Name: using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles at JoVE.com

Las instalaciones de microscopía utilizadas son parte del centro de la proyección de imagen óptica de Erasmus, y nos gustaría agradecer al personal de la OCI por sus servicios.

1. preparación <ol><li>montar la cámara de proyección de imagen, que consta de dos partes.
	<ol><li>Colocar un vidrio de cubierta de 25 mm ( figura 1A -1) en la parte inferior de la cámara ( figura 1A -2) y la parte superior del tornillo en la parte inferior ( figura 1A -3). No apriete demasiado, ya que puede romper el vidrio. Autoclave de toda la cámara ( figura 1A -4).</li>
	</ol></li> <li>Preparar medio de cultivo celular complementando Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM) sin rojo de fenol con 10% de suero de ternera fetal inactivado con calor (FCS) y 1 mM L-glutamina bajo condiciones estériles. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de su uso.</li>
	<li>Mantener las células con medio de cultivo celular en cultivo frascos usando técnicas de cultivo estándar celular. 
	Nota: Aquí, dos líneas celulares de ratón melanoma B16BL6 11 Lewis lung carcinoma (LLC) y dos melanomas humanos, BLM y 1F6 12, se utilizó y.</li>
	<li>Hacer gelatina de 0.1% por peso y disolver la gelatina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C durante la noche. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.</li>
</ol> 2. Las células de la placa <ol><li>Retire la cámara de proyección de imagen de la bolsa de esterilización en un gabinete de flujo laminar con cuidado apriete la cámara y colocar en una placa Petri. 
	Nota: Para evitar contaminación, mantenga la cámara de proyección de imagen en una placa Petri hasta que la cámara puede colocarse bajo el microscopio.</li>
	<li>Cubrir el cristal de la cámara de proyección de imagen con 1 mL de 0.1% gelatina estéril por 20 min a 37 ° C y 5% CO 2. 
	Nota: Esto permitirá mejor accesorio celular.</li>
	<li>Quitar el medio de los frascos de cultivo celular (ver pasos 1.2 y 1.3), lavar una vez con PBS 1 x y separar las células utilizando tripsina 0.25%. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo celular, recoger las células, desactivación a 1.100 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo celular.</li>
	<li>Diluir 20 μl de la suspensión celular con 20 μl de azul de tripán (que va ser tomada por las células muertas). Contar el número de células vivas y muertas usando un hemocitómetro; el número de células muertas no debe exceder del 10%.</li>
	<li>Aspirar la gelatina y las células en una disolución que permite un máximo de 70% de cobertura dentro de las 24 h de la placa. Por ejemplo, utilizar una dilución de 5 x 10 4 o 10 x 10 4 células en 1 mL. Permitir que las células se adhieran en el 5% CO 2 y 37 ° C durante 24 h.</li>
</ol> 3. Time-lapse microscopia ( figura 2) Nota: aquí, se utilizó un microscopio confocal con el titular de una etapa a la medida, aunque la mayoría de fabricantes ofrecen una gama de incubadoras para células vivas imágenes que son también es adecuado para investigar la administración de fármacos nanoparticulados.
<ol><li>Evaluar las células bajo un microscopio para la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Vuelva a colocar la cámara en la incubadora de CO 2. 
	Nota: La confluencia no debe exceder el 70%. Si la morfología celular es inconsistente (es decir, las células no se adhieren) o se detecta contaminación, deseche la cámara imagen.</li>
	<li>Encender el microscopio confocal ( Figura 1E -1), luz fluorescente ( Figura 1E -2) y computadoras ( Figura 1E -3).</li>
	<li>Conectar el calentador de lente al objetivo y ponerlo a 35 ° C ( Figura 1E -4 + insert).</li>
	<li>Preparar la unidad de incubación, como se muestra en la figura 1B. 
	Nota: Esta unidad consiste en una platina calefactada ( figura 1B -1), una etapa de flujo con un conector para el CO 2 tubos ( figura 1B -2) y sonda de CO 2 ( figura 1B -3) y un parche de cierre rojo ( figura 1B -4). Este parche se utiliza para cerrar temporalmente la unidad hasta que se coloca la cámara imagen.</li>
	<li>Coloque la unidad de incubación sobre la platina del microscopio y conectar el en - y hacia fuera - flujo CO 2 tubos ( Figura 1E -5). Abra la válvula principal de CO 2 ( Figura 1E -6) y encienda el controlador de 2 CO ( Figura 1E -7). Compruebe que el controlador se establece en 5% CO 2. 
