Este trabajo fue financiado por el cluster de excelencia de la Fundación Alemana de Investigación &quot;Munich Cluster de Sistemas de Neurología (sinergia)&quot; y por la Fundación Daimler-Benz para AL

Declaración de Ética Los experimentos descritos en este video se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales para el uso de animales de experimentación y los protocolos fueron aprobados por los comités gubernamentales alemanas (Regierung von Oberbayern, Múnich, Alemania). 10 semanas de edad, los ratones macho C57BL/6J se utilizan en este estudio. Los animales fueron alojados en condiciones de temperatura controlada (22 ± 2 ° C), con una duración del ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y acceso a los alimentos en gránulos y agua ad libitum. Analgesia y protocolos de sedación se describen como aprobado por el comité gubernamental local, pero pueden diferir de protocolos utilizados en otros laboratorios. 1. Preparación del Material y Instrumentos <ol><li> Conectar la manta de calor con el fin de mantener el área de operación de calentamiento y mantener la temperatura del cuerpo del ratón durante la anestesia (37 ° C). </li><li> Tijeras Preparar en autoclave, pinzas y algodones, dexpanthenol pomada para los ojos y el material de sutura. Preparar una jeringa con solución salina (sin aguja) para mantener el área de operación hidratado. Prepare el gas de anestesia (70% de N 2 O + 30% O 2 + isoflurano). </li><li> Inyectar analgésicos por vía intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg de buprenorfina y 0,1 mg / kg. </li><li> Coloque el ratón en la cámara de inducción con una tasa de flujo de isoflurano de 4% para anestesiar hasta movimiento espontáneo de cuerpo y vibrisas se detiene. </li><li> Transferir el ratón en la posición lateral, con su nariz en la máscara de la anestesia y mantener la concentración de isoflurano en el 4% aproximadamente un minuto, luego reducir y en approx.1.5% para mantener la anestesia adecuada. </li><li> Aplique una pomada ocular dexpantenol en ambos ojos. </li></ol> 2. Modelo MCAO distal <ol><li> Haga una incisión en la piel de 1 cm entre el oído y el ojo utilizando pequeñas tijeras de funcionamiento después de la preparación aséptica del usin del sitio quirúrgicog desinfectante de la piel. </li><li> Separar la piel y localizar el músculo temporal. </li><li> Seleccione en el generador de alta frecuencia de la función de la coagulación, el modo bipolar, seleccione 12 W y conecte las pinzas de electrocoagulación con el cable. </li><li> Añadir una gota de solución salina y el uso de los fórceps para separar el músculo temporal del cráneo en su parte apical y dorsal, de ese modo, haciendo un colgajo de músculo sin retirar totalmente el músculo. </li><li> Identificar la MCA por debajo del cráneo transparente, en la parte rostral de la zona temporal, dorsal al seno retro-orbital (Figura 2A). Si la bifurcación MCA no es visible (debido a una variación normal anatómica) identificar el recipiente más rostral. </li><li> Agregue un poco de solución salina en el cráneo y disipe el hueso con la broca justo encima de la rama MCA hasta que tenga una textura fina y translúcida (Figura 2B). </li><li> Retirar con cuidado el hueso por encima de la arteria con un muy delgadas fórceps. </li><li> Seleccione el modo bipolar in el generador de frecuencia alta a 7 W. Coagulate la arteria con la electrocoagulación fórceps proximal y distal a la bifurcación (Figura 2C). Cuando la bifurcación no es visible debido a una variante anatómica, coagular la rama MCA correctamente identificados (véase más arriba) en dos sitios de aprox. Distancia de 1 mm. No es necesario para comprender la arteria con las pinzas para la coagulación, tocar la arteria cuidadosamente con las pinzas en ambos lados desde arriba es suficiente e induce menos daño mecánico. </li><li> Espere 30 segundos y toque suavemente la arteria con una pinza de punta roma para comprobar si hay flujo sanguíneo debido a la recanalización espontánea. En caso de recanalización repetir la electrocoagulación una vez. </li><li> Cambie la ubicación del músculo temporal a su posición, cubriendo el agujero de trépano. </li><li> La sutura de la herida y colocar al animal en una caja de enfermería a los 32 ° C para recuperarse de la anestesia y devolverlo a la jaula. En general se tarda 5-10 min para el animal pueda recuperarse de AnesthEIAS. </li><li> Inyectar la analgesia postoperatoria (ip) después de 24 horas y luego todos los días hasta el quinto día del postoperatorio: Carprofeno 4 mg / kg. </li></ol> 3. Sham Operación Realice todos los procedimientos de forma idéntica a la operación descrita anteriormente - incluyendo adelgazamiento de la calavera y su eliminación - a excepción de no coagular la arteria expuesta. 