Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
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この作業は、助成金の支援を受けて行われた 5R21HD080684-02、国立小児保健と人間開発から。著者は彼の継続的な熱意と支援の県町をお礼申し上げます。著者とも認めるしたいブルース ・ ブランバーグ彼のカメラ、リベカ チャーニー、原稿とショーン · マクナマラ、Marcin Wlizla 国立アフリカツメガエルリソース (RRID:SCR_013731) での重要な読書のための使用のための貴重なX. tropicalisの餌と動物の治療法についての会話。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物のケアとカリフォルニア大学アーバイン校の利用委員会によって承認されています。
1. PGC 移植の準備
<ol><li>前述23として解剖ツールを事前に準備します。 注: 眉髪のナイフは、切開手術を実行しているとき、胎児を安定させるために毛のループの支援に使用されます。眉毛と髪のループを炎で描かれた最初パスツール ピペット ホウケイ酸ガラスに接着し、薄くなった部分に壊れた (図 1 aを参照してください矢印) 手先の器用さより短くより狭いヒント (図 1 b) を作成するには手術の際に。</li>
	<li>手順説明した24を使用して sgRNAs を生成します。 注: 簡潔に、短い DNA テンプレート sgRNAs のためのコーディングが作成されます、エラー無料、耐熱性 DNA ポリメラーゼを焼鈍が 5' バクテリオファージ T7 プロモーターと「入力」を含む重複する deoxyoligonucleotides を使用しています。SgRNA 合成反応の in vitro (キット使用) によって一夜にして数時間孵化します。反応は、DNAse 処理テンプレートを削除します。SgRNAs は24キットの製造元の指示に従ってフェノール/クロロホルム抽出とアンモニウム酢酸/イソプロパノール沈殿の標準的な方法で精製しました。</li>
	<li>直前に薬剤を実行すると、最初の変化 〜 250 で Cas9 sgRNA 錯体を準備 RNAse フリー (ジエチルピロカーボネート処理) H2O 60 から 65 ° c 5 分の総量が 3 μ L sgRNA の ng は、5 分間氷の上迅速な冷却が続きます。数秒間、sgRNA を遠心 1 μ g/μ L Cas9 蛋白質の 1 μ L を追加して、複雑な形成を促進する 37 ° C で 10 分間インキュベートします。 注: このインキュベーション後チューブを維持する氷上一方マイクロインジェクションの胚を準備します。</li>
	<li>前述の25として標準的な方法を使用して体外受精によってX. tropicalis胚を取得します。25,26を解除ゼリー 10 分後受精で胚。 注: 受精の時間時間後に卵に精子懸濁液を追加し、料理は 1/9thX が殺到である Marc の着信音の変更 (MMR)26。X. tropicalis25、 X. laevisとは異なり実行 1/9 で解除ゼリー x MMR システインの遊離の塩基の 3% (ない塩酸塩) を含む pH 7.8 8.0 に調整は 1/9 で複数の洗浄が続く x MMR。(1%)、アガロースに胚を転送-1/9 を含むコーティング皿室温で x MMR。</li>
	<li>すぐの 1 を含んでいる 1% アガロースゲル コーティング皿注入胚を転送パスツール ピペットを使用して x MMR。</li>
	<li>
1 細胞の段階で投入します。参照26,27 アフリカツメガエルマイクロインジェクション メソッドの詳細についてを参照してください。
	<ol>
<li>4 動物極で 1 つのサイトでそれぞれの胚に注入 Cas9 sgRNA 複合体の nL (最終的な金額 = 1 Cas9 と sgRNA の ~ 250 pg の ng; 見なさい議論)24。インジェクション サイト癒しの 10-20 分後 1/9 を含む agarose コーティングの皿に胚を転送 x MMR 25 ° c. で孵化させなさいと胚移植の受信者として使用される uninjected の兄弟の皿を作成もできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