	Nota: Para la humedad, CO 2 pasa a través de un humidificador ( Figura 1E -8). Para los experimentos de la hipoxia, un regulador de 2 O separado ( Figura 1E -9) está incluido en la configuración de.</li>
	<li>Ajustar la temperatura de la etapa a 37 ° C ( Figura 1E -10). Para los experimentos de hipertermia, ajuste la temperatura a 42 ° C. permitir la unidad de incubación para alcanzar la temperatura seleccionada y CO un porcentaje de 2.</li>
	<li>Tomar la sala de proyección de imagen del principal CO 2 incubadora y transporte de la cámara en una placa Petri a la sala de microscopía.</li>
	<li>La sala de proyección de imagen ( figura 1A -4) en una a medida, 35 mm de diámetro etapa titular ( figura 1A -5) y cerrar el compartimiento con tapa cierre a medida ( Figura 1A -6). 
	Nota: La tapa permite CO 2 pasar y evita la evaporación y contaminación.
	<ol><li>Abra la unidad de incubación, reemplazar el parche rojo con la imagen de la cámara y cerrar la unidad ( figura 1). Para ello lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células. Asegúrese de que ningún cable se pegan entre la etapa y el microscopio.</li>
	</ol></li> <li>Deja la unidad para aclimatarse durante 30 minutos</li>
	<li>El software abierto y enciende los lasers. 
	Nota: Aquí, argón nm 488 543 nm helio-neon, láseres de helio-neón 633 nm se utilizó y.</li>
	<li>Hacer una nueva base de datos haciendo clic en &#34; nueva &#34; en la ficha de archivo nombre y guardar la base de datos.</li>
	<li>Establecer la configuración haciendo clic en &#34; Config &#34; debajo de la ficha de adquisición seleccione &#34; modo de canales &#34; y &#34; sola pista &#34; para evaluar un solo fluoróforo o &#34; Multi pista &#34; para varios fluoróforos. Seleccione los filtros de paso de banda apropiado que empareja el fluoróforo (p. ej., 560 a 615 nm filtro para dox y Dox-NP; vea los resultados de representante para más ejemplos). Seleccione el canal de campo brillante en uno de los temas.</li>
	<li>Establecer el control de exploración haciendo clic en &#34; Análisis &#34; debajo de la ficha adquirir conjunto el tamaño de fotograma (1.024 x 1.024), velocidad de escaneo (óptima), escanear dirección (8-bit, solo) y media (4) la exploración haciendo clic en &#34; modo &#34; fijar el agujero de alfiler (200 μm), ganancia y offset ( por ejemplo, 580 700 y 835; Ver figura 3) y energía del laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) haciendo clic en &#34; canales. &#34;</li> <li>guardar esta configuración haciendo clic en &#34; Config &#34; en el configuración ficha y guardar en la base de datos de configuración.</li>
	<li>Establecer el lapso de tiempo haciendo clic en &#34; Multi tiempo X &#34; ( figura 1) en la ficha de Macro haga clic en &#34; solo ubicación &#34;.</li>
	<li>Para mantener las células en el foco, seleccionar el enfoque automático en la macro haciendo clic en &#34; Auto foco. &#34; 
	Nota: enfoque automático se consigue con el láser de 633 nm usando el reflejo del vidrio como un punto de referencia.</li>
	<li>Aplicar la configuración guardada pulsando &#34; pista solo &#34; o &#34; Multi pista, &#34; de desplazamiento a la configuración requerida en la base de datos de configuración, ajuste el intervalo de tiempo (por ejemplo, 15 min), número de análisis (p. ej., 97) y Haga clic en &#34; carga Config. &#34; Nota: Use estos ajustes, se realizará una serie de tiempo de 97 x 15 min = 24 h.</li>
	<li>Nombre del time-lapse en el &#34; Base de nombre de archivo &#34; y seleccione la base de datos (hecha en el paso 3.11) haciendo clic en &#34; Base de datos de imagen &#34; para salvar el lapso de tiempo. Establecer una carpeta temporal haciendo clic en &#34; carpeta Tmp imagen. &#34; Nota: Si el sistema se detiene o se bloquea por cualquier motivo, las imágenes se encuentran en esta carpeta.</li>
	<li>Abra la unidad de incubación, levante el anillo de la proyección de imagen, añada una gota de aceite de inmersión el objetivo y cerrar la unidad tan rápido como sea posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de proyección de imagen. 