4. Prueba del cilindro 13 <ol><li> Colocar el animal en un cilindro de acrílico transparente de vidrio (diámetro: 8 cm, altura: 25 cm) delante de dos espejos y cintas de vídeo de 5 min. Ajuste la cámara en el centro delante de los dos espejos y el cilindro para obtener un vídeo (Figura 3A) óptima. </li><li> Para la evaluación del uso de la extremidad anterior independiente, la puntuación (1) contacto de la pared del cilindro con una extremidad anterior durante trasera completa y (2) el aterrizaje con una sola extremidad anterior en el piso después de trasero completo. Contar al menos 20 contactos para una extremidad anterior utilizando la cámara lenta o cuadro por frfunción ame del Video Client Lan (VLC) software freeware ( <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ). </li><li> Para el análisis de la línea de base antes de la cirugía: realizar la prueba dos veces por ratón, con un descanso de 1 hora entre los ensayos. Uso de la extremidad anterior se expresa como una proporción de la derecha / izquierda caras, el uso de la extremidad anterior independiente. </li><li> Después de la coagulación MCA: realice la prueba de nuevo dos veces por ratón, con un descanso de 1 hora entre los ensayos, como se indica más arriba. </li></ol> 5. Perfusión <ol><li> Anestesiar los animales (por ejemplo, por la ketamina y xilazina 120/16 mg / kg de peso corporal, respectivamente). </li><li> Fijar el animal en posición supina y abrir la cavidad abdominal con un corte de la mediana. Retire rasgaduras y esternón. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha. Insertar una cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y perfundir lentamente con 20 ml de solución salina. </li><li> Decapitar al animal, abrir la bóveda craneal y retire suavemente el cerebro de la base del cráneo. </li><li&gt; Congelar los cerebros en -40 ° C isopentano frío durante 10 min. Después retire los cerebros del isopentano y almacenar hasta nuevo análisis a -80 ° C. </li></ol> 6. Infarto Volumetría <ol><li> Cryosectioning: Corte los cerebros en serie en un criostato a 20 micras de espesor secciones cada 400 m en las diapositivas y las diapositivas almacenar a -20 ° C. </li><li> Cresil violeta (CV) tinción: <ol><li> Preparar la solución de tinción: Mezclar 0,5 g de acetato de CV en 500 ml de H 2 O. Agitar y calentar (60 ° C) hasta que se disuelven los cristales. Deje enfriar la solución y lo guarde en un frasco oscuro. Vuelva a calentar a 60 ° C y el filtro antes de cada uso. </li><li> Secar los portaobjetos a TA durante 30 min. Luego colocarlos en etanol al 95% durante 15 min y luego en etanol al 70% durante 1 min y después en etanol al 50% durante 1 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en agua destilada durante 2 min, refrescar el agua destilada y el lugar en durante 1 min. Luego coloque los portaobjetos en solución de tinción (60 ° C) fo 10 minutos y lavar dos veces en agua destilada durante 1 min. </li><li> Colocar los portaobjetos en etanol al 95% durante 2 min. Luego colocarlos en etanol al 100% durante 5 min, actualice el 100% de etanol y colocarlos en durante 2 min. Luego cubrir los portaobjetos con medio de montaje. </li><li> Análisis: Escanear las diapositivas y analizar el volumen de infarto indirecta por el método Swanson 14 para corregir el edema: (Área isquémica) = (área de la corteza del lado contralateral) - (área de la corteza no isquémica del lado ipsilateral) (Figura 4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke.">Stroke.</a> Lancet. 371, 1612-1623 (2008).</li><li>Di Carlo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+stroke+in+Europe:+A+collaborative+study+of+population-based+cohorts.+ILSA+Working+Group+and+the+Neurologic+Diseases+in+the+Elderly+Research+Group.+Italian+Longitudinal+Study+on+Aging.">Frequency of stroke in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. ILSA Working Group and the Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Italian Longitudinal Study on Aging.</a> Neurology. 54, 28-33 (2000).</li><li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombolysis+with+alteplase+3+to+4.5+hours+after+acute+ischemic+stroke.">Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1317-1329 (2008).</li><li>Jauch, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+early+management+of+patients+with+acute+ischemic+stroke:+a+guideline+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association/American+Stroke+Association.">Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44, 870-947 (2013).