Los autores desean expresar su agradecimiento miembros del laboratorio de Houston para la lectura crítica del manuscrito. La investigación es financiada por los Institutos Nacionales de Salud (GM083999) otorgó a DWH

1. La extirpación quirúrgica de tejido ovárico <ol class="lalpha"><li> Preparar un nuevo lote de medio de cultivo de ovocitos (OCM; Materiales), entre 400-800 ml, dependiendo del tamaño del experimento. Ajustar el pH a 7,6-7,8, hasta que el rojo fenol se vuelve un color rojo oscuro (seis o más gotas de NaOH 5 N). Vierta una pequeña cantidad para comprobar el pH en un tubo separado desde el electrodo de pH pueden contaminar los medios de comunicación. OCM deben ser almacenados a 18 º C y utilizarse dentro de una semana. </li><li> Seleccione 3-5 hembras y un lugar en ~ 2L buffer solución anestésica (Materiales). Tratamos de evitar el uso de las ranas que se alimentan en el día de o antes de la cirugía. Mientras que la rana es sucumbir a la anestesia, desinfecte el área quirúrgica con un 70% EtOH y preparar los instrumentos quirúrgicos. </li><li> Esterilizar los instrumentos quirúrgicos en 20 segundos de inmersión en un esterilizador de cuentas en caliente a 250 ° C. Los siguientes instrumentos se debe a la mano: bisturí (# 3) y la cuchilla (# 10 o 11), varios pares de Dumont pinzas, tijeras iris Bonn (curvo o recto), Halsey o Olsen Hegar porta-agujas micro, y las suturas. Coloque los instrumentos esterilizados en una placa de Petri estéril o en el interior del paquete de sutura para mantener estéril. Sujete la aguja en el soporte de la aguja en la orientación deseada antes de comenzar. Preferimos Olsen Hegar porta-agujas ya que el mango contiene las hojas de tijera, que se pueden utilizar para recortar puntos de sutura, sin instrumentos de cambio. </li><li> Después de 10 minutos, comprobar que un plano quirúrgico de anestesia que se ha logrado. Ranas anestesiados dejará de moverse y no responde a una pizca dedo del pie o de ser entregado. La anestesia debe durar 15 minutos, que es tiempo más que suficiente para realizar las operaciones. Don quirúrgica vestimenta adecuada. Esto puede incluir guantes limpios (sin látex), batas y máscaras quirúrgicas, dependiendo de las preferencias personales e institucionales, pautas para el cuidado de los animales. </li><li> Nota sobre la técnica aséptica: secreciones rana piel contienen péptidos antimicrobianos que generalmente reducen la incidencia de la contaminación durante la cirugía, a pesar de la técnica aséptica se deben seguir tanto como sea posible. Paños quirúrgicos se pueden utilizar, pero no puede ser requerido por IACUC institucional y no puede proporcionar muchos beneficios. Por lo general &quot;la punta técnica&quot; que se utiliza, donde las manos se toquen las puntas estériles del material de sutura instrumentos, o sitio de la incisión. Los instrumentos se pueden esterilizar (en el esterilizador de cuentas) incisión después de la piel, y un área estéril debe mantenerse en la mesa de trabajo para los instrumentos de la colocación (por ejemplo, una placa de Petri o un paquete de sutura). Requisitos institucionales pueden diferir de manera significativa, así que por favor siga las pautas de sus instituciones y reciben instrucción adecuada antes de realizar cirugías. </li><li> Retire la rana de la anestesia y el lugar en decúbito dorsal sobre una cirugía húmeda limpie. Tenga en cuenta. La piel puede ser limpiado por lavado de yodo povidona diluida (1:20) o clorhexidina (0,75%). Sin embargo, evite comerciales lavado quirúrgico, los jabones y el 70% de alcohol isopropílico, ya que pueden dañar la delicada piel de los anfibios. </li><li> Utilizando unas tijeras iris bisturí o pequeño, hacer un pequeño (1 a 1,5 cm) incisión en la piel en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media. Incisiones posteriores sobre la misma rana se debe realizar en lados alternos, bien separados uno del otro. Las incisiones se pueden hacer en forma paralela o perpendicular a la línea media. </li><li> Hacer que la piel y las incisiones abdominales del músculo en dos etapas. Después de cortar la piel, elevación de la capa muscular y los alrededores de color blanco fascia con pinzas y hacer la incisión en el músculo planteadas. Usar tijeras y cortar hacia abajo, tratar de hacer un corte rápido para exponer la cavidad del cuerpo dejando los bordes limpios herida. Si sólo la fascia se corta, se retrae y se hace más difícil la sutura. Levantamiento de los músculos le ayudará a evitar que sin querer herir a cualquiera de los órganos internos. Además, trate de evitar el corte a través de cualquier corazones linfáticos visibles o los vasos sanguíneos dentro de las