	Nota: Esta posición contiene células en una monocapa, con un mínimo de 70% de confluencia, lo que permite la proyección de imagen de células individuales.</li>
	<li>Verificar los ajustes de configuración para el fondo y corregir si es necesario. 
	Nota: El fondo puede ser corregido reduciendo el poder de ganancia o láser. Cualquier cambio en la configuración hay que salvar (ver paso 3.17) y cargado (ver paso 3.18) nuevamente en la macro de.</li>
	<li>En el gabinete de flujo laminar, diluir drogas gratis o nanopartículas en una concentración de 5 μg/mL droga o el 0,05 μmol de lípidos en el medio de cultivo celular. Filtrar con un filtro de jeringa 0,22 μm si las drogas/nanopartículas no son estériles.</li>
	<li>Abrir la cámara de incubación, levante la tapa de sellado, retire el medio de las células, agregar 1 mL de medicamento diluidas/nanopartículas y cierre la unidad tan rápido como sea posible.</li>
	<li>Centrarse en las células y el lapso de tiempo de inicio haciendo clic en &#34; hora de inicio &#34; en la macro Multi tiempo X.</li>
	<li>Compruebe regularmente si las células siguen en foco o utilizan el enfoque automático (ver paso 3.16). El programa guarda automáticamente el Time-lapse en la base de datos; no cierre la base de datos mientras se ejecuta el programa.</li>
</ol> 4. Análisis de datos <ol><li>dependiendo de la pregunta original de investigación, utilizar programas de software como el ImageJ para análisis de datos (véase la sección resultados para ejemplos).</li></ol>

<ol>
	<li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+liposomal+doxorubicin:+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer,+ovarian+cancer,+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi's+sarcoma.">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li><li>Ten Hagen, T. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome:+Evaluated+by+in+vitro/in+vivo+live+cell+imaging.">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Thermosensitive+Liposomes:+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells.">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li><li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF,+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma,+on+a+syngeneic+murine+melanoma.">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li><li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice.">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li><li>Das, A. 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Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance.">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy.">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids.">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells.">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Según lo observado en el pasado, la fijación puede destruir nanocarriers liposomal casi inmediatamente y DXR lanzado estos liposomas destruidos todavía tenían el tiempo para entrar en el núcleo, de forma que la interpretación de datos muy difícil e incluso engañosa. Con algunos ajustes microscópicos, sino quimioterápico en las células vivas y tejidos puede investigarse rutinariamente para confirmar o derrocar observaciones histológicas. Un trabajo reciente demostró la absorción, liberación y localización de DXR en células tratadas con dox libre y encapsulado utilizando células vivas Time-lapse imagen9. Este trabajo describe el montaje experimental con más detalle. Utilizando este modelo, es posible visualizar el transporte inmediato de dox al núcleo, donde se acumula continuamente hasta que la célula finalmente muere. En cambio, cuando se utiliza Dox-NP, sólo pequeñas cantidades de dox liberado se encuentran en el núcleo. Aunque continua exposición resulta en acumulación continua de DXR, la señal fluorescente es mucho menor en Dox-NP-versus células tratadas con dox, indicando una diferencia en la concentración celular y citotoxicidad posterior. Además, mediante el uso de marcadores de células vivas, fue demostrado que, al exponer las células a Dox-NP, DXR y el nanocarrier se encuentran en el lisosoma. Esto indica que el liposoma completa es tomado por la célula y muestra la implicación de una vía endocíticas durante la captación de estas nanopartículas. El DXR en el núcleo es claramente de dox liberado. Sin embargo, usando este método, como el DXR y portador co localización y parecen estar atrapados en los lisosomas, es todavía poco concluyentes si esto se encapsula o lanzado dox. Es posible que la estabilidad intrínseca de la nanopartícula evita la liberación de dox cuando localizadas en el lisosoma.
En este protocolo, proyección de imagen de células vivas se demuestra mediante una específica configuración microscópica, con un soporte de fase por encargo (las especificaciones se pueden dar bajo petición). Sin embargo, más fabricantes de microscopio confocal ofrecen una gama de incubadoras que realizar proyección de imagen de células vivas. Preservar las condiciones de cultivo de células (es decir, temperatura, CO2, pH, humedad y esterilidad) es el criterio principal de estas incubadoras y requiere algunas pruebas preliminares para determinar las condiciones adecuadas, que se explicó. Programas de adquisición de datos también pueden ser entregados por los mismos fabricantes. Una opción de "Multi ubicación" hace posible para varios puestos en la misma cámara, la imagen refinado análisis estadístico. Sin embargo, esta opción en la macro en este manuscrito requiere posiciones fijas de XYZ, por la que se pierde la posibilidad de corregir para la deriva de Z. Análisis de la dimensión Z pueden incluirse en este macro y utiliza un enfoque plano para el análisis. Sin embargo, esto requiere análisis adicionales, aumentando la posibilidad de fototoxicidad y blanqueo.