</li><li>Longa, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li><li>Engel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model.">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rat+model+of+thrombotic+focal+cerebral+ischemia.">A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 123-135 (1997).</li><li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li><li>Chen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat:+reproducible+extensive+cortical+infarction.">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li><li>Tureyen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia:+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques.">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li><li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+of+focal+stroke:+size,+mechanism,+and+purpose.">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li><li>Howells, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+strokes+for+different+folks:+the+rich+diversity+of+animal+models+of+focal+cerebral+ischemia.">Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).</li><li>Schallert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke,+cortical+ablation,+parkinsonism+and+spinal+cord+injury.">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li><li>Swanson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+method+for+measuring+brain+infarct+volume.">A semiautomated method for measuring brain infarct volume.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 290-293 (1990).</li><li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain.">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1108-1128 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intravenous+recombinant+tissue+plasminogen+activator+on+ischemic+stroke+lesion+size+measured+by+computed+tomography.+NINDS;+The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+(NINDS)+rt-PA+Stroke+Study+Group.">Effect of intravenous recombinant tissue plasminogen activator on ischemic stroke lesion size measured by computed tomography. NINDS; The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) rt-PA Stroke Study Group.</a> Stroke. 31, 2912-2919 (2000).</li><li>Sowell, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cortical+change+across+the+human+life+span.">Mapping cortical change across the human life span.</a> Nat. Neurosci. 6, 309-315 (2003).</li><li>Brott, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+acute+cerebral+infarction:+lesion+size+by+computed+tomography.">Measurements of acute cerebral infarction: lesion size by computed tomography.</a> Stroke. 20, 871-875 (1989).</li><li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant'+middle+cerebral+artery+territory+infarction:+clinical+course+and+prognostic+signs.">Malignant' middle cerebral artery territory infarction: clinical course and prognostic signs.</a> Arch. Neurol. 53, 309-315 (1996).</li><li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains.">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31, 2707-2714 (2000).</li><li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+regulatory+T+cells+limits+neuroinflammation+in+permanent+cortical+stroke.">Boosting regulatory T cells limits neuroinflammation in permanent cortical stroke.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17350-17362 (2013).</li><li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lymphocyte+trafficking+shields+the+brain+against+deleterious+neuroinflammation+after+stroke.">Inhibition of lymphocyte trafficking shields the brain against deleterious neuroinflammation after stroke.</a> Brain. 134, 704-720 (2011).</li><li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotarod+suitable+for+quantitative+measurements+of+motor+incoordination+in+naive+mice.">A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 259, 211 (1968).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia.">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38, 2771-2778 (2007).</li><li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+(Mus+musculus)+after+a+focal+motor+cortex+stroke.">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33, 1869-1875 (2002).</li><li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke:+a+review+of+cerebral+angiography+studies.">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Arch. Neurol. 59, 1870-1873 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen intereses en conflicto a revelar.

