Part of this work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (C) from the Japanese Society for the Promotion of Science (25350520, 22500401, 15K06105) and the US-ARMY ITC-PAC Research and Development Project (FA5209-15-P-0175).

cuidado de los animales, la preparación y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Tokio de Agricultura y Tecnología. Por esta metodología, la rata se encuentra en un ambiente controlado (24 ° C, 12 h ciclo de luz / oscuridad), con comida y agua disponible ad libitum. 1. Construcción de un sistema convencional de reflectancia de imágenes multiespectrales difusa <ol><li> Monte nueve filtros de interferencia óptica de banda estrecha con longitudes de onda centrales de 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, y 760 nm para los orificios de filtro de la rueda de filtros motorizada. </li><li> Construir un sistema de imagen multiespectral utilizando una fuente de luz blanca de banda ancha, una rueda de filtros motorizada con el anterior conjunto de filtros de interferencia de banda estrecha, una guía de luz, una lente colectora, una lente de zoom de vídeo, y una cámara CCD monocromática. La disposición de los componentes ópticos, que se muestran en la Figura 2, se puede hacer referencia a para el thes el procedimiento de construcción. NOTA: El ángulo de iluminación es de aproximadamente 45 ° con respecto a la superficie de la muestra. </li><li> A su vez en la fuente de luz de la lámpara de halógeno para iluminar la superficie de la muestra a través de un filtro de interferencia, la guía de luz, y la lente colectora. </li><li> Abra el software de funcionamiento de la cámara CCD. </li></ol> 2. Preparación de los animales NOTA: En este protocolo, la rata no se usó para los experimentos futuros y se sacrificó inmediatamente después de las mediciones de imágenes multiespectrales. <ol><li> Conectar el puerto de entrada de una cámara de inducción al orificio de salida de una máquina de anestesia con un tubo. Conectar el puerto de salida de la cámara de inducción al puerto de entrada de la máquina de anestesia con un segundo tubo. </li><li> Coloque la rata en la cámara de inducción y inducir la anestesia con 5,0% de isoflurano. Mantener la anestesia a una profundidad tal que la rata no responde a pellizcos del dedo del pie. LA 2,0% de isoflurano utilizando un botón giratorio en la máquina de anestesia. </li><li> Fijar la cabeza de la rata en un marco estereotáxico. Conecte una boquilla para anestesia al marco estereotáxico. </li><li> Conecte el orificio de entrada de la boquilla al orificio de salida de la máquina de anestesia con un tubo. Conecte el orificio de salida de la boquilla al orificio de entrada de la máquina de anestesia con un tubo. </li><li> Afeitar la región de la cabeza más allá del sitio de la incisión prospectivo utilizando cortadoras de pelo hasta que aparezca la superficie de la piel. </li><li> Hacer una incisión longitudinal de aproximadamente 20 mm de largo a lo largo de la línea media de la cabeza usando un bisturí quirúrgico ( Figura 1 (a) ) y exponer los tejidos conectivos subcutáneos ( Figura 1 (b) ). </li><li> Retire los tejidos conectivos subcutáneos usando una cureta afilada o una pinza y tire de ella a ambos lados de la cabeza para exponer el hueso del cráneo ( Figura 1 (c) ). </li><li> Cavar una zanja elipsoidal en el hueso del cráneo dentro del sutur cranealES (sutura coronal, sutura sagital, y de sutura lamboidea) usando un taladro de alta velocidad (Figura 1 (d)). </li><li> Poco a poco y de forma homogénea excavar el hueso del cráneo dentro de la zanja usando el taladro de alta velocidad. </li><li> Presione ligeramente en la superficie del cráneo adelgazada con la punta de la pinza para estimar el espesor y la resistencia ósea después de que aparezca un vaso sanguíneo cerebral. Si la región cráneo adelgazada deprime fácilmente, terminar la reducción del hueso del cráneo con el taladro de alta velocidad. </li><li> Cortar la línea frontera elipsoidal del cráneo adelgazada poco a poco usando la punta de la pinza o pequeñas tijeras quirúrgicas. </li><li> Retire el cráneo adelgazado desde la superficie del cerebro lenta y suavemente utilizando la pinza. </li><li> bañarse suavemente la ventana craneal con solución salina fisiológica y se cubre con una placa