Como con todas las medidas fluorescentes, sobreexposición es un problema, especialmente cuando se comparan dos compuestos con un diferente absorción celular. La intensidad fluorescente no depende sólo la señal intrínseca del compuesto, sino también la tasa de absorción, la concentración y el tiempo de exposición de la droga. Como se muestra en la figura 3, el contenido nuclear de DXR de células tratadas con dox ya es visible, mientras que ninguna señal se observa en células tratadas con Dox-NP. Sólo mediante el aumento de la ganancia puede DXR en células tratadas con Dox-NP visualizarse, conduce a la sobreexposición en células tratadas con dox. Por otra parte, incluso intracelularmente, Dox-NP es heterogénea, que puede dar lugar a inevitables bajo- o sobreexposición. Especialmente al investigar la captura celular de DXR, la ganancia se redujo significativamente para distinguir los organelos (figuras 5B y 5C). Por lo tanto, las mediciones representadas por la densidad de píxeles deben acompañarse de las imágenes representativas para la correcta interpretación de los resultados.
Fototoxicidad, blanqueo y un cociente signal-to-noise bajo también son temas importantes en microscopía fluorescente, y debe establecerse un compromiso entre la calidad de la imagen y la adquisición de la imagen. Sin embargo, incluso cuando la configuración del microscopio es óptima, la calidad de imagen está también determinada por la calidad de las células y el compuesto añadido. DXR da una señal fuerte y, con las precauciones apropiadas, blanqueo no se observó, incluso después de largos periodos (hasta 72 h). Sin embargo, la reducción de la señal fluorescente también puede ser consecuencia de la emanación. La emanación es un fenómeno importante en drogas resistencia15 y ocurre cuando las células bombear la droga desde el sitio intracelular de acción. Una disminución de la señal fluorescente en el tiempo por lo tanto también puede ser consecuencia de la emanación de dox9. Comparación de la señal fluorescente de un lugar no explorado en el final del experimento con la última imagen de la serie Time-lapse demostrará blanqueo (es decir, la señal será más alta en el lugar no explorado) o emanación (es decir, ambos señales serán idénticas). Están disponibles en programas como el ImageJ16varias opciones correccionales (p. ej., antecedentes, deriva, blanqueo, etc.). También, como la intensidad fluorescente aumenta con el tiempo, los valores de configuración pueden ser previamente evaluados en un experimento piloto para minimizar la exposición al final del lapso de tiempo (paso 3.21). Alternativamente, puede utilizarse una cámara de proyección de imagen con las células ya expuestos a la droga para el período de tiempo deseado para inicializar la configuración. Finalmente, para este tipo de análisis, concentraciones de la droga tóxica (paso 3.22) deben ser evitadas y había preestablecida usando bio-análisis convencionales.
Las células son continuamente cultivadas y mantenidas en medio sin rojo de fenol. Rojo de fenol es en la parte roja del espectro y se observan organelos celulares, probablemente lisosomas, presentando información de falsos positivos (paso 1.2). Para permitir el monitoreo de células individuales, confluencia celular no debe exceder 70% (paso 3.1.). El CO2 -velocidad de flujo (paso 3.5) debe ser regulado en un experimento de validación cuando el equipo es adquirido o después del mantenimiento. Cuando la velocidad es demasiado alta, medio se evaporará. Cuando la velocidad es demasiado baja, se incrementará el pH del medio, que puede afectar el crecimiento de la célula. Como el medio es sin los cambios de indicador de pH rojo de fenol pH no pueden ser observados y por lo tanto son fácilmente ignorados. Una vez que se valida el flujo de CO2 , esta configuración puede utilizarse en todos los experimentos futuros.
Utilizando el método descrito aquí, el destino de nanopartículas puede fácilmente ser investigado usando proyección de imagen de células vivas y microscopia Time-lapse. En este procedimiento, se utilizaron nanopartículas disponibles comercialmente. Sin embargo, el destino de termosensible17, liposomas catiónicos10; liposomas con shingolipids de cadena corta de18; y encapsulación de nanopartículas otras drogas también fueron investigados8,19 de esta manera en el tumor y las células normales.

