Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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Este trabajo fue realizado con el apoyo de una beca, 5R21HD080684-02, del Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano. El autor desea dar las gracias a Ken Cho por su constante entusiasmo y apoyo. El autor agradece también a Bruce Blumberg para uso de su cámara, Rebeca Charney, para la lectura crítica del manuscrito y Sean McNamara y Marcin Wlizla en el recurso nacional de Xenopus (RRID:SCR_013731), por la valiosa conversaciones sobre X. tropicalis de alimentación y los regímenes de cuidado de los animales.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, Irvine.
1. preparación para el trasplante del PGC
<ol><li>Prepara con antelación, herramientas de disección como se describió anteriormente23. Nota: Cuchillos de pelo de la ceja se utilizan para hacer incisiones con la ayuda de un lazo del pelo para estabilizar el embrión mientras se realizan las cirugías. Pelos de la ceja y bucles de cabello pegados en el vidrio de borosilicate Pipetas Pasteur primero dibujadas en una llama y rotos en la porción adelgazada (vea la figura 1A, punta de flecha) para crear una punta más corta y más estrecha (figura 1B) para una mayor destreza Cuando se realizan cirugías.</li>
	<li>Generar sgRNAs con procedimientos previamente descritos24 . Nota: Brevemente, corta plantillas de la DNA que codifica para sgRNAs se crean utilizando deoxyoligonucleotides superpuestos que contienen 5' promotores de bacteriófago T7, que se recuecen y "rellena" por una ADN polimerasa termoestable, libre de errores. Se incuban in vitro reacciones síntesis sgRNA durante varias horas hasta toda la noche (según el kit utilizado). Las reacciones son tratados con DNasa para quitar la plantilla. Los sgRNAs son purificados por métodos estándar de fenol/cloroformo extracción y amonio acetato/isopropanol precipitación, según instrucciones24 del fabricante kit.</li>
	<li>Poco antes de la realización de microinyecciones, preparar Cas9 sgRNA complejos por primera desnaturalización ~ 250 ng de sgRNA en un volumen total de 3 μl de Rnasa-libre (Tratado diethylpyrocarbonate) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de un enfriamiento rápido con hielo durante 5 minutos. Centrifugue el sgRNA durante unos segundos, añadir 1 μl de proteína de Cas9 de 1 μg/μl e incubar 10 min a 37 ° C para promover la formación de complejos. Nota: Después de la incubación, el tubo puede conservarse en hielo mientras se preparan los embriones para microinyección.</li>
	<li>Obtener X. tropicalis de embriones por fertilización in vitro usando métodos estándar, como se describió anteriormente25. La jalea25,26 los embriones en fertilización después de 10 minutos. Nota: El tiempo de fertilización se considera el tiempo después de la suspensión de esperma se agrega a los huevos y el plato se inunda de 1/9thX modificado timbres (MMR)26 de Marc. Para X. tropicalis25, a diferencia de X. laevis, realizar la-jellying en 1/9 x MMR que contiene 3% cisteína libre base (no la sal del ácido clorhídrico), pH ajustado a 7,8-8,0, seguida de múltiples lavados en 1/9 x MMR. Transfiera los embriones a una agarosa (1%)-plato recubierto que contiene 1/9 x MMR a temperatura ambiente.</li>
	<li>Inmediatamente transferir los embriones que se inyecta a un plato cubierto de agarosa 1%, que contiene 1 x MMR con una pipeta Pasteur.</li>
	<li>
Inyectar en la etapa de 1 célula. Ver referencias26,27 para descripciones detalladas de los métodos de microinyección de Xenopus .
	<ol>
<li>Inyectar cada embrión en un solo lugar en el polo animal, con 4 nL Cas9 sgRNA complejo (cantidad final = 1 ng de Cas9 y ~ 250 pg de sgRNA; véase la discusión)24. Después de 10-20 min de la curación de sitio de inyección, transferir los embriones a un plato cubierto de agarosa que contiene 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. También crear un plato de uninjected hermano embriones que servirán como receptoras de injerto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar placas de Petri (60 mm) que contienen un ~ 5 mm-capa de agarosa al 1% en 0.3 x MMR, si haciendo trasplantes en X. tropicaliso 1 x MMR para X. laevis.