de vidrio transparente de aproximadamente 0,1 mm de espesor. </li></ol> 3. Regulación de la fracción de oxígeno inspirado NOTA: La condi respiratoriación se puede cambiar mediante la regulación de la fracción de oxígeno inspirado (FiO 2). <ol><li> Uso de un tubo, conectar el primer puerto de un conector de tubo en forma de Y (conector 1) al primer puerto de otro conector de tubo en forma de Y (conector 2). </li><li> Conectar el puerto de entrada de la boquilla al segundo puerto de conector de tubo 1. </li><li> El uso de un tubo, conecte el tercer puerto de conector de tubo 1 a un dispositivo de monitor de concentración de oxígeno. </li><li> Con un tubo, conectar el segundo puerto de conector de tubo 2 al orificio de salida de una máquina de anestesia. </li><li> El uso de un tubo, conecte el tercer puerto de conector de tubo 2 al orificio de salida de un dispositivo de mezcla de gas. </li><li> Conectar un puerto de entrada del dispositivo de mezcla de gas a una alta presión 95% O 2 - 5% de CO 2 cilindro de gas usando un tubo. </li><li> Conectar el otro puerto de entrada del dispositivo de mezcla de gas a un 2 de alta presión 95% N - cilindro de gas CO 2 al 5% utilizando un tubo. </li><li> Cambiar las velocidades de flujo de gas of O 2 y N 2 usando los botones giratorios en el dispositivo de mezcla de gas. </li><li> Comprobar y regular la FiO 2 utilizando el dispositivo de monitor de concentración de oxígeno. </li></ol> 4. Adquisición de la reflectancia difusa imágenes multiespectrales <ol><li> Adquisición de imágenes de referencia NOTA: Los componentes ópticos utilizados en este experimento, tales como la fuente de luz, fibra óptica, y los detectores tienen sus propias características espectrales. Por lo tanto, la intensidad de la luz pasa a través de estos componentes debe ser registrada como imagen de referencia. La imagen de referencia es una imagen tomada con un difusor blanco estándar iluminado con la luz de la fuente de luz. <ol><li> Ponga el difusor blanco estándar en el escenario horizontalmente. </li><li> Enfoque la lente de la cámara en la superficie del difusor blanco girando el anillo de zoom del barril. </li><li> Ajustar el tiempo de integración de la cámara, seleccione el valor apropiado de laEn la lista desplegable de tiempos de integración en el software de funcionamiento de la cámara de manera que la mayor cantidad de luz que produce una señal que es aproximadamente el 75% de los recuentos máximos. Mientras observa el histograma de valores de pixel, ajustar el tiempo de integración hasta que el nivel de intensidad de la señal es de aproximadamente 75% de los recuentos máximos. </li><li> Seleccionar la opción &quot;Guardar&quot; en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo. </li><li> Cambiar la ubicación del filtro mediante la rotación de la rueda de filtros. </li><li> Guardar una imagen en las otras longitudes de onda de acuerdo con el proceso descrito anteriormente. El nombre del archivo debe identificar la muestra y la longitud de onda utilizada (por ejemplo, W500, W520, W540 W760 ...). </li></ol></li><li> Adquisición de imágenes de muestra Nota: Las imágenes de la intensidad de la luz reflejada de forma difusa de cerebro de rata expuestos en nueve longitudes de onda son capturados y guardados en el disco duro de un ordenador personal usando las mismas condiciones de adquisición. <ol><li> Con cuidado, coloque el ren la etapa y lentamente ajustar el nivel de escenario para que la cámara puede enfocar en la superficie del cerebro de la rata. </li><li> Seleccionar la opción &quot;Guardar&quot; en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo. </li><li> Cambiar la ubicación del filtro mediante la rotación de la rueda de filtros. </li><li> Guardar una imagen en las otras longitudes de onda de acuerdo con el proceso descrito anteriormente. El nombre del archivo debe identificar la muestra y la longitud de onda (por ejemplo, R500, R520, R540 R760 ...). </li></ol></li><li> Adquisición de las imágenes oscuras NOTA: La cámara CCD puede generar una intensidad de luz en respuesta a una señal eléctrica. Sin embargo, hay algo de producción de menor importancia debido al ruido en los circuitos eléctricos y los detectores, incluso si la luz no entra al detector; esto se llama ruido de corriente oscura. Para