La capacidad de seguir un proceso biológico, como las interacciones célula-célula, inter- y transporte intracelular, absorción compuesta citotóxica e interacción de la proteína-proteína de moléculas individuales en células vivas y tejidos, ha cobrado gran interés en los últimos década, ya que proporciona la dimensión adicional de "tiempo real". En este manuscrito, se describe un método para seguir el destino intracelular de dox libre y dox incorporado en nanopartículas (Dox-NP).
Nanopartículas se han utilizado durante décadas para tratar ciertos tipos de cáncer. DOX-NP ha sido aprobado para el tratamiento de sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA avanzado de ovario y cáncer de pecho y mieloma múltiple1. Fue una de las primeras nanopartículas liposómicos desarrolló e introdujo en el ajuste clínico. La forma libre, dox, enormemente se elimina de la circulación de la sangre, limitar su capacidad para llegar al sitio del tumor en cantidades suficientes. Además, el tratamiento es acompañado por efectos secundarios graves y limitación de dosis, como la estomatitis y la insuficiencia cardíaca. Cuando encapsulado en nanopartículas liposomal pegilada el tiempo de circulación aumenta desde minutos a días2. Este tipo de colesterol que contiene liposomas es bastante estable y esta estabilidad determina la farmacocinética del fármaco encapsulado.
Sin embargo, esta rigidez tiene un inconveniente. La capacidad citotóxica de un compuesto hacia las células tumorales es primero evaluado en vitro, y se ha demostrado que dox es más potente que Dox-NP en citotóxicos ensayos3,4. Fue presumido que la estabilidad de la portadora previene la liberación y la absorción celular de la droga, y vale la pena investigar este fenómeno más lejos. Las propiedades intrínsecas liposómicos, construidas para durar los elementos agresivos en la corriente sanguínea y llegar al sitio del tumor intacto, dio lugar a la alteración biodisponibilidad del componente citotóxico (es decir, dox) en el sitio de destino (es decir, el tumor núcleo de la célula). Aunque Dox-NP difícilmente mejora la respuesta frente a la forma libre, es de valor clínico, como encapsulado reduce significativamente los efectos cardiotóxicos del5. En los años siguientes, otros compuestos fueron encapsulados en portadores de la nano6. También, modificar las compañías dio lugar a la liberación del fármaco activada (es decir, en el sitio del tumor) pero mantuvo estabilidad en la circulación de sangre7,8. A pesar de años de investigación y uso clínico, los sinos intratumoral de nanocarriers como Dox-NP no son todavía completamente claros. En una publicación reciente, se demostró que la nanopartícula es tomada como un todo mientras que el dox queda atrapado en los lisosomas9.
La absorción celular de un lanzamiento de nanopartículas y de la droga son procesos dinámicos que mejor pueden ser monitoreados usando proyección de imagen de células vivas. Por otra parte, histología clásica, en que las células se incuban y después de eso fijo, puede dar resultados falsos si la fijación destruye el portador liposomal e introduce artefactos. El requisito principal para la proyección de imagen de células vivas es visualización, preferiblemente por fluorescencia, del proceso deseado. Ciertos compuestos, como dox, tienen una fluorescencia roja intrínseca. Además, marcadores fluorescentes pueden ser introducidos en el portador y orgánulos celulares pueden visualizarse utilizando marcadores de células vivas. De esta manera, una matriz de parámetros, como la absorción del portador, liberación del fármaco y localización celular de la portadora y la droga, puede ser reflejada y analizada. Aquí, se describe un método que sigue el destino intercelular de dox y Dox-NP en varias células del tumor en tiempo real. Además, este método puede adaptarse fácilmente para crear las condiciones ideales para dirigida (p. ej., cargada de nanopartículas10) y desencadena liberación del fármaco (p. ej., hipertermia,7).