	<ol>
<li>Crear depresiones ~ 3-4 mm profundidad insertando un 3-x 4-well molde (creado por cortar una placa de PCR de 96 pocillos) en la agarosa fundida al verter a las placas (ver figura 1 y D). Sujete el molde varios milímetros por encima de la parte inferior de la caja Petri con una pinza unida a un soporte de anillo hasta que la agarosa se ha endurecido.</li>
		<li>Además, hacer una placa de 24 pocillos a los embriones individuales casa cubriendo los pozos con una fina capa de agarosa al 1% en 1/9 x MMR. Nota: El medio de cultivo a estos pozos es de 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. trasplante de PGCs
<ol><li>Cuando los embriones alcanzan sólo Nieuwkoop y Faber28 blastula etapa 9 (figura 2A), ~4.5 h después fertilización (hpf) de X. tropicalis, quite de la incubadora de 25 ° C y permite que se equilibren a temperatura ambiente durante 0.5 h.</li>
	<li>Para comenzar el trasplante en 5 hpf (figura 2B), utilice una pipeta Pasteur transferir un embrión de donante PGC (inyectado con Cas9 sgRNA) al plato de agarosa de 60 mm que contiene depresiones (creadas en el paso 1.7) en 0.3 x MMR (o 1 x MMR si utiliza X. laevis). También transferir un embrión de uninjected hermano, el receptor del injerto, para este plato. Nota: Es crítico que las identidades de cada uno de esos embriones no se confunden.</li>
	<li>Manualmente quitar el vitelinas sobres de cada embrión con unas pinzas y girar ambos embriones de forma que su polo vegetal esté en la vista y accesible para la cirugía. Nota: Una descripción de manual de-vitellination de embriones ha sido previamente descrito26.</li>
	<li>Con la punta afilada de un cuchillo de pelo de la ceja, hacer cuatro incisiones poco profundas en la forma de un cuadrado en el polo vegetal del embrión receptor, dentro de la zona donde se forman células botella futuro que marcan el blastopore. Hacer las incisiones insertando la punta de la cuchilla de pelo de la ceja en el embrión, justo debajo de la superficie y hacer cortar hacia arriba los movimientos mientras se estabiliza el embrión con el lazo del pelo. Nota: La figura 2 muestra un embrión vegetales vistas en intervalos de media hora de 4.5-7.0 hpf para mostrar el tamaño de celda y proporcionar una guía para estimar donde las células de botellas que forman (círculo blanco discontinua). El objetivo es hacer incisiones donde se indica la caja negra punteada.</li>
	<li>Una vez que los cuatro lados de la Plaza están delineados por incisiones, profundizar cada incisión con el cuchillo de pelo de cejas usando movimientos de corte similar para llegar a una profundidad de aproximadamente 1/3 a 1/2 de la distancia al suelo del blastocoel.</li>
	<li>Libre de los explantes de tejido vegetal del embrión receptor (Figura 3A y B) haciendo una horizontal (paralela a la superficie vegetal) cut(s) en la región vegetal profundo. Nota: El tamaño de explante vegetal que contiene el PGC es aproximadamente 0.4 0.45 mm por lado y 0.25-0.3 mm de profundidad. Este explante vegetal del embrión receptor ya no es necesario y por lo tanto debe ser apartar a ser desechada.</li>
	<li>Trabajando rápidamente, repita este procedimiento (pasos 2.4-2.6) en el embrión de donante PGC para crear un fragmento de tejido vegetal de tamaño similar para el trasplante. Nota: Es importante llevar a cabo esta segunda disección con poco retraso para minimizar el tiempo para el embrión receptor sanar su herida abierta.</li>
	<li>Una vez que se extirpa el tejido que contiene PGCs del embrión donante, utilice el lazo de cuchillo y pelo de ceja pelo para mover este explante en posición en la abertura que se crea en el embrión de la receptora. Nota: La superficie interior del injerto donante debe estar hacia el interior del embrión receptor. No es necesario para que coincida con las orientaciones de los ejes del injerto con el embrión receptor dorsal-ventral y de izquierda a derecha.</li>
	<li>Utilice el borde largo del eje de la cuchilla de cejas cabello, cabo paralelo a la superficie del injerto, para presionar suavemente el injerto en la abertura de la superficie vegetal del embrión receptor.</li>
	<li>Una vez que se ha colocado el injerto, use un hairloop o el mango de un cuchillo de pelo de la ceja se deslice suavemente el "cadáver" del embrión donante a través de la superficie de agarosa y en una depresión de agarosa. Asegúrese de que la herida abierta de la carcasa encuentra en el líquido a granel. Si no es así, utilice el cuchillo de pelo de la ceja para girar el embrión para conseguir esta orientación.</li>