medir con precisión la intensidad espectral de la luz, el componente de corriente oscura debe ser registrada como una imagen oscura y luego se resta de la señal medida. La imagen oscura es una toma de imagenn con la trayectoria de luz bloqueado. <ol><li> Apagar la fuente de luz de la lámpara de halógeno. </li><li> Bloquear el paso de luz al sistema de cámara CCD usando una placa de protección. </li><li> Seleccionar la opción &quot;Guardar&quot; en el menú archivo para guardar una imagen en un archivo. El nombre del archivo debe identificar la muestra (por ejemplo, oscuro). </li></ol></li></ol> 5. La visualización del contenido de hemoglobina y de la dispersión de luz Parámetro NOTA: Un conjunto de imágenes multiespectrales de reflectancia difusa se guarda en el disco duro de un ordenador personal y analizada fuera de línea. Un análisis de regresión múltiple con la ayuda de una simulación de Monte Carlo 19 de las imágenes de reflectancia difusa multiespectrales en nueve longitudes de onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, y 760 nm) se realiza a continuación, para visualizar el bidimensional mapas de concentración oxigenada hemoglobina, la concentración de hemoglobina desoxigenada, concentración total de hemoglobina, la saturación de oxígeno cerebral regional, y Scattering poder. El algoritmo detallado ha sido publicada en la literatura 17, 18. <ol><li> Restar la imagen oscura tanto el la imagen de la muestra a cada longitud de onda imagen de referencia y de. </li><li> Normalizar la imagen de muestra la imagen de referencia por en cada λ la longitud de onda. El tratamiento de la imagen normalizada como la imagen de reflectancia difusa R. </li><li> Calcular la absorbancia (o densidad óptica) de una imagen tomando el logaritmo de la inversa de la difusa R imagen reflectancia en cada λ la longitud de onda: <img alt="ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq1.jpg" /> (1) </li><li> Generar una matriz tridimensional por el apilamiento de las imágenes de absorbancia en el orden de sus longitudes de onda, donde el x - plano y muestra la información estructural obtenida para la superficie del cerebro y la z eje x muestra la información espectral. </li><li> Educación físicarforma un análisis de regresión múltiple para el espectro de absorbancia A (λ) en cada xy de coordenadas. </li><li> Utilice el espectro de absorbancia A (λ) como la variable dependiente y el coeficiente de extinción espectros molar de hemoglobina oxigenada ε HbO (λ) y HBr desoxigenada hemoglobina ε (λ) como las variables independientes para la etapa 5.5 (valores publicados para ε HbO (λ) y ε HBr (λ) se proporcionan en la Tabla 1). </li><li> Compruebe los mapas bidimensionales (imágenes) de los tres coeficientes de regresión múltiple de un HBO, HBr, y un 0. </li><li> Generar una matriz tridimensional por el apilamiento de las imágenes de los coeficientes de regresión múltiple en el orden de un HBO, HBr, y un 0, donde el <em&gt; x - plano y muestra la información estructural obtenida para la superficie del cerebro y el eje x z muestra los coeficientes de regresión múltiple. </li><li> Calcular la concentración de hemoglobina oxigenada C HBO, la hemoglobina desoxigenada concentración C HBr, y el poder de dispersión b del conjunto de regresión múltiple coeficientes a HBO, HBr, y un 0 en cada coordenada XY usando las siguientes fórmulas empíricas (él valores de β HBO, i, β HBr, i, y β 0, i (i = 0,1,2,3) se proporcionan en la Tabla 2): <img alt="La ecuación 2" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq2.jpg" /> (2) <img alt="La ecuación 3" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq3.jpg" /> (3) <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/55399/55399eq4.jpg" /> (4) </li><li> Compruebe los mapas bidimensionales (imágenes) de la concentración de hemoglobina oxigenada C HbO , la concentración de hemoglobina desoxigenada C HbR y el poder de dispersión b . </li><li> Calcular un mapa bidimensional de la concentración total de hemoglobina C HbT sumando C HbO y C HbR en cada coordenada x - y . </li><li> Calcular un mapa bidimensional de la saturación regional de oxígeno cerebral rSO 2 dividiendo la concentración de hemoglobina oxigenada C HbO por la concentración total de hemoglobina C HbT en cada coordenada x - y . </li></ol>