<table><tbody><tr><td>DMEM (no phenol-red)</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS</td></tr><tr><td>Trypsin-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Heat inactivate for 30 min at 55 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Make a 0,1% solution in PBS, sterile</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &amp;micro;m filter - 500 ml&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Cells: Lewis lung carcimoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>Cells: B16BL6</td><td>Dr. P. Brouckaert, Ghent University</td><td>donated</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>Cells: BLM and 1F6</td><td>Dr. van Muijen, University of Nijmegen</td><td>donated</td><td>Ref.11</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Actavis&amp;nbsp;</td><td></td><td>mentioned as dox in the manuscript</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>mentioned as Dox-NP in the manuscript</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-green DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript</td></tr><tr><td>Lysotracker-red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript</td></tr><tr><td>Attofluor cell ring</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Stage holder + sealing lid</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LSM 510 version 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles

Técnicas de imagen convencionales pueden proporcionar información detallada sobre los procesos celulares. Sin embargo, esta información se basa en imágenes estáticas en un sistema dinámico de lo contrario, y sucesivas fases son fácilmente pasados por alto o mal interpretadas. Imágenes de células vivas y microscopía de Time-lapse, en la que las células vivas pueden seguir para horas o incluso días de una manera más o menos continua, por lo tanto son muy informativos. El protocolo aquí descrito permite la investigación de la suerte de nanopartículas quimioterapéuticas después de la entrega de doxorrubicina (dox) en células vivas. DOX es un agente intercalante que debe liberarse su nanocarrier a ser biológicamente activos. A pesar de su registro clínico durante más de dos décadas, su absorción, descomposición y liberación del fármaco no se entienden. Este artículo explora la hipótesis de que las nanopartículas basadas en lípidos son tomadas por las células del tumor y se degradan lentamente. Dox liberado entonces se transloca al núcleo. Para evitar artefactos de fijación, proyección de imagen de células vivas y microscopía de Time-lapse, que se describe en este procedimiento experimental, se pueden aplicar.

Etiquetado portadores liposomal con diferentes marcadores ha sido descrito previamente9. Portadores con dioctadecyl far-red tetramethylindotricarbocyanine perclorato (lo hizo; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) o 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) verde (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) se presenta en este manuscrito. Para mostrar intercelulares similitudes y diferencias en la absorción, liberación y localización intracelular, se estudiaron varios tipos de tumor. Estos incluyen dos líneas de ratón, el melanoma B16BL6 del11 y el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y dos melanomas humanos, un altamente metastático (BLM) y una de12,de melanoma no metastásico (1F6)13. Todos los experimentos se realizaron utilizando células vivas. En todos los experimentos, una concentración de 5 μg/mL dox, 5 μg/mL Dox-NP o 0,05 μmol de nanopartículas fueron administrados para 3 o 24 h. medidos y analizado dox (en forma libre, liberado, encapsulado, secuestrado o intercalado) se denominan DXR. 40 X (apertura numérica: 1.3) objetivo de aceite fue utilizado, y la proyección de imagen fue realizada con un láser de argón 488 de nm (energía de 10% / 0,2 mW) y un filtro de paso banda 505 a 550 nm para CF-PE y marcador lisosomal (LM)-verde. A 543 nm láser de helio-neon (100% / potencia de 0,2 mW) y un filtro de paso banda de 560 a 615 nm para dox, Dox-NP y rojo marcador lisosomal. A 633 nm láser de helio-neon (potencia 100% / 0.5 mW) y un filtro de paso de largo 640 nm se utilizó para lo.
Debido a su encapsulado, la citotoxicidad en vitro , biodisponibilidad y farmacocinética de dox fueron significativamente alterados3,9,14. La diferencia entre la biodisponibilidad de la droga cuando se administra en forma libre y encapsulado se demuestra en la figura 3. DOX es un agente intercalante y debe entrar al núcleo celular para ser citotóxico. Figura 3 y relacionados peliculas 1 y 2 muestran un 3 h Time-lapse de BLM células tratadas con dox o Dox-NP en condiciones idénticas. Dentro de minutos de exposición de dox, DXR nuclear puede observarse (Figura 3A, 1 película) y, utilizando una menor ganancia (insertar), puede verse intercalando en el núcleo. En cambio, cuando se exponen a Dox-NP, DXR intracelular es apenas visible dentro de este marco de tiempo (figura 3B, película 2). Sólo mediante el aumento de la ganancia del fotomultiplicador, DXR en el citoplasma puede observarse (insertar). Utilizar ImageJ, analizaron la densidad de píxeles de DXR citoplásmica y nuclear. Como las células están en movimiento durante la evaluación de lapso de tiempo, es importante combinar los fluorescentes con imágenes de campo claro. Esto presenta la posibilidad de seguimiento de las células individuales y estabilizar la deriva XY usando plugins específicos en ImageJ. En el análisis presentado en la figura 3, la imagen de campo claro se utiliza para dibujar una región de interés (ROI) en el citoplasma (línea sólida) y el núcleo (línea punteada). El Gerente de ROI en ImageJ puede encontrarse en el menú Analyze &#62; herramientas &#62; Gerente de ROI. Los ROIs se utilizan en la imagen fluorescente para analizar densidad de píxeles mediante la opción del menú Analyze &#62; medida. La diferencia entre la densidad de píxeles en el núcleo (figura 3) y el citoplasma (figura 3D) de las células tratadas dox o con Dox-NP confirma lo que se ve en las imágenes. Además, las células fueron incubadas durante 24 h con dox o Dox-NP, después de que el compuesto fue reemplazado por medio y reflejado inmediatamente con el aumento de la sensibilidad de la ganancia del fotomultiplicador (figura 4). Otros ámbitos, como la energía del laser, offset, agujero de alfiler y visualización de imágenes, eran idénticos. Es sorprendente la baja señal DXR en Dox-NP-células tratadas con respecto al Tratado de dox. Con una ganancia de 700, DXR en las células tratadas con Dox-NP se hace visible, mientras que la imagen de dox ya está sobreexpuesta. Este experimento simple en vitro visualiza una diferencia significativa en la biodisponibilidad de libre versus droga encapsulada.
