Name: resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications
Uploaded: 2018-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
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Este trabajo fue apoyado por la concesión de puntos destacados NERC (NE/N016777/1). Ensis Ltd, servicios científicos ambientales, centro de investigación de cambio ambiental, University College London muestreados y de la base de sedimento.

El SOP siguiente proporciona una descripción paso a paso del protocolo usado para resucitar Daphnia magna huevos latentes, incluyendo una descripción detallada del muestreo, aislamiento de efipios del sedimento y establecimiento de cultivos clonales ( Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig1.jpg"> Figura 1: guía paso a paso para la resurrección de Daphnia magna. Sedimento de un hábitat de agua dulce (A) se muestrea con un nucleador de pistón (B). La base del sedimento (C) es cortada en capas incrementales de 1 o 0,5 cm (D). Cada capa de sedimento se guarda en una bolsa de ziplock de muestra (E) en condiciones de oscuras y frío (4 ° C). Cada capa de sedimentos es pesado y tamizado usando tamices geológicos (1 mm y 125 μm malla, F). Bandejas de fondo blanco se utilizan para aislar efipios Daphnia magna (G). Decapsulated huevos latentes (H) se transfirió a cajas Petri y expuestos a los estímulos de luz y temperatura para inducir la eclosión. Crías se transfieren para separar los frascos (yo) para establecer líneas de isoclonal. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. muestreo de testigos de sedimentos
<ol><li>Sedimento de la muestra de lagos o estanques con un nucleador de pistón. Este protocolo utiliza Big Ben27, un tubo de aproximadamente 1,5 m de longitud con un diámetro interno de 14 cm. Big Ben consta de un pistón en una cuerda y una cabeza de corer, que barras se unen para impulsar el tubo en el sedimento. Un sacatestigos ayuda el apoyo del tubo cuando esté lleno de sedimentos. Para sacar el sedimento, un marco mantiene el tubo vertical y estacionaria, y un gato de botella modificado se utiliza para empujar el pistón hacia arriba durante el proceso de extrusión (Video complementario 1).<ol>
<li>Para estanques poco profundos de menos de 1 m de profundidad, use un corer de gravedad de plexiglás de no más de 6 cm de diámetro empujado manualmente en el sedimento.</li>
		<li>Para lagos profundos (> 6 m de profundidad), usar Livingston pistón equipos28 o equipos de sedimento de Griffith de una unidad de disco con las ayudas de un barco el pontón anclado. El corer de Livingstone-tipo unidad varilla del pistón puede utilizarse en agua hasta unos 30 m profundidad para recoger sucesivas unidades de un metro de suave al sedimento del lago consolidado. El tubo de Griffith de una unidad de disco consiste en una cabeza de núcleo simple pero robusto que conecta tubos de policarbonato estándar a las barras de accionamiento de Livingstone. Los equipos se empujan en el sedimento con las varillas, y un pistón proporciona la succión necesaria para la recuperación de sedimentos (figura 2).</li>
		<li>Para la recuperación continua, corazones, uso vibracoring. Estos equipos trabajan en una variedad de profundidades del agua y pueden recuperar muestras de diferentes longitudes, dependiendo de la litología de los sedimentos. Vibración de baja amplitud que se transfiere de la cabeza vibracore hacia abajo a través del barril conectado o el tubo licua los sedimentos, lo que permite el cañón del núcleo la unidad de vibracore para penetrar en los sedimentos licuados. Algunos vibracorers son pequeño, ligero y portátil, otros son grandes unidades pesadas que sólo pueden ser implementadas de grandes vasos. La elección de los equipos depende de la litología de los sedimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cortar la base horizontalmente en capas incrementales de 1 cm o menos usando una superficie metálica plana (1 vídeo complementario). Equipos de sedimentos como el que se usa aquí están diseñados para reducir presiones hidrostáticas en extrusión, reducción de la perturbación de las capas de sedimento. Cuando se utilizan otros equipos, la corteza exterior de cada capa de sedimento puede ser quitada con una especie de cookie-cutter de cuchilla para limitar la contaminación entre capas.</li>