capas musculares. Ampliar la longitud con una tijera de la incisión para que el ovario se pueden arrancar fácilmente a través. </li><li> Ovario deben ser claramente visibles una vez hecha la incisión. Para obtener el ovario, tome con pinzas y externalizar el tejido ovárico. La cantidad deseada de tejido, y recorta en el nivel de la pared del cuerpo. No rellene el tejido en la cavidad celómica, ya que esto podría ser una fuente de infección u otras complicaciones. </li><li> Inmediatamente observar un pequeño trozo de ovario en un microscopio y un defolliculate pocos ovocitos para probar su calidad. Se debe ser firme y de tamaño uniforme y la coloración. Si son aceptables, eliminar la cantidad deseada de tejido ovárico y la sutura de la incisión. Suficiente para llenar una caja de Petri de 90 mm es suficiente para la mayoría de los experimentos. Si los ovocitos son de dudosa calidad, la sutura de la rana y repetir con una mujer diferente. </li><li> Cerrar la incisión suturando el músculo y la capa de fascia en primer lugar. Inserte el n<html> Eedle unos pocos milímetros lateral de la incisión, asegurándose de que pase a través de la capa de la fascia también. Suturas sólo a través del músculo puede desgarrar el tejido y se suelte. El uso de fórceps para ayudar a insertar la aguja desde abajo en el lado opuesto de la incisión. Liberar y volver a agarrar la aguja desde el exterior del cuerpo y tirar de la sutura a través de hasta varios centímetros o menos de la cola se mantiene, teniendo cuidado de no tirar de él hasta el final. </li><li> Cerrar la herida con un patrón simple de sutura interrumpida. Nosotros usamos un empate instrumento básico para hacer nudos cuadrados cirujano (nudos de arrecife). Pase el extremo largo de la sutura alrededor del soporte de la aguja, sujete la cola y tire de ella a través del lazo hacia usted y apriete. Lazo y tire a través de nuevo, esta vez sacar el porta-agujas lejos de ti. Un tercer lanzamiento se puede utilizar para aumentar la seguridad (en la misma dirección que el primero). Recorte de la sutura, dejando la cola corta y hacer otra sutura en el músculo de unos pocos milímetros de distancia. Dos puntos de sutura son suficientes para pequeñas suturas, tres de los más grandes. Repita el procedimiento para la capa de la piel. Demostraciones en video de la técnica de sutura básicos están disponibles en YouTube - búsqueda de &quot;empate instrumento&quot;, hay un buen número para elegir, aunque la técnica básica es la misma. </li><li> Enjuague la hembra con agua destilada y colocarla en un balde lleno de recuperación de frío (18 ° C). Mientras que en el laboratorio, las ranas se mantienen en el agua del grifo tratada con Amquel para eliminar las cloraminas. Cada pocos minutos, levante suavemente la rana en el agua y buscar tragar o movimientos de ojo saltón, indicativo de la recuperación de la anestesia. </li><li> Nota: La cirugía de la supervivencia no es estrictamente necesario para obtener tejido ovárico, aunque las mujeres se siguen produciendo ovocitos después de un buen número de operaciones. Realizar la cirugía de supervivencia también se reducirá el número de animales utilizados. Asegúrese de seguir las pautas de su unidad de cuidado de los animales vertebrados en los métodos de supervivencia de la cirugía, el cuidado post-operatorio y el seguimiento y el número de cirugías permite a un individuo. </li></ol> 2. El cultivo de ovocitos y Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Justo después de terminar la cirugía, subdividir el ovario en trozos pequeños (~ 2 cm 2) y guardar en OCM fresco, con 5-6 piezas por caja de 90 mm. Lóbulos individuales de ovario son a cielo abierto, aplanado y corte en trozos cuadrados. Estos se lavan en OCM limpia y se coloca en los platos de la cultura. Aplanamiento y dividir el ovario va a extender su vida en la cultura y hacer más fácil defolliculation. </li><li> Mover un lóbulo de un plato pequeño de OCM y de forma manual defolliculate 300-500 ovocitos. Transferencia de ovocitos utilizando una aguja estéril, pulido al fuego pipeta. Hemos encontrado que el uso de la variedad de algodón conectado es esencial para minimizar la contaminación de los cultivos. Tienda de los ovocitos a 18 ° C en 8 ml OCM (en medio de los platos (Falcon 1007)) en grupos de 100 a 150. Con la práctica, debe ser capaz de defolliculate ovocitos suficiente en 1-2 horas. Ovocitos Collagenased no son adecuados para la transferencia de sede, ya que no se puede fertilizable. </li><li> Defolliculating método. Nos defolliculate el uso de fórceps relojeros &quot;(Dumont # 4 o # 5 años, Herramientas de Bellas Ciencia), siguiendo los métodos básicos que se