Cuando las células están continuamente expuestas a Dox-NP durante 24 h, DXR se acumula con el tiempo, como se muestra en la figura 5A y películas 3 y 4. La señal aumenta en el citoplasma, y más tarde, DXR también se encuentra intercalada en el núcleo. Estas observaciones son confirmadas por las gráficas de densidad de píxeles (figura 5B). La densidad de píxeles citoplásmico medido es menor en BLM en comparación con las células 1F6 debido a la diferencia en la distribución intracelular. Mientras que DXR en células 1F6 se distribuye a lo largo de la célula, DXR en células BLM está más concentrado en un organelo cerca del núcleo (figura 5).
Por lo tanto, se investigó la localización de drogas y portador en diferentes líneas celulares (figura 6). Las células fueron incubadas durante 24 h con Dox-NP/hizo y reflejada. Usando la imagen de campo claro, un recubrimiento de la membrana celular (línea sólida) y núcleo (línea punteada) fue dibujado en la imagen fluorescente de tres diferentes líneas celulares. Se demuestra aquí que el portador, con lo hizo, sigue el mismo patrón citoplásmico como DXR: concentra en un organelo cerca del núcleo de BLM, alrededor del núcleo entero en LLC y esparcidas al azar por todo el citoplasma en las células B16BL6. En el núcleo, sólo DXR y no lo hizo puede verse, indicando lanzado dox. Al reducir la ganancia del fotomultiplicador, vesículas celulares individuales que contienen DXR y el portador, con lo, así como con el CF-PE (figuras 6B y 6C), se pueden ver.
DXR citoplásmico secuestra en pequeñas vesículas y células fueron etiquetadas con un marcador lisosomal de células vivas en verde o rojo. Puede seguir el movimiento de estos lisosomas en las células (película 5). DXR citoplásmico y el nanocarrier colocalize dentro de estas estructuras, y la diferencia intercelular en el patrón DXR, como se ve en la figura 6, se explica aquí. Lisosomas se distribuyen al azar por todo el citoplasma en B16BL6 y se encuentran cerca del núcleo en las células de la BLM (Figura 7A). Utilizar ImageJ, la colocalización entre DXR y portador en el lisosoma se calculó (figura 7B). Las imágenes de color se hicieron binario (proceso de &#62; binario &#62; binario hacer) y con el plug-in de colocalización (analizar &#62; colocalización), se hizo una imagen de colocalización de DXR con hizo. Esto crea una imagen de color verde-rojo-blanco, con píxeles blancos que representan los píxeles colocalized de ambas imágenes. A través del menú artículo proceso &#62; binario &#62; hacer binario, los píxeles blancos se separó y convierten a píxeles negros, de los cuales se mide la densidad de píxeles (analizar &#62; medida). Después de eso, se hizo una imagen de colocalización entre este DXR-de la imagen y la imagen binaria del marcador lisosomal (LM) y la densidad de píxeles medidos. Los datos de colocalización están el porcentaje de píxeles positivos para DXR-hizo y marcador DXR-hizo/lisosomal (figura 7). Que el portador, etiquetado con el CF-PE, así como lo hizo, se encuentra en el lisosoma también se muestra en la figura 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
Figura 1: instrumentos y equipos configuración. A) imágenes cámara + necesidades. vidrio de cubierta #1 de 25 mm (1), parte inferior de la cámara (2), superior de la cámara (lugard arriba hacia abajo) y junta tórica (3), titular de la etapa (4) y cierre la tapa (5). Barra de escala: 2 cm. B) unidad de incubación. Platina del microscopio climatizada (1), flujo etapa con en - y hacia fuera - flujo de CO2 (2), una sonda de2 CO (3) y un parche de cierre (4). Barra de escala: 2 cm. C) imágenes cámara en la unidad de incubadora, como se ha visto bajo el microscopio. D) macro de la serie y tiempo. E) equipo para la proyección de imagen. Invertido microscopio (1), luz fluorescente (2), informática (3), calentador de anillo (4, insertar) y controlador (Figura 4, principal), tubería de flujo de CO2 (5), CO2 válvula (6), controlador de CO2 (7), CO2 humidificador (8), O la válvula2 y regulador (9) y regulador de temperatura de la etapa (10). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
Figura 2: esquemática de los parámetros de microscopio en protocolo sección 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