<ol>
	<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+based+on+intrinsic+signals:+the+methodology.">Optical Imaging based on intrinsic signals: the methodology.</a> Brain mapping; the methods. , 55-97 (1996).</li><li>Mourant, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+light+scattering+from+biological+cells+relevant+to+noninvasive+optical-tissue+diagnostics.">Mechanisms of light scattering from biological cells relevant to noninvasive optical-tissue diagnostics.</a> Appl. Opt. 37 (16), 3586-3593 (1998).</li><li>Abookasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cortical+absorption,+scattering,+and+hemodynamic+response+during+ischemic+stroke+using+spatially+modulated+near-infrared+illumination.">Imaging cortical absorption, scattering, and hemodynamic response during ischemic stroke using spatially modulated near-infrared illumination.</a> J. Biomed. Opt. 14 (2), 024033 (2009).</li><li>Lipton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+cell+death+in+brain+neuron.">Ischemic cell death in brain neuron.</a> Physiol. Rev. 79 (4), 1432-1568 (1999).</li><li>Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+does+not+mediate+acute+neuronal+damage+after+spreading+depression+induced+by+O2/glucose+deprivation+in+the+hippocampal+slice.">Glutamate does not mediate acute neuronal damage after spreading depression induced by O2/glucose deprivation in the hippocampal slice.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 20 (2), 412-422 (2000).</li><li>Dunn, A. K., Devor, A., Dale, A. M., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+extent+of+oxygen+metabolism+and+hemodynamic+changes+during+functional+activation+of+the+rat+somatosensory+cortex.">Spatial extent of oxygen metabolism and hemodynamic changes during functional activation of the rat somatosensory cortex.</a> Neuroimage. 27 (2), 279-290 (2005).</li><li>Jones, M., Berwick, J., Johnston, D., Mayhew, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+optical+imaging+spectroscopy+and+laser-Doppler+flowmetry:+the+relationship+between+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+in+rodent+barrel+cortex.">Concurrent optical imaging spectroscopy and laser-Doppler flowmetry: the relationship between blood flow, oxygenation, and volume in rodent barrel cortex.</a> Neuroimage. 13 (6), 1002-1015 (2001).</li><li>Jones, M., Berwick, J., Mayhew, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+following+extended+stimulation+of+rodent+barrel+cortex.">Changes in blood flow, oxygenation, and volume following extended stimulation of rodent barrel cortex.</a> Neuroimage. 15 (3), 474-487 (2002).</li><li>Zhou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+optical+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+during+cortical+spreading+depression+in+rat+brain.">Diffuse optical correlation tomography of cerebral blood flow during cortical spreading depression in rat brain.</a> Opt. Express. 14 (3), 1125-1144 (2006).</li><li>Bouchard, M. B., Chen, B. R., Burgess, S. A., Hillman, E. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+multispectral+optical+imaging+of+cortical+oxygenation,+blood+flow,+and+intracellular+calcium+dynamics.">Ultra-fast multispectral optical imaging of cortical oxygenation, blood flow, and intracellular calcium dynamics.</a> Opt. Express. 17 (18), 15670-15678 (2009).</li><li>Jones, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multispectral+reflectance+imaging+and+laser+speckle+flowmetry+of+cerebral+blood+flow+and+oxygen+metabolism+in+focal+cerebral+ischemia.">Simultaneous multispectral reflectance imaging and laser speckle flowmetry of cerebral blood flow and oxygen metabolism in focal cerebral ischemia.</a> J. Biomed. Opt. 13 (4), 044007 (2008).</li><li>Kawauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+light+reflectance+signals+as+potential+indicators+of+loss+of+viability+in+brain+tissue+due+to+hypoxia:+charge-coupled-device-based+imaging+and+fiber-based+measurement.">Diffuse light reflectance signals as potential indicators of loss of viability in brain tissue due to hypoxia: charge-coupled-device-based imaging and fiber-based measurement.</a> J. Biomed. Opt. 18 (1), 015003 (2013).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+absorption+and+scattering+properties+of+in+vivo+exposed+rat+brain+using+a+digital+red-green-blue+camera.">Multispectral imaging of absorption and scattering properties of in vivo exposed rat brain using a digital red-green-blue camera.</a> J. Biomed. Opt. 20 (5), 051026 (2015).</li><li>Nishidate, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Cerebral+Hemodynamics+and+Tissue+Morphology+of+In+Vivo+Rat+Brain+Using+Spectral+Diffuse+Reflectance+Imaging.">Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Tissue Morphology of In Vivo Rat Brain Using Spectral Diffuse Reflectance Imaging.</a> Appl. Spectrosc. , (2016).</li><li>Wang, L. -. H., Jacques, S. L., Zheng, L. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCML-Monte+Carlo+modeling+of+photon+transport+in+multi-layered+tissues.">MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues.</a> Comput. Methods Programs Biomed. 47 (2), 131-146 (1995).</li><li>Tsytsarev, V., Premachandra, K., Takeshita, D., Bahar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cortical+electrical+stimulation+in+vivo:+Fast+intrinsic+optical+signal+versus+voltage-sensitive+dyes.">Imaging cortical electrical stimulation in vivo: Fast intrinsic optical signal versus voltage-sensitive dyes.</a> Opt. Lett. 33 (9), 1032-1034 (2008).</li><li>Arnold, T., Biasio, M. D., Leitner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyper-spectral+video+endoscope+for+intra-surgery+tissue+classification+using+auto-fluorescence+and+reflectance+spectroscopy.">Hyper-spectral video endoscope for intra-surgery tissue classification using auto-fluorescence and reflectance spectroscopy.</a> Proc. SPIE. 8087, 808711 (2011).</li><li>Basiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multi-spectral+camera+in+the+characterization+of+skin+wounds.">Use of a multi-spectral camera in the characterization of skin wounds.</a> Opt. Express. 18 (4), 3244-3257 (2010).</li><li>Nishidate, I., Maeda, T., Niizeki, K., Aizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+melanin+and+hemoglobin+using+spectral+reflectance+images+reconstructed+from+a+digital+RGB+image+by+the+Wiener+estimation+method.">Estimation of melanin and hemoglobin using spectral reflectance images reconstructed from a digital RGB image by the Wiener estimation method.</a> Sensors. 13 (6), 7902-7915 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El paso más crítico en este protocolo es la eliminación de la región del cráneo adelgazada para hacer la ventana craneal; Esto debe realizarse cuidadosamente para evitar el sangrado inesperado. Este paso es importante para obtener imágenes reflectantes difusas multiespectrales de alta calidad con alta precisión. Se recomienda el uso de un estereomicroscopio para el procedimiento quirúrgico si es posible. Pequeños trozos de esponja de gelatina son útiles para la hemostasia. El siste...