describen en Smith et al., (1991). Usando un par de pinzas (en su mano dominante), agarrar la capa de teca tejido conectivo que rodea un ovocito totalmente crecido etapa VI, cerca de donde el folículo está unido al ovario (el tallo). Con el otro par de pinzas, sujete el ovario adyacente a la primera pareja. Ligeramente rasgar la capa del folículo tirando a través de los ovocitos. Suavemente burlarse de los ovocitos de los tejidos. Ovocitos con éxito defolliculated se floppier que los ovocitos sólo logró sin la eliminación de la capa del folículo y se carece de vasos sanguíneos visibles. </li><li> Nota: es esencial para mantener una presión muy leve en las puntas de la pinza, apenas suficiente para las puntas de cumplir. Agarre demasiado fuerte es común entre los principiantes y se traducirá en el ovocito se apartó con el folículo intacto. Mantenga un buen par de pinzas en exclusiva para defolliculating. Los consejos deben cumplir con precisión y debe ser un poco más contundente que la pinza para la toma de explantes de embriones de Xenopus (Figura 1). </li><li> De manera rutinaria la prueba maduros alrededor de 20 con la progesterona y abortar el experimento, si el ritmo de maduración es pobre (&lt;50% después de 6-7 horas a temperatura ambiente). </li><li> En este punto, los ovocitos pueden ser manipuladas y cultivadas como se desee, tales como la microinyección de oligo, morfolino o ARNm. Los procedimientos de inyección variar según el laboratorio, por lo que no se describen los que están aquí. Los ovocitos se puede mantener hasta por una semana en la OCM, pero en general la salud declina así que lo mejor es utilizarlos para la transferencia de un plazo de 96 horas de aislamiento. </li><li> Tenga en cuenta que sólo entre cinco y seis grupos (incluido el control) puede ser transferido a una sola hembra, debido a las limitaciones de colorantes vitales, por lo que planificar sus experimentos en consecuencia. </li></ol>&quot;&gt; 3. Maduración de ovocitos y la estimulación de mujeres anfitrionas <ol class="lalpha"><li> Si se realiza un rescate de agotamiento de oligo, inyecte el ARNm (generalmente 50-300 pg de ARN) ~ 24-48 horas después del oligo. Los oligos se han degradado en ese momento y no debe afectar a la ARN inyectada. </li><li> En la tarde antes de realizar la transferencia, añadir 16 l de solución de progesterona de trabajo (de 1 mm de EtOH) a los ovocitos en el OCM 8 ml en placas de medio (concentración de progesterona final es ~ 2 M). Incubar 10-12 horas a 18 ° C para permitir la maduración de los ovocitos. </li><li> Inyectar 3-5 hembras con 1000 unidades por la rana de hCG para inducir la puesta de huevos. Nuestros experimentos parecen funcionar mejor si la maduración de ovocitos y la inyección de hCG se realizan al mismo tiempo, unas 12 horas antes de la implantación en el receptor (por ejemplo, 22:00 PM -10). Deja las mujeres a temperatura ambiente y 18 ° C durante la noche. </li></ol> 4. Preparación y tinción colorante vital de ovocitos <ol class="lalpha"><li> En la mañana de la transferencia, permiten ~ 45-60 para configurar y realizar el procedimiento. En este punto, los ovocitos maduros pueden ser congelados para su posterior análisis de la eficacia de la caída del mRNA o la expresión de proteínas. Además, comprueba que los ovocitos no se han infectado y que hubo una tasa de buena maduración (&gt; 50%). Oocitos infectados no van a fertilizar. Descongele los colorantes vitales (materiales) y giran a velocidad máxima durante 5 min. </li><li> Color de los diferentes grupos experimentales mediante la adición de 80 l del colorante apropiado vital (s) a los platos de los ovocitos y se incuban con la oscilación de 15 &#39;. Durante este tiempo, seleccione una mujer de acogida y comenzar la anestesia. Elija una rana que poco a poco va poniendo los huevos normalmente o que produce huevos con abundante apretando suave. Los huevos del huésped debe ser de buena calidad. Evite las hembras que están poniendo las cadenas de huevos o huevos aplastados. </li><li> La transferencia de los huevos de color a un plato grande de OCM fresco, remolino brevemente para lavar y dejarlos a un lado antes de la transferencia. </li><li> Prepare una pipeta Pasteur con un agujero lo suficientemente ancha como para dar cabida a un ovocito (alrededor de 1,5 mm) para su uso en el trasplante de los ovocitos. Puntuación de la pipeta con un lápiz de diamante y se rompen limpiamente. Fuego de uñas hasta que los bordes son lisos, teniendo cuidado de no derretir la abertura cerrada. </li></ol> 5. Realizar el trasplante de ovocitos <ol class="lalpha"><li> El trasplante de ovocitos utiliza los mismos procedimientos quirúrgicos como