Figura 3: investigando la captación a corto plazo de dox y Dox-NP.  Células BLM fueron expuestas continuamente a dox o Dox-NP 3 h, y un time-lapse fue tomado. (A) fotografías de Time-lapse de las células que se incubaron con dox. (B) fotografías de Time-lapse de las células se incubaron con Dox-NP. Barra de escala = 50 μm. (C) píxeles densidad aumento de DXR nuclear en células tratadas dox y con Dox-NP. (D) aumento de densidad de píxeles de DXR citoplasmática en células tratadas dox y con Dox-NP. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
Figura 4: investigar la absorción a largo plazo de dox y Dox-NP en diferentes líneas celulares. Las células fueron expuestas a dox o Dox-NP e imagen 24 h más tarde. Imágenes fueron tomadas inmediatamente después del retiro de las drogas, con 3 diferentes ganancias. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
Figura 5: investigar la absorción celular y liberación de agentes liposómicos. Las células fueron expuestas continuamente a Dox-NP durante 24 h, y un time-lapse fue hecho. (A) imágenes fijas de los time-lapse. Barra de escala = 50 μm. (B) píxeles densidad aumento de DXR en el núcleo y el citoplasma. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. Imágenes (C) demostrar la localización de DXR dentro de la célula. Línea sólida: membrana celular, línea punteada: núcleo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
Figura 6: investigar la localización de drogas y portador en líneas celulares diferentes. (A) las células fueron expuestas a Dox-NP/24 h y reflejadas. Barra de escala = 50 μm. (B) las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo/CF-PE durante 24 h y reflejadas con una ganancia de intensidad baja para distinguir las vesículas individuales. (C) el campo brillante y DXR superposición mostrando DXR en vesículas citoplasmáticas (flecha). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
Figura 7: investigación de la localización intracelular de la droga y portador de. Las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo o CF-PE/lo hizo por 24 h, y lisosomas se visualizan mediante el marcador lisosomal de células vivas (LM) en color verde o rojo. (A) localización intracelular de DXR y el portador (lo hizo). Las flechas representan 3 ejemplos de DXR e hicieron localizadas en el lisosoma. Barra de escala = 50 μm. (B) análisis co-localización de DXR y el portador (hizo) en los lisosomas (LM) con ImageJ. (C) porcentaje de co-localización de DXR y el portador en los lisosomas. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos individuales. (D) el secuestro Lysosomal del portador había visualizado usando dos diferentes marcadores. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
Película 1: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con dox para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
Película 2: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
Película 3: relacionados con Figura 5 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>objetivo vi"="_blank"&gt; haga clic aquí para ver este video. (Clic para descargar).
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
Movie 4: relacionados con Figura 5 : 1F6 células fueron incubadas con Dox-NP durante 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
Movie 5: relacionados con Figura 7 : Lisosomas de B16BL6 células fueron teñidas con un marcador de células vivas. Time-lapse: 10 imágenes, con un intervalo de 10 s. tarifa de marco: 3fps. Barra de escala = 50 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)</a>

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Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

8.4K vistas.  Erasmus MC. Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Un procedimiento adecuado para evaluar la<em&gt; En Vivo</em&gt; Rendimiento de cáncer Nanomedicinas

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Bioingeniería

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Inmunología e Infección

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Resumen

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Un procedimiento adecuado para evaluar la