	<li>Deslice el embrión receptor, con el injerto de curación en el lugar, en una depresión adyacente y además Asegúrese de que el tejido injertado poste vegetal encuentra en el líquido a granel.</li>
	<li>Repita este procedimiento (pasos 2.1-2.11) con otro par de donantes y receptores embriones para crear otro par de trasplante/canal; la transferencia de éstos a las depresiones vacías. Nota: Es crítico que se hacen anotaciones para el seguimiento de los pares coincidentes de canales y rodamiento de trasplante de embriones. Los cadáveres de donantes se utilizará como un proxy para la eficiencia de mutagénesis inducida por sgRNA Cas9 en las PGCs trasplantadas, que no pueden ensayarse fácilmente hasta los animales del cojinete de trasplante alcanzan la madurez sexual (vea el paso 3.3, a continuación y la discusión ).</li>
	<li>Seguir haciendo trasplantes hasta que los embriones alcancen la etapa de gástrula temprana aproximadamente 10, que es aproximadamente 6.5 hpf en X. tropicalis (ver Figura 2E).</li>
</ol>3. la cura cuidado de embriones
Nota: Injertos de sanan en su lugar dentro de ~ 30 min, y es normal observar algunos restos yolky de lisis celular lleno del embrión (figura 3).
<ol><li>
Una vez curado, utilice una pipeta Pasteur a los embriones de transferencia muy suavemente de las depresiones en los pocillos de una placa de 24 pocillos recubiertos de agarosa. El exudado sea eliminado (Figura 3D) por el líquido de mezcla durante la transferencia.
	<ol>
<li>Gire los embriones que se encuentran vegetales poste hacia arriba, hacia la solución a granel. Otra vez, coloque los cadáveres donantes e injerto destinatarios en pozos adyacentes para ayudar a mantener un registro de parejas de embrión; registrar esta información.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La transferencia de la placa de 24 pocillos que contienen embriones en una incubadora de 25 ° C para la cultura durante la noche. Nota: Al día siguiente, los embriones habrán alcanzado las etapas tailbud.</li>
	<li>Mueva los recipientes del injerto para limpiar placas de 6 pozos recubiertos de agarosa que contiene 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL, con 1 embrión por pozo. Mantener un registro claro de cadáveres donantes que coincidan con estos receptores de injerto.</li>
	<li>Evaluar la eficiencia de mutagénesis por secuenciación PCR amplicones5,17,24 o mediante otros métodos que dependen de amplicones de PCR (ver discusión), hacia canales individuales tubos de tira PCR de 0,2 mL. Eliminar la mayor parte del medio y homogeneizar en 100 μl de buffer de lisis24 con proteinasa K (PK) por repetidos altibajos el pipeteo con una pipeta de P200.</li>
	<li>Realizar el embrión lisis24 a 56 ° C por 6 horas hasta toda la noche para permitir la digestión de PK. PK de inactivar por calentamiento a 90-95 ° C durante 10 min, seguido de un enfriamiento rápido a 4 º C. Utilizar lisados sin más pasos de limpieza para las reacciones de PCR para obtener amplicones corto directo ADN Sanger secuenciación24la semilla. Tienda los lisados a-20 ° C. Nota: Dentro de varios días, los renacuajos alcanzarán alimentación etapas (etapa aproximadamente de 45-46) y se pueden alimentar una suspensión de polvo planctónico (sera Micron).</li>
	<li>Después de ~ 1 semana, con cambios diarios del medio de cultivo para mantener la limpieza y minimizar la proliferación microbiana, hacia los renacuajos pequeños tanques en un sistema acuático circulando con flujo de goteo. Utilizar los datos de secuenciación para segregar los renacuajos con altamente eficiente mutagenized PGCs de renacuajos con más baja eficiencia de mutagénesis. Una vez completada la metamorfosis, hacia las ranitas del sistema acuático adultos en el laboratorio. Nota: Los regímenes desarrollados por el recurso nacional de Xenopus (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) proporcionan a una guía de alimentación29 y rana adulto mantenimiento30de renacuajos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Este informe proporciona un protocolo detallado para el trasplante de tejido vegetal que contiene PGCs. trasplante de PGCs se utiliza en conjunción con las tecnologías de la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9) para modificar la línea germinal de un animal mientras mantenimiento de casi todos los tejidos somáticos como genéticamente tipo salvaje. Para evitamos para tener éxito, hay una serie de factores críticos a tener en cuenta antes de realizar realizar trasplantes.