se describe en la Parte I, aunque en lugar de la eliminación de ovarios, oocitos manipulados se introducen en la cavidad del cuerpo con una pipeta. Idealmente, el proceso de transferencia debe realizarse lo más rápidamente posible y el tamaño de la incisión debe ser lo más pequeña posible. </li><li> Anesthesize la hembra de acogida y la elaboración de instrumentos quirúrgicos como se describe en la Parte I. Marca y la incisión como se describe en la Parte I. La incisión puede ser más pequeño, pero tiene que ser lo suficientemente grande como para caber el diámetro de la pipeta de transferencia (Figura 2). </li><li> Para trasplantar los ovocitos, captar y elevar un colgajo de músculo y fascia con pinzas y se introducen los ovocitos experimental con la pipeta Pasteur preparada anteriormente. Agite el plato de los ovocitos para reunirlas en el centro y aspirar la mayor cantidad posible. Permita que los oocitos de asentarse en el extremo de la pipeta para evitar el exceso de líquido que se introduce y inserte la punta de la pipeta en la incisión y permiten lentamente los ovocitos a llegar a la cavidad del cuerpo (Figura 2B). Repita hasta que todos los ovocitos han sido transferidos. No suelte la capa muscular en cualquier momento, hasta que haya comenzado la sutura, o los ovocitos se derrame fuera de la incisión. </li><li> Una vez que los ovocitos han sido transferidos, sujete ambos lados de la incisión con unas pinzas y ponerlos juntos, permitiendo que los ovocitos se asiente en la cavidad del cuerpo. Comience sutura como se describe, teniendo cuidado de mantener la tensión al alza sobre el músculo y la fascia hasta el primer nudo se ata (Figura 2C). Esto evitará que los ovocitos de ser expulsado y se permita que los bordes de la incisión para sanar de manera uniforme. Añadir otra sutura en la capa muscular / fascia y sutura de la piel. </li><li> Enjuague la hembra con agua destilada y colocarla en un balde lleno de recuperación de refrigeración (18 ° C) Amquel de agua tratada. Vigilar su recuperación de la anestesia que el anterior. Debe comenzar a poner huevos normalmente después de la operación. </li><li> Obtener los testículos de una rana macho con los procedimientos normales. Tienda de los testículos en el OCM o L15 hasta que sea necesario. Nosotros preferimos los testículos frescos al fertilizar experimentos de transferencia. </li></ol> 6. La recuperación de ovocitos in vitro y en la fertilización <ol class="lalpha"><li> Cilios peritoneal impulsará los huevos transferidos (normal y los huevos celómico del host) a las aberturas de los oviductos en la parte anterior de la cavidad del cuerpo. Huevos de color pueden ser recuperados a partir de 2-3 horas después de la transferencia apretando normal. Los huevos pueden ser obtenidos cada media hora o más hasta que la mujer deja de poner. </li><li> Fertilizar en una espesuspensión rm (en ~ 4 MMR ml 1x) durante 4 minutos. Inundaciones y enjuagar ampliamente con MMR 0.1x. Los huevos deben activar con normalidad y se empiezan a romper ~ 1.5-2 horas después de la fecundación. Huevos transferidos a menudo se rompen un poco más tarde que los huevos de acogida. </li><li> Retire las capas de gelatina con cisteína como embriones normales y ordenar en platos separados. Esto se puede hacer en cualquier momento, dependiendo de las necesidades del experimento. Es generalmente más fácil identificar los diferentes colores alrededor de la fase de 4 células, y más difícil durante las últimas etapas de blástula. La cultura de los huevos con una densidad baja (&lt;50 por plato mediano) en MMR 0.1x limpio. Desde este punto, los embriones pueden ser tratados y manipulados con normalidad. </li><li> Volver a las ranas a las instalaciones de los animales y vigilar las complicaciones durante los próximos días. </li><li> Método de fertilización alternativa, la puesta de huevos en un tampón de sal <ol class="lroman"><li> Después de la rana se ha recuperado de la anestesia, su lugar en ~ 1L alto contenido de sal MMR (1.2x). Deje que la hembra ponga los huevos en el buffer de alrededor de 4-6 horas. Apriete los huevos restantes a cabo, la fuga de MMR 1,2 x y clasificar huevos de colores en el plato limpio, eliminar todo el líquido posible. </li><li> Lavar exhaustivamente con MMR 0.3x y fertilizar en el volumen mínimo de 0.3x MMR / esperma suspensión hasta que los huevos activar (10 minutos). Inundaciones con MMR 0,1 x y la cultura que el anterior. Esta opción es útil si los huevos son necesarios en la misma etapa o si la extracción manual de los huevos de los daños de los ovocitos de donantes. </li></ol></li></ol>

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Iowa IACUC Comité.