	<li>Recoger cada capa de sedimento en una bolsa de muestreo separado (complementario 1 de Video) y almacenar en oscuridad y frío (4 ° C) condiciones.</li>
	<li>Recoger un mínimo de 5 g de sedimento de todas las capas para la datación radiométrica. Como la datación radiométrica es un protocolo establecido para una descripción detallada de la prueba de datación, consulte existentes publicaciones12,13.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig2.jpg"> Figura 2: historieta del pistón metálico procedimiento. Corer de pistón, un tubo hueco con un interno sello deslizante (pistón) que produce un vacío débil. Cuando el pistón toca la interface agua sedimento, el peso empuja el cañón del núcleo en el sedimento y el vacío hace que el sedimento se tubular para entrar y moverse por el tubo sin molestar a las capas de sedimento. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. tamizado de capas de sedimentos
<ol><li>Usando una balanza de precisión, pesar cada capa de sedimento para referencia futura. Utilice el área de la superficie y el peso para calcular la densidad de especies en el lago.</li>
	<li>Tamiz de cada capa de sedimento utilizando dos tamices geológicos apilados uno encima del otro. El primer tamiz tiene un tamaño de malla de 1 mm y arcilla, invertebrados grandes y partículas, por ejemplo, semillas, plantas e insectos, separa el resto del sedimento. El segundo tamiz tiene una malla de 125 μm y separa el resto del sedimento (Video complementario 2) D. manga efipios y partículas pequeñas.</li>
	<li>
Transferencia de pequeñas alícuotas de la fracción de sedimento recogida en el tamiz de malla de 125 μm en una bandeja de fondo blanco. Dependiendo del tipo de sedimento, alícuotas más pequeñas o más grandes de sedimentos pueden ser transferidos en cada momento.
	<ol>
<li>Añadir volúmenes pequeños (hasta 200 mL) del medio a la bandeja de muestreo blanco para volver a suspender la fracción de sedimento transferido y facilitar ojo manchado de efipios (figura 3). El medio utilizado para Resuspender el sedimento puede ser agua del grifo declorada, agua de pozo, COMBO29o ADaM medio (Aachener Daphnien)30. En lo sucesivo, se utilizará el término 'mediana' para referirse a cualquiera o todas las soluciones mencionadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig3.jpg"> Figura 3: Daphnia magna ephippium. Huevos latentes Daphnia magna inmediatamente después de la desencapsulación. Ephippium (A), la membrana interna del huevo (B) y los huevos latentes (C) se muestran. Barra de escala = 500 μm.
3. desencapsulación de efipios y eclosión
<ol><li>Con una pipeta de Pasteur desechable o usar pinzas de microdisección, llenan de efipios individuales de transferencia a cajas Petri con 10 mL de medio. Utilice al menos un plato de Petri por capas de sedimentos.</li>
	<li>Microscopio estéreo, desencapsulan cada efipios con unas pinzas de microdisección obligando a abrir el caso de la quitina (3 Video complementario). Quitar la membrana interna del huevo descanso delicadamente, prestando atención a no interrumpir los huevos y transferir a la caja Petri con medio utilizando una pipeta Pasteur. Desencapsulación aumenta el éxito de eclosión en D. magna; sin embargo, puede que no sea necesario o puede ser un reto para otras especies de Dafnia produciendo efipios más pequeños.</li>
	<li>Exponer los huevos decapsulated luz de fotoperíodo de día largo de espectro completo (16:8 luz: oscuridad) y de alta temperatura (20 ± 1 ° C) para inducir la eclosión de un dispositivo de temperatura controlada (incubadora) o una habitación. Eclosión se produce entre 48 horas y varias semanas (hasta cuatro; Video complementario 4). En ausencia de desencapsulación, exponer directamente los efipios a eclosión estímulos (luz de fotoperiodo largo del día (16:8 luz: oscuridad) y alta temperatura (20 ± 1 ° C)).</li>