El presente protocolo describe el modelo de accidente cerebrovascular experimental de distal, MCAO permanente mediante electrocoagulación transcraneal - el llamado &quot;modelo de coagulación&quot;. Este modelo se ha convertido mientras tanto en uno de los modelos animales utilizados con mayor frecuencia en la investigación experimental de carrera 12. En comparación con otros modelos de isquemia focal cerebral, el modelo de coagulación tal como se presenta en este video tiene la ventaja de un tiempo de funcionamiento muy corto de aproximadamente 10 minutos cuando se lleva a cabo por un científico entrenado. Por lo tanto, los tiempos de anestesia breves pueden ser alcanzados en este modelo, que es una característica favorable de un modelo de accidente cerebrovascular experimental debido a que el impacto de los anestésicos en la neuroprotección y accidente cerebrovascular resultado es bien conocido-15. Por otra parte, como se ha descrito previamente por Carmichael et al. 11, que corroboran que el volumen del infarto resultante y después de la localización distal de coagulación permanente MCA corresponde a lesiones cerebrales isquémicas en la mayoría de los humanosaccidentes cerebrovasculares en proporción con el tamaño del cerebro. Derrame cerebral humana es en general de pequeño tamaño, con lesiones de aproximadamente 5 a 15% del hemisferio, con base en estudios de población anteriores y los ensayos clínicos por imágenes de 16-18, en contraste con las lesiones de accidente cerebrovascular extensas con edema cerebral a la compresión que se producen en menos del 10% de trazos clínica 19. De esta manera, las lesiones de accidente cerebrovascular en el territorio de la ACM de alrededor del 12% del hemisferio alcanzado por el modelo presentado puede ser considerado como un volumen de movimiento translacional relevante. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que diferentes cepas de ratón o protocolos de anestesia utilizados podrían afectar el volumen 20 de la lesión resultante. La mortalidad durante el período de observación después de la carrera de admisión en este modelo está prácticamente ausente. La mortalidad global de menos del 5% se compone principalmente de las muertes durante la operación debido a complicaciones anestésicas o sacrificio, porque llegar a los criterios de exclusión. Con el fin de justificar la baja variability de este modelo y su excelente reproducibilidad, sugerimos los siguientes criterios de exclusión: 1) Cualquier hemorragia subaracnoidea durante la operación. 2) El tiempo de funcionamiento más de 15 min. 3) La recanalización de la ACM después de dos intentos de electrocoagulación con sólo MCAO transitoria. Además, los animales deben ser examinados todos los días después de MCAO (comportamiento fisiológico básico, la apariencia de la piel y el peso corporal) para controlar el dolor, incomodidad o comportamiento de la enfermedad. Varias medidas podrían aplicarse para el análisis de los resultados de carrera como medida de moteado láser, la resonancia magnética, pruebas de comportamiento o el análisis histológico. En este protocolo proporcionamos ejemplos de métodos para el análisis de comportamiento y análisis de volumen de infarto. Varios de prueba para el análisis del comportamiento después de la isquemia cerebral focal se han desarrollado y utilizado en la investigación experimental accidente cerebrovascular. Pruebas adecuadas para la disfunción sensoriomotora utilizado anteriormente por nuestro grupo en este modelo de carrera que 21,22re la prueba de Rotarod 23, prueba de Etiqueta adhesiva 24, la prueba de la esquina 25 y la prueba del cilindro 13, que se demuestra en este vídeo. La prueba del cilindro representa consistentemente asimetría de motor en la fase aguda tras distal de la MCAO permanente y también detecta recuperan consecutivo de la función motora. A pesar de las evidentes ventajas, algunas limitaciones de este modelo de carrera tienen que ser tomadas en cuenta. En primer lugar, se necesita una trepanación del cráneo con el fin de coagular la arteria, produciendo de este modo un acceso potencial de infecciones peri-operativos del cerebro, aunque las infecciones bacterianas de la herida quirúrgica, músculo temporal o el cerebro en sí nunca han sido detectados por nosotros mismos o documentada por los demás utilizando este modelo. Por otra parte, el daño mecánico a la corteza durante la preparación y la coagulación no se puede excluir, pero puede ser limitado por cuidado de perforación y extracción del cráneo, humidificación constante de la zona quirúrgica y NE mínimo<html> electrocoagulación cessary (ver criterios de exclusión). Aunque el curso de la MCA como se representa en la Figura 2 se encuentra en la mayoría de los ratones C57BL / 6, se describe en el protocolo de la forma de proceder en las variaciones normales de la rumbo del buque para reducir al mínimo la variabilidad del modelo. Por otra parte, se sugiere el uso de múltiples (3 en el caso de bifurcación; 2 sin bifurcación de los MCA) sitios de oclusión para minimizar el riesgo de recanalización parcial de la MCA, que en nuestra experiencia es un factor importante para la variabilidad de este modelo. En términos de las pruebas de comportamiento, sólo déficits de comportamiento de menor importancia pueden ser detectados en las pruebas de comportamiento mencionados anteriormente-y regeneración funcional se pueden observar dentro de la primera semana después del accidente cerebrovascular. Por lo tanto, los sistemas de prueba más avanzados con mayor sensibilidad y parámetros de ensayo cualitativos como la prueba de alcanzar experto 27 podría ser más adecuado para detectar el resultado funcional a largo plazo en este modelo. ONTENIDO &quot;&gt; Finalmente, debido a la coagulación permanente de la MCA sin reperfusión se puede conseguir, que es una característica observada en un porcentaje sustancial de pacientes con accidente cerebrovascular debido a la lisis del coágulo espontánea o terapia 28. Sin embargo, un modelo de accidente cerebrovascular tromboembólico se ha descrito previamente 26 proporciona la opción por un modelo de carrera de cortesía con la reperfusión de la isquemia cerebral cortical. Tomados en conjunto, la alta reproducibilidad, la posible observación a largo plazo debido a la mortalidad mínima y el volumen del infarto en relación comparable y localización en los infartos humano distinguir el &quot;modelo de la coagulación&quot; como un modelo valioso para la investigación básica y traslacional accidente cerebrovascular.