La imagen de reflectancia difusa multiespectral es la técnica más común para obtener un mapa espacial de señales ópticas intrínsecas (IOSs) en el tejido cortical. Los IOS observados en el cerebro in vivo se atribuyen principalmente a tres fenómenos: variaciones en la absorción de la luz y propiedades de dispersión debido a la hemodinámica cortical, variación en la absorción dependiendo de la reducción o oxidación de los citocromos en las mitocondrias y variaciones en las propiedades de dispersión de la luz inducidas por alteraciones morfológicas 1 . La luz en el rango espectral visible (VIS) al infrarrojo cercano (NIR) es efectivamente absorbida y dispersada por el tejido biológico. El espectro de reflectancia difusa del cerebro in vivo se caracteriza por espectros de absorción y dispersión. Los coeficientes de dispersión reducidos μ s &#39; de tejido cerebral en el intervalo de longitud de onda VIS-a-NIR dan como resultado una exposición monótona del espectro de dispersióning magnitudes más pequeñas en longitudes de onda más largas. El coeficiente de dispersión de espectro μ reducida s &#39;(λ) se puede aproximar a estar en la forma de la función de la ley de potencia 2, 3 como μ s&#39; (λ) = a × λ -b. El poder de dispersión b está relacionada con el tamaño de dispersores biológicas en el tejido 2, 3 viviente. Las alteraciones morfológicas del tejido y la reducción de la viabilidad de tejido vivo cortical pueden afectar el tamaño de los dispersores biológicos 4, 5, 6, 7, 8, 9. Un sistema óptico para obtener imágenes de reflectancia difusa multiespectral se puede construir fácilmente a partir de un li incandescentefuente de lucha, componentes ópticos simples, y un dispositivo de carga acoplada monocromática (CCD). Por lo tanto, varios algoritmos y sistemas ópticos para obtención de imágenes multiespectrales de reflectancia difusa se han utilizado para evaluar la hemodinámica corticales y / o la morfología del tejido 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. El método descrito en este artículo se utiliza para visualizar tanto la hemodinámica y las propiedades de dispersión de luz de tejido cerebral de rata in vivo usando un sistema de imagen de reflectancia difusa multiespectral convencional. Las ventajas de este método sobre técnicas alternativas son la capacidad de evaluar los cambios espacio-temporales en ambos hemodinámica cerebral y el tejido corticalmorfología, así como su aplicabilidad a diversos modelos animales de disfunción cerebral. Por lo tanto, el método será adecuado para las investigaciones de lesión traumática cerebral, ataque epiléptico, derrame cerebral e isquemia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:289px;">150-W halogen-lamp light source</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:119px;">LA-150SAE</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Light guide</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>LGC1-5L1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">Collecting lens</td>
			<td style="width:281px;">Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>SH-F16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@500nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@520nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@540nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@560nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@570nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@580nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@600nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@730nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#65115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Interference filters l@760nm</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>#67777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Motorized filter wheel&#160;</td>
			<td>Andover Corporation, NH, USA</td>
			<td>FW-MOT-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16-bit cooled CCD camera</td>
			<td>Bitran, Japan</td>
			<td>BS-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Video zoom lens</td>
			<td>Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>VZMTM300i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:289px;">Spectralon white standard with 99% diffuse reflectance</td>
			<td>Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA</td>
			<td>SRS-99-020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and light scattering properties of the in vivo rat brain using multispectral diffuse reflectance imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Imágenes espectrales representativos de reflectancia difusa adquirido de in vivo cerebros de rata se muestran en la Figura 3. Las imágenes en 500, 520, 540, 560, 570, y 580 nm visualizar claramente una densa red de vasos sanguíneos en la corteza cerebral. El deterioro del contraste entre los vasos sanguíneos y el tejido circundante se observa en las imágenes a 600, 730, y 760 nm refleja la menor absorción de la luz por la hemoglobina en longitudes de onda ...