</ol>4. establecer líneas de Isoclonal de Daphnia magna
<ol><li>Establecer líneas de isoclonal de crías solo transfiriendo individual D. magna de paso 3.3 para separar los frascos con 200 mL de medio con una pipeta Pasteur desechable. Cada individuo es genéticamente distinto, siendo el resultado de la recombinación sexual.</li>
	<li>Mantener líneas isoclonal indefinidamente en condiciones de la población que consta de 10 ± 1 ° C, régimen de 16:8 luz: oscuridad, semanalmente alimentaron con 0,2 mg C/L de Chlorella vulgaris u otras algas verdes (p. ej., Scenedesmus obliquus). Renovar el medio de cada tercera semana. Condiciones de la población pueden cambiar con la temperatura, regímenes de alimentación, especies.</li>
</ol>5. principales estudios
Nota: Una descripción de dos estudios claves se proporciona en que resucitado D.magna (sub) poblaciones del archivo sedimentaria del lago anillo (Dinamarca) se utilizan para evaluar la respuesta evolutiva al calentamiento. Resucitaron a tres poblaciones de (sub) de los siguientes períodos: 1960-1970, 1970-1985, y > 1999. D. magna eclosión éxito del archivo sedimentario oscilado entre el 11 y el 58% (figura 4). De las crías obtenidas de cada timeperiod, un subconjunto aleatorio fue elegido para los dos principales estudios aquí descritos. Estos estudios fueron diseñados para evaluar si las poblaciones de (sub) resucitadas de diferentes períodos de tiempo a lo largo del gradiente de la temperatura mostraron diferencias en rasgos de historia de la vida fitness-ligado (5.1), y si tenían diferentes habilidades competitivas (5.2) después de la exposición al calentamiento.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig4.jpg"> Figura 4: éxito en un archivo sedimentario muestreado del lago anillo de eclosión. La proporción de crías exitosas a lo largo del archivo sedimentario del lago anillo utilizado en los principales estudios. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>
Experimentos de jardín común
	<ol>
<li>Transferir diez crías por población (sub) de culturas comunes a condiciones comunes de jardín: 16 ° C; fotoperíodo largo (régimen de 16:8 luz: oscuridad); alimentar diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorella vulgarisy renovar la media cada dos días. Mantener las crías en condiciones comunes de jardín durante al menos dos generaciones (aprox. 45 días). Condiciones comunes de jardín reducen la interferencia del efecto materno y sincronización la reproducción entre crías.</li>
		<li>Sobre el lanzamiento de la segunda cría en la cámara de cría, transferencia de hembras adultas de la segunda generación para frascos de 500 mL llenados de medio hasta que suelten la segunda cría de juveniles.</li>
		<li>Transferencia al azar individuales juveniles de 24 – 48 h, nacido de la segunda cría de la segunda generación, en frascos de 100 mL llena con medio y expuesto a las siguientes condiciones experimentales: 18 ° C (temperatura actual en el lago) y 24 ° C (calentamiento, temperatura previsto por el IPCC 26 para los próximos 100 años), 16:8 luz: oscuridad régimen y alimentación diaria de 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris.</li>
		<li>En cada animal experimental, medir el tamaño en la madurez con un estereomicroscopio como la distancia entre la cabeza y la base de la espina dorsal de la cola (figura 5). Fotografía de cada animal y posteriormente analizar su tamaño utilizando un software de imagen adecuado.</li>
		<li>Medir la edad de madurez: el día en que los huevos se observan por primera vez en la cámara de cría.</li>
		<li>Medir la mortalidad: el número de individuos a estar extinto durante el experimento.</li>
		<li>Medir la fecundidad: el número total de descendientes en primera y segunda clónica reproducción.</li>