El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de muerte y una de las principales razones de discapacidad en los adultos adquirida en los países desarrollados 1. Aproximadamente el 80% de esta enfermedad neurológica aguda es causada por la isquemia cerebral resultante de una obstrucción del flujo sanguíneo cerebral mientras que alrededor del 15% son causados ​​por una hemorragia intracerebral 2. A pesar de las investigaciones en curso, la administración intravenosa de activador tisular del plasminógeno es el único tratamiento farmacológico aprobado para el accidente cerebrovascular isquémico hasta ahora y sólo están disponibles para una minoría de pacientes con accidente cerebrovascular debido a la ventana de tiempo corto aprobado de 4,5 horas después del accidente cerebrovascular inicio 3,4. Dado que no existen modelos in vitro, que pueden modelar adecuadamente las complejas interacciones entre el cerebro, los vasos y los mecanismos fisiopatológicos sistémicos durante tiempos, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular preclínica. Por lo tanto, varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico se han desarrollado en una variabledad de especies. Uno de los modelos de accidente cerebrovascular más comúnmente utilizado es el &quot;modelo de filamento&quot;, donde un filamento de sutura se introduce transitoriamente en la arteria carótida interna y se envía hasta que la punta ocluye el origen de la arteria cerebral media (MCA), que resulta en una parada del flujo de sangre y el infarto cerebral posterior también regiones corticales subcorticales y en caso de oclusión prolongada 5,6. En modelos photothrombotic de accidente cerebrovascular isquémico, una oclusión fotoquímica del buque cortical irradiado se consigue después de la inyección de un fotosensibilizador que resulta en lesiones pequeñas, circunscritos localmente 7. La oclusión permanente de la MCA distal de las arterias lenticulostriatal se puede lograr mediante una ligadura de la arteria, su compresión transitoria o por 8,9 coagulación permanente. El infarto que resulta en este modelo afecta principalmente la neocorteza 10 debido a que la oclusión de la MCA en este modelo es distal a la lénticosarterias ulostriatal, que abastecen a los ganglios basales. Dado que la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humanos se encuentran en el territorio de la arteria cerebral media, todos los modelos de accidente cerebrovascular comunes parecen oclusiones de la ACM o una de sus ramas 11. El MCA es una de las principales arterias que proporciona suministro de sangre al cerebro; que nace de la arteria carótida interna, rutas a lo largo del surco lateral donde se ramifica y proyectos a los ganglios basales y las superficies laterales de los lóbulos frontal, parietal y lóbulos temporales, incluyendo el motor principal y la corteza sensorial. La derecha y la izquierda MCA se conectan a las arterias cerebrales anteriores y arterias comunicantes posteriores, que se conectan a las arterias cerebrales posteriores, creando el Círculo de Willis (Figura 1). Como se informó anteriormente por Carmichael et al. 11, infartos modelados por el Ar cerebral media distalmodelo de batería de oclusión (MCAO) en ratones abarcan alrededor del 10-15% del hemisferio, imitando así la mayoría de las lesiones de accidente cerebrovascular humanos que se encuentran en el territorio de la ACM cortical 11,12. En 1981, Tamura et al. Describe un modelo de coagulación transcraneal permanente, MCAO en ratas 8. Sin embargo, el modelo descrito por Tamura implicó una oclusión proximal de la MCA con el fin de eludir la bifurcación más distal de la arteria. Por lo tanto, el &quot;modelo de Tamura&quot; original induce no sólo las lesiones corticales, sino también del cuerpo estriado, similares a las lesiones obtenidos por el &quot;modelo de filamento&quot; 6. Aquí se describe el modelo de MCAO distal permanente mediante electrocoagulación transcraneal en ratones. Adicionalmente, informamos histológica relacionada y métodos funcionales para analizar el resultado del accidente cerebrovascular en este modelo. Todos los métodos se basan en los procedimientos operativos estándar desarrollados y utilizados en nuestros laboratorios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Camera Canon Eos 500D</td>
			<td style="width:224px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:324px;">optics: 18-55 mm; 30 fps; 640x480 video function</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Mirror</td>
			<td style="width:224px;">Kristallform</td>
			<td style="width:119px;">2677089</td>
			<td>30x30 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Transparent acrylic glass cylinder</td>
			<td style="width:224px;">H&#38;S Kunststofftechnik</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>diameter: 8 cm,&#160; height: 25 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Heating blanket</td>
			<td>FHC DC Temperature Controller</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Mayor Scissors</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">1410-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Forceps</td>
			<td style="width:224px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11616-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cotons</td>
			<td style="width:224px;">NOBA Verbondmitel Danz</td>
			<td style="width:119px;">974116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Saline solution</td>
			<td style="width:224px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">131321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Bepanthen pomade</td>
			<td style="width:224px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:224px;">Abbot</td>
			<td style="width:119px;">B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anesthesia system for isoflurane</td>
			<td>Drager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Stereomikroskop&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Electrosurgical device</td>
			<td colspan="2">ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&#228;t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Drill</td>
			<td style="width:224px;">Proxxon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D-34343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ketamine</td>
			<td style="width:224px;">Inresa Arzneimittel GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Xylacine</td>
			<td style="width:224px;">Albrecht</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml Syringe&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phosphate Buffered Saline PH: 7,4</td>
			<td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td>
			<td style="width:119px;">P32799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isopentane</td>
			<td style="width:224px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">59070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cryostat</td>
			<td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Cresyl violet</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ethanol 70%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td>521005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Ethanol 96%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td>522078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 99%</td>
			<td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td>
			<td style="width:119px;">ETO-5000-99-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Roti-Histokit mounting medium</td>
			<td style="width:224px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">6638.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">C57Bl/6J mice</td>
			<td style="width:224px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery

El accidente cerebrovascular es la tercera causa más común de muerte y la principal causa de discapacidad en los adultos adquirida en los países desarrollados. Opciones terapéuticas muy limitadas están disponibles para una pequeña proporción de los pacientes con ictus en fase aguda. La investigación actual está intensamente buscando nuevas estrategias terapéuticas y se está centrando cada vez más en la fase subaguda y crónica después del accidente cerebrovascular debido a que más pacientes podrían ser elegibles para las intervenciones terapéuticas en una ventana de tiempo prolongado. Estos mecanismos incluyen retraso importantes vías fisiopatológicas como la inflamación post-accidente cerebrovascular, la angiogénesis, la plasticidad neuronal y la regeneración. Para analizar estos mecanismos y evaluar posteriormente nuevos objetivos farmacológicos, se buscan modelos experimentales de accidente cerebrovascular con relevancia clínica, baja mortalidad y una alta reproducibilidad después. Por otra parte, los ratones son los mamíferos más pequeños en los que una lesión derrame cerebral focal puede ser inducido y para los que un amplio espectro de modelos transgénicos sedisponible. Por lo tanto, se describe aquí el modelo de ratón de transcraneal, coagulación permanente de la arteria cerebral media a través de electrocoagulación distal de las arterias lenticulostriatal, el llamado &quot;modelo de coagulación&quot;. El infarto que resulta en este modelo se encuentra principalmente en la corteza; el volumen de infarto relativa en relación con el tamaño del cerebro corresponde a la mayoría de los accidentes cerebrovasculares humanos. Por otra parte, el modelo cumple los criterios antes mencionados de la reproducibilidad y baja mortalidad. En este video se demuestra los métodos quirúrgicos de carrera de admisión en el &quot;modelo de la coagulación&quot; y presenta herramientas de análisis histológicos y funcionales.