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Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo1, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigación en Xenopus ha utilizado la rana tetraploide, X. laevis, pero más recientemente, debido a su Diploidia, X. tropicalis ha sido desarrollado como un modelo genético de anfibios. Se han reunido las secuencias completas del genoma de ambas especies de Xenopus 2,3. La "comunidad de rana" está ahora en un punto de inflexión donde tecnología de la modificación básica del genoma permite el estudio de la función del gene, prácticamente a voluntad. Endonucleasas CRISPR/Cas9 programables han hecho que la mutagénesis de genes altamente eficientes, con mutación de biallelic posible en la mayoría de las células de los animales4,5,6,7, 8,9,10,11. Estos estudios, puesto de relieve por Bhattacharya et al. 12 y Shigeta et al. 13, han demostrado que la función de muchos genes puede estudiarse mediante mutagénesis en animales de mosaico F0 . Este enfoque tiene muchas ventajas; sin embargo, los embriones microinyectados Cas9-sgRNA a menudo Mostrar fenotipos variables debido a la incompleta pérdida de la función (LOF). Más significativamente, la generación de líneas mutantes es altamente ventajosa para algunas aplicaciones, en particular, al estudiar los genes que tienen una contribución materna del mRNA. Materna mRNAs y proteínas y sus influencias en la epigenética, persisten durante un período prolongado en embriogénesis14,15,16, haciendo las aportaciones del desarrollo tempranas de muchos genes refractario a los análisis de0 F. Por lo tanto, se necesitan otros enfoques LOF.
A la hora crear líneas mutantes, el camino a la obtención de embriones homocigóticos de LOF tiene varios obstáculos. Mutagénesis en primer lugar, eficiente para producir mutaciones biallelic puede ser una desventaja debido a pérdida de las funciones del gen esencial en el fracaso para sobrevivir hasta la madurez sexual, interfiriendo con la producción de una línea viable. Una solución común es la valoración cuidadosa de la cantidad de Cas9-sgRNA entregado. Aquí, el objetivo es lograr un equilibrio entre la reducción de la mortalidad mientras que también maximiza la eficiencia de mutagénesis del germline. Un segundo problema surge a partir del esquema de cría estándar, donde análisis fenotípicos se difieren hasta la generación de2 F. Utilizando el enfoque estándar, maduran sexualmente animales de0 F que transmiten a mutante alleles a través de la línea germinal son cruzadas para producir F1 heterocigoto "portadores", que luego crecen hasta la madurez sexual. Dos heterocigotos1 de F entonces se entrecruzan para producir embriones mutantes de F2 a una frecuencia mendeliana esperada del 25%. Así, dos generaciones de cría son necesarias para el análisis de los fenotipos mutantes. Animales mutantes podrían ser homocigotos o heterocigotos compuestos (es decir, progenie que contiene dos diferentes alelos del mutante, que depende de los genotipos de los padres animales utilizados en los intercross de1 F).