〜 5 mm を含むペトリネット プレート (60 mm) を準備-0.3、1% の agarose の厚い層 x MMR、 X. tropicalis、または 1 の移植を行う場合X. laevisの x MMR。
	<ol>
<li>3 ~ 4 のくぼみを作成 mm、3 を挿入することによって深い-4 ウェル金型 (96 ウェル PCR プレートを切断することによって作成された) x 溶融 agarose プレートを注ぐときに (図 1を参照してくださいとD)。Agarose が固まるまで、リング スタンドに接続されているクランプを使用してシャーレの底の上の数ミリの金型を保持します。</li>
		<li>さらに、1/9、1% の agarose の薄層で井戸をコーティングすることにより家個々 の胚に 24 ウェル プレートを作る x MMR。 注: これらの井戸に追加培養培地はゲンタマイシン硫酸塩/mL の 50 μ g を添加した MMR 1/9 x。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PGCs の移植
<ol><li>とき胚だけ Nieuwkoop とフェーバー28胞胚の段階に達する 9 (図 2 a) ~4.5 h X. tropicalisのためのポスト受精 (hpf) 25 の ° C の定温器から削除し、さらに室温に釣り合うように0.5 h。</li>
	<li>5 に移植を開始する hpf (図 2 b)、0.3 のくぼみ (1.7 のステップで作成した) を含む 60 mm agarose の皿に (Cas9 sgRNA と挿入された) 1 つの PGC ドナー胚を転送するパスツール ピペットを使用して、x MMR (または 1 x MMR X. laevisを使用している場合)。また、1 つ uninjected 兄弟の胚移植の受信者は、この皿に転送します。 注: これらの胚のそれぞれのアイデンティティが混同されていないことが重要です。</li>
	<li>手動で鉗子を使用してそれぞれの胚から卵黄の封筒を削除し、植物極がビューで、手術のためアクセス両方の胎児を回転させます。 注: 胚のマニュアル ・ デ ・ vitellination の説明に記載されている26がきた。</li>
	<li>髪、眉のナイフの鋭い先端を使用して、マーク、原口将来ボトル細胞が形成されますゾーン中、受信者の胚の植物極に正方形の形をした 4 つの浅い切開を作る。胚は、毛のループを持つ胚の安定が上向きの動きをスライスして、表面のすぐ下に眉髪のナイフの先端を挿入して切開を行います。 注:図 2 4.5 7.0 hpf セル サイズを表示してボトル細胞が (白の破線円) を形成を推定するためのガイドを提供するから half-hourly 間隔で胚の植物性のビューを示します。目的は、ように切開し、破線のブラック ボックスが示されているです。</li>
	<li>正方形の 4 つの側面は、切開で区切られる、一度眉髪のナイフが類似の切断動作を使用して深さの約 1/3、1/2 胞胚腔の床までの距離に到達すると各切開を深めます。</li>
	<li>無料の受信者の胚からの植物組織植 (図 3 a とB) (植物の表面に平行) 水平することによって深い植物地域で cut(s)。 注: PGC 含む植物性外植体のサイズは約 0.4-0.45 mm 面ごと mm で深さ 0.25 0.3。受信者の胚からこの植物の植が不要し、破棄される脇したがって設定する必要があります。</li>
	<li>すぐに働いて、この手順 (手順 2.4 2.6) PGC ドナー胚移植のための同様に大きさで分類された植物組織片を作成するを繰り返します。 注: その傷口を癒すために受信者の胚のための時間を最小限に抑えるため遅延の少ないこの第二の郭清を行うことが重要です。</li>
	<li>ドナー胚始原生殖を含む組織を削除すると、受信者の胚は、開口部の位置にこの植を移動するのに眉髪のナイフと髪のループを使用します。 注: ドナー移植片の内部の表面は受信者の胚の内部に直面する必要があります。受信者の胚で移植の背腹軸、左右の軸の向きを揃える必要はありません。</li>
	<li>受信者の胚の植物の表面の開口部に移植をそっと押して、移植片の表面に平行に開催眉髪のナイフの軸の長いエッジを使用します。</li>