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Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

La evaluación simultánea de la hemodinámica cerebral y las propiedades de dispersión de luz de ratas in vivo en el tejido cerebral se demuestra usando un sistema de imagen de reflectancia difusa multiespectral convencional.

La evaluación simultánea de Hemodinámica cerebral y propiedades de dispersión de luz de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Cerebro de rata utilizando multiespectral de imágenes de reflectancia difusa

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

7.6K vistas.  Tokyo University of Agriculture & Technology.  La evaluación simultánea de la hemodinámica cerebral y las propiedades de dispersión de luz de ratas in vivo en el tejido cerebral se demuestra usando un sistema de imagen de reflectancia difusa multiespectral convencional. 

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Investigación

Neurociencias

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Evaluación de la función bioenergética en las células endoteliales vasculares cerebrales

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Diffuse Reflectance Spectroscopy: Getting the Capillary Refill Test Under One's Thumb

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill should occur within 2 s after releasing 5 s of firm pressure (e.g., by the physician&#39;s finger) in the normal healthy supine patient. A slower refill time indicates poor skin perfusion, which can be caused by conditions including sepsis, blood loss, hypoperfusion, and hypothermia. Since its introduction, the clinical usefulness of the test has been debated. Advocates point out its feasibility and simplicity and claim that it can indicate changes in vascular status earlier than changes in vital signs such as heart rate. Critics, on the other hand, stress that the lack of standardization in how the test is performed and the highly subjective nature of the naked eye assessment, as well as the test&#39;s susceptibility to ambient factors, markedly lowers the clinical value. The aim of the present work is to describe in detail the course of the refill event and to suggest potentially more objective and exact endpoint values for the capillary refill test using diffuse polarization spectroscopy.

This protocol describes how the use of diffuse polarization spectroscopy can improve the clinical usefulness of the capillary refill test. We suggest a more detailed analysis of the course of the capillary refill in healthy volunteers using diffuse reflectance spectroscopy videos and new informatic endpoints.

Espectroscopia de reflectancia difusa: Conseguir la prueba de llenado capilar bajo la

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

Inducción de lesión cerebral axonal difusa en ratas basada en aceleración rotacional

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

La evaluación simultánea de Hemodinámica cerebral y propiedades de dispersión de luz de la

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