope</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td>low to medium setting</td></tr><tr><td>IR Thermometer</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Retraction kit for small animals&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts for Clamp Application</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2mm cutting edge</td></tr><tr><td>Occlusion Sutures</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Agent&amp;nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0.22 mL/kg</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in p10 rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

La gravedad de la lesión causada por tMCAO es altamente dependiente de tanto el tiempo de oclusión y la experiencia del cirujano. Una oclusión de 90 min a menudo produce una leve a moderada patrón de lesión, mientras que 3 h produce una lesión de moderada a severa. Gravedad de la lesión puede ser evaluada mediante una variedad de métodos, incluyendo MRI, histología, o análisis de comportamiento a corto o largo plazo. La figura 2 muestra un ejemplo de la DW-MRI realizó 75 min en una oclusión de 90 minutos, lo que confirma la lesión isquémica que implica el hemisferio ipsilateral. formación de imágenes ponderado Difusión demuestra el aumento de la difusión en el cuerpo estriado ipsilateral y la mayoría de la corteza ipsilateral, sin cambios contralaterales, durante la fase isquémica aguda. Esto se correlaciona con un nivel moderado de lesión a largo plazo, que incluye tanto el córtex y la sustancia gris profunda. La oclusión de la MCA en los resultadosla muerte celular que se inicia en el cuerpo estriado de lesión menos grave y se desarrolla empeoramiento lesión cortical y del hipocampo para tiempos de oclusión más largos y lesión más grave. Durante la optimización de la técnica quirúrgica, tales como la determinación de la longitud de inserción de sutura, MRI es muy recomendable, ya que permite la confirmación de la colocación de sutura adecuada y visualización de edema y la progresión de lesiones durante la oclusión 14, 15, 16. Si la RM no está disponible, H &amp; E o coloración violeta de cresilo son métodos histológicos sencillo y fiable para determinar la morfología de la lesión y se pueden utilizar en ambos puntos temporales tempranos y tardíos después de la tMCAO. La Figura 3 demuestra un patrón de lesión de moderada a grave en el examen histopatológico tras un 3 h oclusión, lo que demuestra la formación de quistes y el volumen en el cuerpo estriado ipsilateral y la corteza. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"&gt; Imparcial cuantificación estereológico de secciones de cresilo-violeta-manchado para calcular la relación de ipsilateral a volumen hemisférico contralateral confirma la lesión isquémica-reperfusión ipsilateral. Específicamente, después de anestesiar al animal con Euthasol, el cerebro se cosechó mediante perfusión transcardíaca en 0,1 M PBS con 4% de paraformaldehído. Después de post-fijación durante la noche y el equilibrio en sacarosa al 30%, todo el cerebro se seccionó a 50 m intervalos, y fue seleccionado cada sección duodécima, montado, y se tiñó con violeta de cresilo 10. Incluso con lesiones leves, cambios del aparato locomotor, tales como circular y hemiparesia, se observan durante el período de oclusión. Con lesiones más graves, estos cambios persistirán después de la reperfusión. las pruebas de comportamiento adicional se puede utilizar para evaluar la gravedad de la lesión, incluyendo rotarod o cilindro pruebas de cría para la función sensomotora y el laberinto de agua de Morris parala función cognitiva 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg" /> Figura 1: Imágenes quirúrgicos en vivo de la Procedimiento tMCAO. (A) La primera hebra de sutura se enrolla alrededor de la ICA, como se detalla en el paso 1.6. (B) La primera ligadura temporal está ligada y la ICA se retrae. El segundo hilo de sutura se enrolla alrededor de la ACI, lateral a la primera hebra de sutura, como se detalla en el paso 1.9. (C) La sutura oclusión revestido de silicona se introduce en el sitio de arteriotomía, como se detalla en el paso 1,12. (D) La segunda ligadura temporal está ligada a asegurar el oclusor en su lugar, como se detalla en el paso 1,14. Barra de escala = 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg" /> Figura 2: MRI Durante OCCLderrame demuestra la adecuada Lesión unilateral. Anterior a posterior, cortes de imagen coronal de la DW-MRI, realizados durante una oclusión 90 min, demostrar una mayor difusión que implica el hemisferio ipsilateral (flechas), que es coherente con la lesión isquémica en curso en la fase aguda. Reproducido con permiso del ictus 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg" /> Figura 3: Lesión unilateral Involucrar el cuerpo estriado y la corteza a las 4 semanas siguientes tMCAO. Posterior a anterior, cresil-violeta-manchado secciones cerebrales coronales (cada uno 50 mM) cosechado de P38 animales demuestran lesión bastante grave (las flechas muestran la formación de quistes ipsilateral y redujeron cortical yvolumen estriatal) después de un 3 h tMCAO en P10. El orificio redondo en el lado izquierdo representa un identificador hemisferio contralateral. Barra de escala = 5 mm. Reproducido con permiso del Neurobiología del 12 de Enfermedades. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K vistas.  University of California, San Francisco. Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Video: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Modelo de isquemia cerebral focal por oclusión endovascular de sutura de la arteria cerebral media en la rata