	<li>一度移植を配置すると、ドナー胚の「死体」をアガロースうつ病優しく agarose 表面にスライドするのに、hairloop または、眉髪のナイフのシャフトを使用します。死体の傷口で大量の液体が直面していることを確認します。該当しない場合は、この方向性を達成するために胚を回転させる眉髪のナイフを使用します。</li>
	<li>癒しの場所に隣接するうつ病に移植の受信者の胚をスライドし、同様に接木された植物極組織が大量の液体を直面していることを確認してください。</li>
	<li>ドナーと受信者の胚の別のペアを使用して移植/死体の別のペアを作成するこの手順 (手順 2.1 2.11) を繰り返します空のくぼみに、これらを転送します。 注: 死体と胚移植軸受のペアを追跡する表記をするとが重要です。ドナー死体移植軸受け動物性的成熟に達するまで簡単に測定できない移植の PGCs の Cas9 sgRNA 誘発突然変異の効率のプロキシとして使用されます (以下、3.3、手順を参照してください、ディスカッション).</li>
	<li>胚までは約 6.5 約初期原腸胚ステージ 10、移植を作り続けるX. tropicalisで hpf (図 2 eを参照してください)。</li>
</ol>3. 胚世話治癒後
注: 移植を癒す ~ 30 分以内の場所に、通常セル換散 (図 3) 胚から染み出すからいくつかの卵黄の残骸を観察します。
<ol><li>
癒される、アガロース コーティング 24 ウェルのプレートの個々 の井戸にくぼみから非常に優しく移植胚にパスツール ピペットを使用します。液になります流体転送中に混合によって (図 3 D) を削除します。
	<ol>
<li>一括ソリューションを直面する植物性極配置されますので、胚を回転します。また、ドナーの死体を置き移植胚のペアを追跡するのに支援するために隣接する井戸の受信者この情報を記録します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一晩文化の 25 ° C の定温器に胚を含む 24 ウェル プレートに転送します。 注: 次の日、胚が持っている尾の段階に達した。</li>
	<li>ゲンタマイシン硫酸塩/mL、ウェルあたり 1 胚での 50 μ g を添加した MMR 1/9 x を含む agarose コーティング 6 ウェル プレートをきれいにする移植の受信者を移動します。これらに一致するドナー死体の明確な記録の受信者を移植します。</li>
	<li>シーケンス PCR 産物5,17,24または PCR 産物 (ディスカッションを参照) に依存する他のメソッドを使用して突然変異誘発効率を評価するために個々 の死体を 0.2 mL PCR ストリップ管に移動します。媒体のほとんどを削除し、100 μ L 換散バッファー24プロテイナーゼ K (PK) によって繰り返し上下ピペッティング P200 ピペットを使用してを含む均質化します。</li>
	<li>胚換散24 PK 消化を許可するように一晩に 6 h 56 ° C でを実行します。クイック 4 ° C に冷却後、10 分の 90-95 ° C に加熱することによって PK を不活性化します。直接サンガー DNA シーケンス24の短い産物を取得するのに PCR の反作用をシードするのにさらにクリーンアップ手順を実行することがなく溶解液を使用します。-20 ° C の溶解液を保存します。 注: いくつかの日以内オタマジャクシ栄養段階 (約ステージ 45 46) になるし、浮遊性粉末 (血清ミクロン) の懸濁液を供給することができます。</li>
	<li>培地に清潔を維持し、微生物の増殖を最小限に抑えるための日変化との 〜 1 週間後点滴の流れと循環水生システムの小型タンクにオタマジャクシを移動します。シーケンス データを使用すると、突然変異誘発に低い効率とオタマジャクシから高効率人為 PGCs のオタマジャクシを分離します。変身が完了したら、一度、froglet をラボで大人の水生システムに移動します。 注: 国立アフリカツメガエルリソース (MA、ウッズホール海洋生物学研究所) が開発した療法は29と大人カエル メンテナンス30餌オタマジャクシのガイドを提供します。</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