		<li>Medir la tasa de crecimiento de la población, estimada usando la ecuación de Euler (1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56637/56637eq1.jpg">(1) Lx es la proporción de supervivencia en la edad x, bx es el número de recién nacidos producidas por individuo sobrevive en la edad x, y r es la tasa intrínseca de incremento natural.</li>
		<li>Realizar el análisis estadístico utilizando el software disponible en el mercado. Aquí, utilice R31 para trazar normas de reacción (expresión fenotípica de un genotipo único a través de entornos) para cada rasgo de la historia de la vida, utilizando el paquete ggplot2. Calcular las tasas de mortalidad por la población por medio de análisis de supervivencia (R paquete rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Por último, realizar un análisis de varianza (ANOVA, tabla 2) en R31 para determinar si el efecto de la temperatura sobre las características puede explicarse por la evolución (diferencias entre poblaciones), plasticidad (respuesta al tratamiento), o la evolución de plasticidad (población x tratamiento).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experimento de competencia
	<ol>
<li>Transferir diez crías por habitantes de culturas comunes a condiciones comunes de jardín: 20 ° C, largo fotoperiodo (régimen de 16:8 luz: oscuridad), alimentar diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorella vulgaris y renovar el medio cada dos días. Mantener condiciones comunes jardín de por lo menos dos generaciones (aprox. 45 días) reducir la interferencia de efectos maternos.</li>
		<li>Asignar al azar cinco menores de edad de 24 a 48 h de la segunda cría de la segunda generación de cada eclosión al mesocosmos experimentales (20 L plástico acuarios llenados de medio), en triplicado, con una densidad de 10 animales/L.</li>
		<li>Exponer el mesocosmos a 24 ° C, régimen de l: 16:8 y alimentan diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris en una cámara de temperatura controlada o en incubadora para un mínimo de cuatro semanas (> 3 generaciones clonales).</li>
		<li>Sacrificar cada mesocosmos semanalmente, refrescantes 10% del medio para simular una población dinámica que Daphnia puede encontrar en el medio natural. Imponer el sacrificio mediante la eliminación de un volumen conocido de medio y los animales de cada acuario (1.2 L en este caso) y sustituyendo el volumen sacrificado por medio fresco. Iniciar el régimen de sacrificio después de que los animales alcanzan la madurez (día 10).</li>
		<li>Al final de la cuarta semana, la muestra 32 animales de cada mesocosmos para evaluar cambios en la composición genotípica en comparación con el inóculo inicial.<ol>
<li>Coloque cada Daphnia en tubos de microcentrífuga y eliminar exceso de líquido con la ayuda de una pipeta Pasteur.</li>
			<li>Flash congelar los tubos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.</li>
			<li>Extraer la DNA de genomic de individuos aislados utilizando protocolos disponibles y siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
			<li>Amplificar el ADN extraído mediante una serie de marcadores genéticos suficientes para proporcionar un único genotipo multilocus por crías. Aquí, se utilizaron 8 microsatélites dispuestas en un solo múltiplex (M01, tabla 1) siguiendo protocolos establecidos32,33.</li>
			<li>Genotipo amplificaron fragmentos en un analizador de fragmento.</li>
			<li>Realizar el análisis del fragmento con un software comercial o libre disponible con un estándar de tamaño adecuado.</li>
			<li>Evaluar composición genotípica en el final del experimento por individuos genotyping los 32 con un conjunto de loci microsatélites descrito33, como calcular la frecuencia de cada genotipo en el final del experimento en comparación con el inóculo inicial.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig5.jpg"> Figura 5: hembra adulta Daphnia magna. Adulto hembra Daphnia magna con huevos partenogenéticos en la cámara de cría. La distancia entre la cabeza y la base de la espina dorsal de la cola se utiliza para medir el tamaño del animal. Las líneas rojas indican las medidas del tamaño. Barra de escala = 500 μm.