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Investigación

Neurociencias

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Establecimiento del Infarto Pontino Agudo en Ratas por Estimulación Eléctrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options are limited to a small proportion of stroke patients within the first hours after stroke. Novel therapeutic strategies are being extensively investigated, especially to prolong the therapeutic time window. These current investigations include the study of important pathophysiological pathways after stroke, such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Over the last decade, there has been increasing concern about the poor reproducibility of experimental results and scientific findings among independent research groups. To overcome the so-called &#8220;replication crisis&#8221;, detailed standardized models for all procedures are urgently needed. As an effort within the &#8220;ImmunoStroke&#8221; research consortium (https://immunostroke.de/), a standardized mouse model of transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) is proposed. This model allows the complete restoration of the blood flow upon removal of the filament, simulating the therapeutic or spontaneous clot lysis that occurs in a large proportion of human strokes. The surgical procedure of this &#8220;filament&#8221; stroke model and tools for its functional analysis are demonstrated in the accompanying video.

Different models of middle cerebral artery occlusion (MCAo) are used in experimental stroke research. Here, an experimental stroke model of transient MCAo via the external carotid artery (ECA) is described, which aims to mimic human stroke, in which the cerebrovascular thrombus is removed due to spontaneous clot lysis or therapy.

Modelado del accidente cerebrovascular en ratones: oclusión transitoria de la arteria cerebral media a través de la arteria carótida externa

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

Establecimiento de un modelo transcraneal de ratones de oclusión de la arteria cerebral media

A Modified Transcranial Middle Cerebral Artery Occlusion Model to Study Stroke Outcomes in Aged Mice

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. The filament MCAO model typically exhibits a massive cerebral infarction in C57Bl/6 mice that sometimes includes brain tissue in the territory supplied by the posterior cerebral artery, which is largely due to a high incidence of posterior communicating artery atresia. This phenomenon is considered a major contributor to the high mortality rate observed in C57Bl/6 mice during long-term stroke recovery after filament MCAO. Thus, many chronic stroke studies exploit distal MCAO models. However, these models usually produce infarction only in the cortex area, and consequently, the assessment of post-stroke neurologic deficits could be a challenge. This study has established a modified transcranial MCAO model in which the MCA at the trunk is partially occluded either permanently or transiently via a small cranial window. Since the occlusion location is relatively proximal to the origin of the MCA, this model generates brain damage in both the cortex and striatum. Extensive characterization of this model has demonstrated an excellent long-term survival rate, even in aged mice, as well as readily detectable neurologic deficits. Therefore, the MCAO mouse model described here represents a valuable tool for experimental stroke research.

Autor destacado: Técnicas innovadoras y direcciones futuras en la investigación del ictus 

This protocol demonstrates a unique mouse stroke model with a medium-sized infarct and an excellent survival rate. This model allows preclinical stroke researchers to extend the ischemia duration, use aged mice, and assess long-term functional outcomes.

Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

In experimental stroke research, middle cerebral artery occlusion (MCAO) with an intraluminal filament is widely used to model ischemic stroke in mice. ...

Modelo de isquemia cerebral transitoria por oclusión de la arteria cerebral media

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies during the acute phase of ischemic stroke. To gain insights into stroke physiopathology and develop innovative therapeutic approaches, in vivo rodent models of stroke play a fundamental role. The availability of genetically modified animals has particularly propelled the use of mice as experimental stroke models.
In stroke patients, occlusion of the middle cerebral artery (MCA) is a common occurrence. Consequently, the most prevalent experimental model involves intraluminal occlusion of the MCA, a minimally invasive technique that doesn't require craniectomy. This procedure involves inserting a monofilament through the external carotid artery (ECA) and advancing it through the internal carotid artery (ICA) until it reaches the branching point of the MCA. After a 45 min arterial occlusion, the monofilament is removed to allow reperfusion. Throughout the process, cerebral blood flow is monitored to confirm the reduction during occlusion and subsequent recovery upon reperfusion. Neurological and tissue outcomes are evaluated using behavioral tests and magnetic resonance imaging (MRI) studies.

Autor destacado: Evaluación del daño isquémico del accidente cerebrovascular a través del modelo de oclusión de la arteria cerebral media 

This protocol describes the model of transient focal cerebral ischemia in mice through intraluminal occlusion of the middle cerebral artery. Additionally, examples of outcome assessment are shown using magnetic resonance imaging and behavioral tests.

Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular

Stroke stands as a major cause of death or chronic disability globally. Nevertheless, existing optimal treatments are limited to reperfusion therapies ...

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

Resumen

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Un modelo de oclusión transcraneal modificado de la arteria cerebral media para estudiar los resultados del accidente cerebrovascular en ratones ancianos

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