Debido al corto tiempo y moderada daño cerebral anestesia, aproximadamente 10 min después de la transferencia a sus jaulas de todos los animales estaban despiertos, moviéndose libremente en la jaula y la interacción con compañeros de camada. La mortalidad durante la cirugía MCAO fue inferior al 5%, principalmente como resultado de una hemorragia subaracnoidea o anestesia incorrecta. La mortalidad durante el tiempo de observación 7 días después de la carrera de admisión se produce muy raramente en aproximadamente el 1-2% de los animales. En la serie de funcionamiento de 10 animales para este informe a todos los animales sobrevivieron a la operación y el período de observación de 7 días, ninguno de ellos tuvo que ser excluido debido a los criterios de exclusión. Déficits de comportamiento después de MCA coagulación fueron evaluadas por la prueba del cilindro uso pata 13 analizar la asimetría. En esta prueba, la relación de uso pata delantera izquierda y derecha independientes se mide en los puntos de tiempo indicados después de la carrera de inducción y se comparó con los valores de referencia obtenidos 24h antes de la MCAO (Figura 3B). Los animales presentaron un cambio significativo en el uso extremidad asimetría para la exploración de pared combinado en el cilindro de ensayo de 24 horas (1,72 ± 0,326, p &lt;0,05) y de 3 días (1,36 ± 0,17, p &lt;0,05) después de la MCAO. Aunque la relación mejoró durante la 1 semana de tiempo de observación, la asimetría del motor era todavía significativa 7 días después de la MCAO (1,35 ± 0,29, p &lt;0,05) en comparación con los valores basales. Se realizó volumetría del infarto utilizando secciones del cerebro coronales seriadas cresil violeta manchado 7 días después del golpe de inducción (Figura 4 B). La media de volumen del infarto fue de 15,4 mm 3, con lo que representa el 12% de un hemisferio cerebral (Figura 4C). La variabilidad de este modelo de accidente cerebrovascular es excepcionalmente bajo con una desviación estándar de aproximadamente 10%. El área de la lesión abarca el somatosensorial y la corteza motora con la menor afección de las estructuras subcorticales. Por otra parte, la localización del infartoárea es muy predecible con sólo la variabilidad mínima como se muestra en el diagrama de distribución esquemático (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representación esquemática del polígono de Willis. El círculo arterial de Willis está formado por las arterias cerebral media (MCA) y las arterias cerebrales anteriores (ACA) que se ramifican desde la arteria carótida interna (ACI), así como por la arterias cerebrales posteriores (ACP) y la arterias comunicantes posteriores (PComA). El MCA se ejecuta en el surco lateral donde se bifurca a la corteza cerebral. La rama MCA dominante suministrar la mayor parte de la corteza motora y parte de la corteza somatosensorial se ocluye de forma permanente por el modelo demostrado (arteria comunicante Acoma = anterior; BA = arteria basilar; Suca = cerebel Superiorarteria lar). <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Vista transcraneal después de la eliminación del músculo temporal y vista esquemática de oclusión de la MCA. (A) Después de quitar el músculo temporal las arterias corticales pueden ser vistos a través del cráneo del ratón parcialmente translúcida (en ratones de 8-12 semanas de edad). La rama dominante MCA puede ser identificado en la parte rostral de la vista temporal, así como otras arterias corticales se ramifican desde el MCA y el PCA en la parte caudal. (B) Representación esquemática de la