Los autores no tienen nada que revelar

Debido a la alta conductividad térmica del agua, ecosistemas de agua dulce están en mayor riesgo de pérdida de la biodiversidad de los ecosistemas terrestres ante global calentamiento34. Por lo tanto, es fundamental para entender la respuesta de la especie en estos ecosistemas e identificar mecanismos para sobrevivir el estrés térmico. La comprensión de estos mecanismos a nivel especie y comunidad puede ayudar a predecir cómo las especies se ven afectadas por el calentamiento global y cómo las cascadas del efecto en las especies individuales a otros niveles tróficos. En definitiva, entender mecanismos de respuestas al calentamiento global permite la identificación de estrategias de rehabilitación para mitigar la extinción.
Los estudios de caso presentados aquí demuestran que la respuesta de D. magna a aumento de la temperatura es pervasively mediada por plasticidad en rasgos de historia de la vida y que respuesta al aumento de la temperatura solamente imponer costos fitness claro, al menos en el población estudiada aquí. Alta plasticidad en rasgos de historia de la vida está sustentada en diferencias no significativas en competencia las capacidades de las poblaciones de (sub) en presencia de calentamiento. Sin embargo, experimentos de competencia a largo plazo en poblaciones múltiples pueden ser necesarios para generalizar estos resultados.
Resurrección de etapas latentes proporciona un recurso sin precedentes para estudiar mecanismos de adaptación y trayectorias de evolución de una especie a través de tiempo de10. Especies de zooplancton se benefician de un tiempo de generación rápido (2 semanas) y la viabilidad de etapas latentes, que permite un antepasado competir enfrentamientos contra sus propios descendientes, o a 'reproducir' evolución que inicia desde diversos Estados últimos. Ecología de resurrección esencialmente permite la investigación de si un resultado evolutivo particular depende de algún acontecimiento previo. La identificación de los elementos genéticos de la evolución es actualmente posible en experimentos de laboratorio con microorganismos para que 'líneas ancestrales' son congeladas y resucitadas para el análisis comparativo con su descendiente evolucionado6. Sin embargo, una de las principales limitaciones de trabajar con organismos de laboratorio es que el 'estado ancestral' es una referencia ya cambiada de puesto. El estudio de etapas latentes permite el muestreo de especimenes de tiempo anteriores a cualquier evento de estrés (p. ej., prístinas condiciones ambientales) y para medir trayectorias evolutivas de las condiciones ambientales a distintos Estados últimos hasta tiempos modernos. En los últimos años, el estudio del polimorfismo de la DNA en etapas de zooplancton resucitado o aún latente ha proporcionado importantes conocimientos sobre últimos procesos demográficos y adaptativos que han contribuido a la composición genética de las poblaciones actuales14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. con la mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, el genoma y transcriptoma de etapas resucitadas o aún latentes pueden ser secuenciados y el tipo y el número de cambios genéticos acumularon en la evolución de las poblaciones en tiempo medido.
La resurrección SOP presentado aquí tiene aplicaciones importantes en el campo de la multi-omics en dos niveles. Las tecnologías multi-ómicas pueden aplicarse a muestras de resucitado, permitiendo un análisis exhaustivo de los elementos moleculares implicados en las respuestas de adaptación a las presiones de selección ambiental. Además, las tecnologías ómicas pueden aplicarse a decapsulated pero etapas todavía latentes. Hasta ahora, la aplicación de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento en etapas de descanso ha sido limitada por la exigencia de una gran cantidad de material de entrada. Estas limitaciones están siendo levantado37. Con los requisitos de descenso para entrada material y el progreso en nanofluídica, secuenciación del genoma entero (WGS) ahora es posible desde tan poco como 1 ng o pg unos de a partir de material38. El uso de amplificación (WGA) de todo el genoma y transcriptoma conjunto técnicas de amplificación (WTA), que permite el enriquecimiento de ADN y ARN de muy pequeñas cantidades de tejido, ha revolucionado la metagenómica39,40 y médica 41la investigación. Estas tecnologías aplicadas a los huevos latentes decapsulated permiten superar limitaciones asociadas con viabilidad de etapas latentes y la investigación de los periodos de tiempo prolongado (p. ej., siglos).