著者は、何を開示します。

このレポート提供中動物の生殖細胞を変更する PGCs。 移植の PGCs を含む植物性の組織移植のための詳しいプロトコルはゲノム編集技術 (例えばCRISPR/Cas9) と組み合わせて使用遺伝子野生型としてその体細胞組織のほぼすべてを維持します。成功するリープフロッギングの行う移植を実行する前に考慮すべき重要な要因の数があります。
生殖細胞の突然変異体の対立?...

遺伝子型が表現型にエンコードし、メンデルの法則の再発見から生物学の主要な質問がされています。発掘の新しい生物学および従って, これらの疾患状態のツールを提供するためにエンコードされた製品約束の機能と遺伝子、その調節と遺伝子ネットワークの相互作用の役割の理解。半分以上世紀1アフリカツメガエル、アフリカツメガエルは、基礎生物学、生物医学、開発の遺伝制御を含むさまざまなトピックに関する研究の主要なモデルをされています。歴史的に、アフリカツメガエルのほとんどの研究は、allotetraploid カエル、 X. laevisを使用しているが、最近では、その二倍体遺伝のために、 X. tropicalisを両生類遺伝モデルとして開発されています。全ゲノム配列は、両方アフリカツメガエル種2,3から組み立てされています。「カエルのコミュニティ」は基礎ゲノム改質技術が許可されている遺伝子機能の研究事実上はターニング ポイントで今です。プログラマブル CRISPR/Cas9 酵素からの遺伝子の突然変異を誘発した非常に効率的に、シュミレーション可能な大部分の細胞の変異動物4,5,6,7、 8,9,10,11。バッタチャリヤらによって強調したこれらの研究12重田ら13F0モザイク動物の突然変異誘発による多くの遺伝子の機能を学ぶことができることが示されています。このアプローチは多くの利点;ただし、Cas9 sgRNA microinjected 胚はしばしば関数 (LOF) の不完全な損失のため変数表現型を表示します。大きくなり、突然変異系統の生成は、いくつかのアプリケーションのため、非常に有利、特に母性 mRNA 貢献をしている遺伝子の研究の際に。母性 Mrna とタンパク質とエピジェネティクス、胚発生14,15,16、多くの遺伝子の早期発達貢献をレンダリング長時間にわたって永続化します。F0解析する耐火物。したがって、他の LOF のアプローチが必要です。
突然変異系統を作成しようとすると、ホモの LOF の胚を取得するパスはいくつかの障害には。必須な遺伝子機能の損失結果として生き残るために性的に成熟、現実的なラインの生産と干渉する障害シュミレーションの突然変異を生成する最初、効率的な変異が不利なるです。一般的なソリューションは、Cas9 sgRNA の配信量の慎重な滴定です。ここでは、目的はまた生殖細胞系突然変異誘発効率を最大化しながら致死率を減らすことの間のバランスを達成するためにです。2 番目の問題は、表現型解析が F2世代まで遅延される標準的な育種方式から発生します。標準的なアプローチを使用すると、性的成熟する F0動物生殖細胞を通じて対立遺伝子が F1ヘテロ「キャリア」が、性的な成熟に成長して生成する outcrossed 変異体を送信します。2 F1ヘテロ接合体は、25% の期待されるメンデル頻度で F2変異胚を作り出すため、intercrossed します。したがって、繁殖の二世代が突然変異体の表現型解析のため必要です。変異動物は、急性または複合ヘテロ接合体 (すなわち、子孫含む 2 つの異なる変異対立遺伝子、F1エムアンドエー インター クロスにおける親動物の遺伝子型に依存する) 可能性があります。
これらの障害は、プログラマブル ヌクレアーゼを介した突然変異誘発による生殖細胞、馬跳び17と呼ばれる新しいメソッドの基礎となる拘束で克服できます。2 つの主要コンポーネントがありますリープフロッギング: (1) 一緒に sgRNA、またはヌクレアーゼ sgRNA 錯体 (または原則、TALENs または亜鉛指核酸) Cas mRNA マイクロインジェクション (2) 続いて胚性ゲノムを効率的に mutagenize に単一細胞の段階でPGCs の内因性の PGCs が削除された、野生型の兄弟の胚への移植。両方の手順が突然変異体の生殖細胞を効率的で、完全な生殖系列の置換を取得できます。Blackler は、後半 neurula で胚と早く尾段階18,19アフリカツメガエル始原生殖を移植できれば、1960 年代初頭に示した。リープフロッギングの Blackler のアプローチは、胞胚のステージ17で移植胚20,21の植物極の PGCs がローカライズされる場合を実行することによって変更されました。原腸陥入前に移植には 2 つの主な利点。まず、移植とそれに続く正常な発達の生着は (未発表観察) 胞胚の段階で移植するときより効率的なことが判明しました。第二に、ココヤシの転写の開始後まもなく、胞胚期移植を実行する、不正な後半 neurulae に導いてくれる原腸陥入を混乱させる変異進化の遺伝子から生じる致死避けることが 1 つ。PGC 移植軸受 (「アベンテイル」) 胚が性的に成熟、成長、これら F0動物間の intercrosses は、F1子孫の 100% は多くのケースで、LOF 表現型 (ほとんどされている化合物も表示を示しています。ヘテロ接合体)、対象となる遺伝子変異を有する完全な生殖系列の置換を示します。
リープフロッギングアフリカツメガエルの遺伝的アプローチを加速する予定です。22 「ホスト転送」メソッドに代わるは母性効果遺伝子 (未発表観測) の LOF の分析も、飛び越えて.現在の文書では、PGC 移植中心メソッドの詳細な説明はX. tropicalisで (、 X. laevisに変更を加える) されます。PGCs の移植は、アフリカツメガエルの使用他の所により迅速な技術移転を容易にする紹介です。この方法の原理は他の両生類 (例えば有尾) に成功したする必要があり、効率的な変異を実現する他の多くの動物への応用方法論で生物固有の変更を許可し、PGCs が容易に移植できます。