Estos obstáculos pueden superarse por confinamiento programable mutagénesis mediada por la nucleasa a las células de germen, que es la base de un nuevo método llamado saltar17. Leapfrogging tiene dos componentes principales: (1) la microinyección de mRNA Cas junto con sgRNA o nucleasa-sgRNA complejos (o de las nucleasas de dedos de principio, TALENs o zinc) en la etapa unicelular a eficientemente mutagenize genoma embrionario, seguido por (2) el trasplante de PGCs en embriones de tipo salvaje hermano, donde se eliminaron las PGCs endógenas. Puede obtenerse cuando ambos pasos son reemplazo del germline eficiente, completo con las células de germen mutantes. Blackler demostró en la década de 1960 que Xenopus PGCs podrían trasplantarse entre embriones con la neurula tarde y temprano tailbud etapas18,19. Para leapfrogging, enfoque de Blackler fue modificada mediante la realización de los trasplantes en el blastula etapa17, cuando PGCs se localizan en el polo vegetal del embrión20,21. Trasplante antes de la gastrulación tiene dos ventajas principales. En primer lugar, el engraftment de trasplantes y el posterior desarrollo normal fue encontrado para ser más eficiente cuando el trasplante se realiza en la fase de blástula (observaciones no publicadas). En segundo lugar, realizando trasplantes de blastula etapa poco después transcripción cigóticos ha comenzado, uno puede evitar la letalidad resultantes del desarrollo gene mutaciones que afecten la gastrulación u originar malformaciones neurulae finales. PGC trasplante-cojinete ("saltaba") embriones son cultivados a la madurez sexual, y intercrosses entre estos F0 de animales han demostrado que, en muchos casos, 100% de la progenie de1 F muestran el fenotipo LOF (la mayoría siendo compuesto los heterocigotos), indicando la sustitución completa del germline con mutaciones específicas.
Se espera que evitamos acelerará enfoques genéticos en Xenopus. Evitamos también proporciona una alternativa al método de "transferencia de acogida"22 para el análisis de genes de efecto materno (observaciones no publicadas) de LOF. En la publicación actual, se presenta una descripción detallada del método, centrándose especialmente en el trasplante del PGC, en X. tropicalis (con pequeñas modificaciones para X. laevis). El trasplante de PGCs se demuestra aquí para facilitar a una transferencia más rápida de esta tecnología a otros laboratorios que trabajan con Xenopus. Los principios de este método deben ser exitosos en otros anfibios (e.g., tritones), y específicas del organismo modificaciones en la metodología deben permitir para el uso de muchos otros animales en el que se puede lograr eficiente mutagénesis y PGCs son fácilmente transplantables.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

La creación de líneas mutantes por la edición del genoma está acelerando el análisis genético de muchos organismos. CRISPR/Cas9 métodos han sido adaptados para su uso en la rana con garras africana, Xenopus, un organismo modelo de larga data para investigación biomédica. Esquemas tradicionales para la creación de líneas homocigóticas mutantes con mutagénesis CRISPR/Cas9-objetivo tienen varios pasos lentos y laboriosos. Para facilitar la creación de embriones mutantes, particularmente para superar los obstáculos asociados a la anulación de los genes que son esenciales para la embriogénesis, se desarrolló un nuevo método llamado leapfrogging. Esta técnica aprovecha la solidez de Xenopus embriones para "cortar y pegar" métodos embriológicos. Leapfrogging utiliza a la transferencia de células de germen primordiales (PGCs) de embriones de donante mutagenized eficientemente en ablación de PGC wildtype hermanos. Este método permite la eficiente mutación de genes esenciales creando animales quiméricos con células somáticas de tipo salvaje que llevan un mutante del germline. Cuando dos animales de0 F portadores de "saltarse los trasplantes" (es decir, células de germen mutante) se cruzan, producen homocigóticos o compuestos heterozigóticos, nulos F1 embriones, ahorrando así un tiempo de toda una generación para obtener datos fenotípicos. Evitamos también proporciona un nuevo enfoque para el análisis de genes de efecto materno, que son refractarios a F0 fenotípica análisis CRISPR/Cas9 mutagénesis. Este manuscrito detalla el método de leapfrogging, con especial énfasis en cómo realizar con éxito trasplantes de PGC.

Después del trasplante, la determinación cualitativa de la eficacia de la mutagénesis CRISPR/Cas9 debe realizarse antes de gastar el esfuerzo en la cría de animales para crecer y mantener los animales a la madurez sexual. Porque animales portadores de trasplantes de leapfrog son somáticamente wildtype y la línea germinal es de difícil acceso para la medición directa, guardar los cadáveres de embriones de donante se convierte en importante. Análisis de ADN de los cadáveres actú...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K vistas.  University of California, Irvine. Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genética

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biología

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La producción de transgénicos Xenopus laevis Integración mediada por la enzima de restricción y transferencia nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

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La manipulación y

Celular-como Stem

Clonación funcional utilizando una