rama MCA dominante en su variante predominante con una bifurcación en la corteza temporal lateral después de la perforación de un agujero de trépano y la eliminación del cráneo. (C) Los cuadrados negros representan los sitios de coagulación MCA en proximales y distales de los lados de la bifurcación. Figura 3. Análisis de los déficit de comportamiento. (A) la configuración de prueba del cilindro: el ratón se coloca en un cilindro vertical y espejos se colocan detrás para registrar todos los movimientos utilizando una cámara de video (B) el uso Miembro Anterior asimetría se analizó mediante la prueba de cilindro.. Relaciones de izquierda / derecha del uso de la extremidad anterior independiente se calcularon 24 hr antes MCAO y en los puntos de tiempo indicados después del accidente cerebrovascular de inducción. N = 10, * p &lt;0,05 entre el punto de tiempo indicado y de referencia (control) de valor. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Volumétrico análisis del infarto y resultado del infarto después de MCAO distal. (A) Imagen representativa de una cresil violeta manchado sujetador coronalen la sección 7 días después de MCAO. La línea amarilla indica la selección de la corteza contralateral (derecho) y la línea roja es la selección de la corteza no infartada (manchado) del cerebro ipsilateral. El área pálida en el hemisferio izquierdo representa el área de tejido infartado. (B) el análisis del volumen del infarto de 10 cerebros (cada punto representando un cerebro individual) las 24 horas, 3 días y 7 días después de la coagulación MCA distal. La línea roja horizontal representa la media, las barras de error indican la desviación estándar. (C) Representante violeta de cresilo teñidas secciones cerebrales coronales cada 400 micras, con 7 días después de la MCA coagulación. (D) de distribución esquemática del tejido cerebral infartado 7 días después de la MCAO. Cada diapositiva muestra la información acumulada de la distribución del infarto (código de color, como se indica) en la sección dada en relación con el bregma (imagen modificada a partir de:. Liesz A et al, Brain, 2011; con permiso de Oxford University Press). &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

modeling-stroke-mice-permanent-coagulation-distal-middle-cerebral

Research

JoVE Journal

Medicine

36.6K vistas.  University Hospital Munich.  Varios modelos murinos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) son ampliamente utilizados en la investigación experimental cerebro. Aquí, nos demuestran el modelo de transcraneal permanente MCAO distal que produce infarto cortical consistente de un tamaño correspondiente a los daños impuesta por la mayoría de los accidentes cerebrovasculares isquémicos humanos. 

Video: Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Investigación

Medicina

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminal la arteria cerebral media de oclusión (MCAO) Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en ratones

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

La endotelina-1 inducida por la arteria cerebral media oclusión Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Arteria embólico cerebral media oclusión (MCAO) para el ictus isquémico con homólogas coágulos de sangre en las ratas

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Realización Permanente distal cerebral media carótida común con oclusión de la arteria en ratas de edad avanzada para el Estudio de la isquemia cortical con sostenida de la discapacidad

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...