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

ゲノム編集による突然変異系統の作成は多くの有機体の遺伝解析を加速しています。CRISPR/Cas9 方法は、アフリカツメガエル、アフリカツメガエル、生物医学研究のための長年のモデル有機体の使用のために適応されています。CRISPR/Cas9 標的突然変異のホモ接合体の突然変異系統を作成するための伝統的な育種方式があるいくつかの時間がかかり、骨の折れる手順。特に、胚形成に不可欠な遺伝子をノックアウトに関連付けられている障害を克服するために突然変異体の胚の作成を容易にするには、リープフロッギングと呼ばれる新しい方法を開発しました。この手法は「カットアンド ペースト「アフリカツメガエル胚の堅牢性を活用して胎生学的方法。リープフロッギング PGC アブレーション野生型兄弟に効率的に突然変異誘発ドナー胚から始原生殖細胞 (PGCs) の伝達を利用します。このメソッドは、必須遺伝子の効率的な変異の変異の生殖細胞を運ぶ野生型細胞とキメラ動物を作成することによってできます。ときを運ぶ 2 つの F0動物」を抜いて移植」(すなわち、突然変異体生殖細胞) を intercrossed、彼ら胚を作り出すホモ、または複合ヘテロ接合体、null F1 、そのため表現型データを取得する完全な生成時間節約します。F0表現型解析 CRISPR/Cas9 変異を次に不応性である母性効果遺伝子を解析するための新しいアプローチを示しますもリープフロッギングします。この原稿は、リープフロッギング、PGC 移植を正常に実行する方法に特別な重点を置いての方法を詳しく説明します。

次の移植、CRISPR/Cas9 の突然変異の効果の定性定量は、成長し、性成熟に動物を維持し畜産の努力を費やす前に行わなければなりません。リープフロッグ移植を運ぶ動物アデノーマ野生型、生殖細胞は直接測定のアクセスも困難ですのでドナー胚の死体の保存が重要になります。死体から DNA 解析は、移植生殖17で発生する突然変異の程度のためのプロ...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が示されています。

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K ビュー.  University of California, Irvine. 生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が?...

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

発生生物学

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

遺伝学

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

胚移植による変異ハプロイド肢を用いたキメラ・アクセロリトの生成

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

生物学

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

要約

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操作と

幹細胞様

用いた機能クローニング