La resurrección de las comunidades invertebradas produciendo etapas de reposo permite la alineación de las historias de la comunidad con los conocidos cambios en los paisajes naturales, o con cambios ambientales que se infiere del análisis de los sedimentos orsoils2. El análisis de los cambios de la comunidad en respuesta a los cambios ambientales nos proporciona la capacidad de cuantificar eco-evolutivo votos42 que tienen consecuencias sustanciales sobre la población persistencia43, interacciones tróficas44 , comunidad Asamblea45y cambios en el ecosistema funciones y servicios46. Finalmente, predicciones exactas acerca de las respuestas biológicas a los cambios ambientales son fundamentales para guiar la protección de la biodiversidad47. Los modelos predictivos actuales son inexactos en este sentido porque no tienen en los mecanismos biológicos importantes cuenta como demografía, dispersión, evolución e interacciones de las especies. Entender cómo estos procesos cambian con el tiempo y el uso de esta información como un prior en modelado de pronóstico mejorará nuestra capacidad para predecir la especie y persistencia de la comunidad frente al medio ambiente cambiar2.
La aplicación de la compensación presentada aquí no es sin problemas. La limitación principal de reconstruir etapas latentes es la necesidad de equipo especializado para toma de muestras. Además, todo el proceso de tamizado de sedimentos para el establecimiento de cultivos clonales, requiere bastante tiempo de práctico.
Algunas de las medidas de compensación presentadas aquí son fácilmente transferibles a otras especies de Dafnia . Estas son: muestreo, el establecimiento de líneas clonales y diseño experimental. Sin embargo, otras medidas del SOP pueden requerir más optimización adaptado a la especie bajo estudio. Desencapsulación a menudo se aplica a los especímenes de D. magna para mejorar el éxito de eclosión. Sin embargo, este enfoque puede no ser adecuado para los especímenes más pequeños. Estímulos de eclosión puede variar entre especies48 y49de la misma especie muestra. Por lo tanto, una especial optimización de los pasos de eclosión de la compensación puede ser requerida antes de aplicaciones a otros crustáceos. Mientras que el éxito de eclosión de la población de D. magna resucitado de lago anillo (30,5% en el archivo sedimentario) está en línea con anteriores resultados49, éxito de eclosión varía con el estado de conservación de los sedimentos, la especie 50,51y el origen geográfico de los48del sedimento. Futuros estudios sobre los mecanismos que regulan la entrada y la progresión a través de las fases de la diapausa es necesaria para identificar estímulos eclosión óptima adaptados a diferentes especies.
Finalmente, conocimiento del sistema de estudio de fondo, en particular la presencia de las especies de interés con el tiempo, es recomendable. Esto puede lograrse a través de registros históricos. Si no hay registros históricos, muestreo y detección de las capas superficiales de los sedimentos del lago antes de la toma de muestras de núcleo es recomendable, aunque puede proporcionar información sólo sobre la historia más reciente.

Estudios a largo plazo son fundamentales para la comprensión de procesos ecológicos y evolutivos en la naturaleza y en la evaluación de cómo las especies responderan a y persisten durante el cambio del medio ambiente1. Esto es debido a procesos eco-evolutivo ocurren a través de generaciones y cambios en el ambiente durante largo tiempo se extiende. Además, estudios a largo plazo proporcionan datos empíricos claves que mejoran la exactitud del modelo predictivo para pronosticar las respuestas evolutivas de los ecosistemas naturales a cambios ambientales2. La precisión de estos modelos es fundamental para implementar estrategias de manejo y conservación para preservar la biodiversidad y los servicios ecosistémicos.
Excepto algunos casos excepcionales (por ejemplo, Galápagos Darwin pinzones algas de3 y4), estudios a largo plazo son en gran parte limitados a especies con el tiempo de generación corto que puede ser propagado en el laboratorio5,6 , 7 , 8. por lo tanto, los procesos que sustentan la dinámica evolutiva permanecen fuera de alcance. Debido a dificultades logísticas asociadas con el acceso a las muestras temporales, datos empíricos se estudian con más frecuencia en un espacial que en un contexto temporal, y procesos eco-evolutivo temporales son inferidos o modelados de datos espaciales. Este enfoque se conoce como sustitución de 'espacio de tiempo'9, por el que se adopta el espacio como un sustituto para el estudio de la dinámica evolutiva temporal. La principal limitación de la sustitución de 'espacio de tiempo' es que las tasas de adaptación a diferentes escalas espaciales difieren de variación temporal en la misma población; por lo tanto, deducciones basadas en reemplazo de tiempo con el espacio son parciales10.