Un éxito de la transferencia dará lugar a la fecundación y la división normal de&gt; 50% de los ovocitos (Figura 3). Generalmente entre 30-60% de los ovocitos transferidos sobreviven más allá de las etapas Néurula. Por lo general, la transferencia de ovocitos desde 75 hasta 150 por grupo experimental, que dará embriones suficiente para varios tipos de análisis (in situ, RT-PCR), así como visualizar el fenotipo. La implantación de ovocitos mucho más no parece aumentar considerablemente el rendimiento. Además...

Soluciones y recetas: OCM (ovocitos medio de cultivo modificado a partir de Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% L-15 de Leibovitz medio (que contiene L-glutamina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA, fracción V) </td><td> (Sigma A-9418-50 g) </td></tr><tr><td> 1x penicilina-estreptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajustar el pH a 7,6-7,8 con NaOH 5 N </td></tr><tr><td colspan="2"> Hacer nuevas tiendas cada semana, a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (solución modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM de CaCl2 </td></tr><tr><td> 10 mM de MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> ajustar el pH a 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Solución anestésica <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoico éster etílico del ácido (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / L de bicarbonato de sodio </td></tr><tr><td colspan="2"> Disolver en agua tratada con Amquel </td></tr><tr><td colspan="2"> Hacer fresco por semana </td></tr></tbody></table> Las poblaciones de progesterona <table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM de progesterona (Sigma P-0130) en el 100% de etanol </td></tr><tr><td> Diluir a 1 mM en EtOH al 100% de una población 500 veces / solución de trabajo </td></tr><tr><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Colorantes vitales (modificado de Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Azul: 0,1% del Nilo Azul A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Red: Red Neutral 0,25% </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 azul l + 80 l marrón), </td></tr><tr><td colspan="2"> Malva (80 + 80 l azul rojo l). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un color sexto, Orange (80 l rojo + 80 l marrón), también se puede utilizar, pero es a menudo difícil de distinguir de color marrón. </td></tr></tbody></table> Las existencias de azul, rojo y marrón se preparan en agua desionizada en tubos de 50 ml, se incubó durante 20 minutos con la oscilación y la hace girar en una centrífuga clínica. Los sobrenadantes se alícuotas en tubos de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Estudiar la contribución de las moléculas de herencia materna a la vertebración de desarrollo temprano a menudo se ve obstaculizada por el tiempo y los gastos necesarios para generar animales de la madre y el efecto mutante. Además, muchas de las técnicas para sobreexpresar o inhiben la función de genes en organismos tales como Xenopus y pez cebra no objetivo suficientemente crítica materna vías de señalización, como la señalización de Wnt. En Xenopus, la manipulación de la función de genes en ovocitos cultivados y su posterior fertilización puede mejorar estos problemas hasta cierto punto. Los ovocitos son manualmente defolliculated de tejido de un donante de ovario, inyectado o tratado en la cultura como se desee, y luego estimulados con progesterona para inducir la maduración. A continuación, los ovocitos se introducen en la cavidad del cuerpo de una rana anfitrión ovulación femenina, con lo cual se trasladaron a través del oviducto del anfitrión y adquirir las modificaciones y abrigos de gelatina necesaria para la fecundación. Los embriones resultantes se puede elevar a la fase deseada y se analizaron los efectos de cualquier perturbación experimental. Este método de transferencia de acogida ha sido muy eficaz en el descubrimiento de los mecanismos básicos del desarrollo inicial y permite una amplia gama de posibilidades experimentales no están disponibles en cualquier organismo vertebrado otro modelo.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedimiento para la fertilización<em&gt; Oocitos de Xenopus</em&gt; Por el método de transferencia de acogida.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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Video: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferencia nuclear en ovocitos de ratón

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em&gt; Xenopus</em&gt; Extractos de huevo

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...