Estos métodos se pueden utilizar para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias y hemodinámicas a la lesión cerebral como parte de un análisis del sistema multivariante utilizando la regresión parcial de mínimos cuadrados. Estas técnicas se utilizan para dar una visión más holística de la respuesta del cerebro a las lesiones. Para inducir una lesión, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesiado y coloque el ratón en la posición prona en el centro de una membrana delgada.
Usando ambas manos para sostener el tejido enseñado, asegure la cola del ratón debajo de un pulgar y coloque la cabeza del ratón debajo del tubo guía. Cuando el ratón esté en posición, apuntando al impacto entre la parte posterior de los ojos y la parte frontal de las orejas, deje caer el perno desde la parte superior del tubo guía sobre el aspecto dorsal de la cabeza del ratón. Tras el impacto, el ratón romperá el tejido, lo que permitirá una rápida aceleración de la cabeza alrededor del cuello.
Después de la lesión, permita que el ratón se recupere en posición supina en una almohadilla de calentamiento de 37 grados Centígrados. Después de un período de estabilización de dos minutos, apoye suavemente el sensor DCS sobre el hemisferio derecho del cráneo del ratón, de modo que el borde superior del sensor óptico se alinee con la parte posterior del ojo y el lado del sensor se alinee a lo largo de la línea media. Coloque una mano sobre el sensor para protegerlo de la luz de la habitación y adquirir cinco segundos de datos.
Luego, reposicione el sensor sobre el hemisferio izquierdo y adquiera cinco segundos de datos del hemisferio izquierdo. Para evaluar la producción de citoquinas multiplexadas y fosfoproteínas, agregue 150 microlitros de tampón de lisis mixta por aproximadamente tres miligramos de tejido cerebral animal cosechado. Y use una punta de pipeta de 1, 000 microlitros para triturar mecánicamente el tejido de 15 a 20 veces.
Coloque las muestras homogeneizadas en un rotador durante 30 minutos a cuatro grados centígrados antes de recoger los restos de tejido por centrifugación. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos y centrífuga las muestras para eliminar cualquier precipitado restante. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos y determine la concentración de proteínas mediante ensayo de BCA de acuerdo con los protocolos estándar.
Preparar 25 microlitros de cada muestra a la concentración óptima de proteínas determinada por el análisis de rango lineal en tubos nuevos. Uso de búfer de ensayo para normalizar el volumen total de cada muestra a 25 microlitros. Para preparar una placa de ensayo, agregue 200 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y agite la placa en un agitador durante 10 minutos a 750 revoluciones por minuto.
Al final de la incubación, decante el tampón de lavado y golpee el plato con una toalla de papel para eliminar cualquier residuo. A continuación, agregue 25 microlitros de tampón de ensayo a cada pozo, seguido de 25 microlitros adicionales de tampón a los pozos de fondo. Agregue 25 microlitros de las muestras diluidas a los pozos de muestra apropiados y vórtice la vía de cuentas magnéticas multiplexadas durante un minuto, antes de agregar 25 microlitros de las perlas completamente resuspendidas a cada pozo.
Cuando se hayan agregado todas las perlas, selle la placa con un sellador de placas y cubra la placa con papel de aluminio para una incubación nocturna con agitación de dos a ocho grados centígrados. A la mañana siguiente, coloque la placa en un separador magnético, asegurándose de que los pozos estén alineados con los imanes. Después de dos minutos, decantar el contenido del pozo con la placa aún unida al separador magnético y agregar 200 microlitros de tampón de lavado a cada pozo.
Después de mantenerlo temblando durante dos minutos, coloque la placa en el separador magnético durante dos minutos. Luego, decantar el contenido del pozo con la placa aún unida al separador magnético y lavar la placa con un nuevo tampón de lavado de 200 microlitros por pozo, como se acaba de demostrar. Después del segundo lavado, agregue 25 microlitros de anticuerpos de detección por pozo y vuelva a cubrir con papel de aluminio para una incubación de una hora a 750 revoluciones por minuto a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, agregue 25 microlitros de estreptavidina ficoeritrina a cada pocillo y devuelva la placa al agitador durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque la placa en el separador magnético durante dos minutos antes de decantar el contenido del pozo. Lave la placa dos veces con 200 microlitros de tampón de lavado fresco por lavado y agregue 75 microlitros del fluido de accionamiento apropiado a cada pozo.
Luego, vuelva a suspender las perlas en el agitador de placas durante cinco minutos a temperatura ambiente y lea las placas en el analizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este análisis, el flujo sanguíneo cerebral se midió con espectroscopia de correlación difusa cuatro horas después de la última lesión. El índice de flujo sanguíneo cerebral y el índice de flujo cerebral medio para cada hemisferio se pueden determinar.
Se puede realizar un análisis de rango lineal para determinar una masa de carga de proteína adecuada antes de recopilar datos de todas las muestras. Los datos de citoquinas se pueden preparar restando las mediciones de fondo de los datos de muestra, luego calculando los datos de la puntuación Z para cada anolito. La regresión parcial de mínimos cuadrados se puede realizar utilizando un marcador de activación microglial de fagocitos u otra variable de interés como variable de respuesta, y las mediciones de citoquinas como variables predictoras.
La rotación Varimax se puede realizar para maximizar la covarianza de los datos en la variable latente uno, con las mediciones del marcador de activación. Los pesos de carga altos en la variable latente uno se corresponden con las expresiones de citoquinas más asociadas con la alta expresión del marcador de activación. Las regresiones lineales entre el marcador de activación y las citoquinas ilustran que aquellas citoquinas con mayores pesos de carga en la variable latente uno también fueron estadísticamente significativas para este análisis.
Aunque centramos este protocolo en la lesión cerebral traumática, estos métodos son ampliamente generalizables al estudio de una gran cantidad de afecciones patológicas que afectan al cerebro. Utilizamos estas técnicas para ayudarnos a identificar objetivos tratables para modular en futuros experimentos para establecer relaciones mecanicistas causales y, en última instancia, con el objetivo de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la lesión cerebral traumática leve.