Una poderosa alternativa que permite estudiar la dinámica evolutiva de los ecosistemas naturales con el tiempo es el análisis de los cambios ecológicos y genéticos en especies produciendo etapas latentes11. Estas etapas latentes se acumulan de forma estratificada archivos biológicos que pueden ser datados con precisión y paleolimnologically caracteriza12,13. Importante, estas etapas latentes pueden ser resucitadas y utilizadas en experimentos de laboratorio, donde su respuesta evolutiva a los cambios ambientales puede medirse directamente. Poblaciones históricas pueden compitió contra sus modernos descendientes evolucionados para estudiar cambios de aptitud y la función de genes evolucionando en sintonía con el cambio ambiental14,15,16.
Etapas latentes incluyen semillas, quistes, esporas y los bancos de huevos. Aunque los primeros estudios en reanimación huevos latentes remonta a los finales del decenio de 1980 de17y un puñado de estudios han aplicado esta técnica en el decenio de 1990 temprano18,19, el campo de la ecología de la resurrección ha sido formalmente establecido por el artículo seminal de Kerfoot y colaboradores en 199920. Esta práctica ha sido aplicada principalmente en reconstrucciones paleolimnológicos de especies de agua dulce17,21,22. Sin embargo, una concesión aún no está disponible. Aquí, se proporciona una descripción paso a paso el protocolo de resurrección aplicada a los huevos latentes de las especies de zooplancton Daphnia magna , de la toma de muestras de sedimentos para el establecimiento de cultivos clonales de crías. Pasos del SOP que son fácilmente transferibles a otras especies de Dafnia, así como medidas que requieran optimización adicional, se discuten.
Daphnia son zooplankters de agua dulce presentes en la mayoría de los hábitats lóticos23 . Especies de Daphnia son cualquiera obligan partenógenos asexual o cíclica. D. magna es un parthenogen cíclica que reproduce clonalmente bajo condiciones ambientales favorables24. Cuando se deterioran las condiciones ambientales, ocurre la producción masculina y recombinación sexual conduce a la formación de huevos fertilizados que entran en un estado de latencia que protege contra el ambiente por un caso de quitina llamado ephippium. Una proporción de estos huevos latentes de la portilla cuando vuelven las condiciones ambientales favorables. Sin embargo, una gran proporción de lo Banco de óvulos latentes nunca tiene la oportunidad de eclosionar y así construir archivos biológicos con el tiempo. Etapas latentes permanecen enterradas en el sedimento de lagos y estanques y pueden ser resucitadas para el estudio de la dinámica evolutiva durante períodos de tiempo extendidos. Porque los huevos latentes de D. magna están el resultado de la recombinación sexual, son una buena representación de la diversidad genética natural de la especie25. Por otra parte, se puede mantener mediante reproducción clonal en el laboratorio. Estas características proporcionan la ventaja única de organismos modelo isogénicas, conservando la diversidad genética natural.
Dos estudios claves se presentan para demostrar las ventajas de comparar directamente los descendientes históricos y modernos de la misma población de D. magna experimentando presiones de selección ambiental con el tiempo. D. magna especímenes fueron resucitados del lago anillo (Dinamarca), un poco (5 m de profundidad, superficie 22 hectáreas) estanque mixto que ha experimentado un aumento en la ocurrencia de temperatura y olas de calor promedio en el tiempo. D. magna (sub) poblaciones fueron resucitadas a lo largo de este gradiente temporal que abarca 60 años (1960-2005) y estudios para investigar la respuesta evolutiva al calentamiento de la temperatura. En el primer estudio en un experimento de jardín común, cambios en rasgos de historia de la vida fitness-ligado se midieron en respuesta a un aumento de temperatura de + 6 ° C, en consonancia con las predicciones del Panel Intergubernamental de cambio climático para los próximos 100 años 26. en el segundo estudio, un experimento de mesocosmos se utilizó para medir las capacidades competitivas de las tres poblaciones (sub) bajo calentamiento. Estos experimentos combinados demuestran que en presencia de calentamiento como el estrés único, todos los rasgos de historia de la vida y las poblaciones muestran un alto nivel de plasticidad y tienen iguales habilidades competitivas. Estos resultados sugieren que calienta como un estrés único no impone costes de adecuación significativa, al menos en la población estudiada.

<table><tbody><tr><td>sampling bags</td><td>Fisher Scientific</td><td>11542783</td><td>Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89&amp;micro;m thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand</td></tr><tr><td>piston corer</td><td>ENSIS ltd</td><td>na</td><td>Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC</td></tr><tr><td>precision scale</td><td>Veritas-M124A</td><td>TLP-50</td><td>Analytical Balance</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7521</td><td>200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh</td></tr><tr><td>geological sieve</td><td>UKGE limited</td><td>SV7525</td><td>200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh</td></tr><tr><td>white sampling tray</td><td>nhbs</td><td>http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509</td><td>Standard mulipurpose lab trays</td></tr><tr><td>pasteur pipette</td><td>Globe Scientific inc.</td><td>138020B</td><td>Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL</td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>nikon</td><td>smz800</td><td>Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit</td></tr><tr><td>petri dish</td><td>EduLab</td><td>153-533</td><td>Sterile 90mm diameter plastic petri dish</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Round Jam Jars 4oz</td><td>100 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>compak</td><td>Atum Jars/ Bonta Jar 10oz</td><td>200 mL jars</td></tr><tr><td>glass jars</td><td>bottlecompanysouth</td><td>500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid</td><td>500 mL jars</td></tr><tr><td>statistical software R</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td>na</td><td>Free online GNU&amp;nbsp; language and environment for statistical computing and graphics</td></tr><tr><td>microdissection forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>41122405</td><td>Fine point stainless steel forceps for microdissections</td></tr><tr><td>image software</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td><td>na</td><td>Open source ImageJ image processing toolkit written in Java</td></tr><tr><td>mesocosm</td><td>amazon</td><td>na</td><td>Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter</td></tr><tr><td>mirocentrifuge tubes</td><td>Sigma_Aldrick - Merck</td><td>Z606340</td><td>premium microcentrifuge tubes 1.5 mL</td></tr><tr><td>AGENCOURT DNAdvance</td><td>Beckman Coulter</td><td>A48705</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>size standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td>LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers</td></tr><tr><td>ABI3032 sequencer</td><td>ABI</td><td>na</td><td>Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing</td></tr></tbody></table>

resurrection of dormant daphnia magna: protocol and applications

Estudios a largo plazo permiten la identificación de los procesos eco-evolutivo que se producen durante períodos de tiempo extendidos. Además, proporcionan datos empíricos que pueden utilizarse en la modelización predictiva para la previsión de respuestas evolutivas de los ecosistemas naturales a los cambios ambientales futuros. Sin embargo, excepto algunos casos excepcionales, estudios a largo plazo son escasos debido a las dificultades logísticas asociadas con el acceso a muestras temporales. Dinámica temporal con frecuencia se estudia en el laboratorio o en experimentos de mesocosmos controlados con estudios excepcionales que reconstrucción la evolución de las poblaciones naturales en la naturaleza.
Aquí, se provee un procedimiento de funcionamiento de estándar (SOP) para revivir o resucitar latente Daphnia magna, una especie de clave de zooplancton generalizada en los ecosistemas acuáticos, para avanzar considerablemente en la colección de datos longitudinales en sistemas naturales. El campo de la ecología de la resurrección fue definido en 1999 por Kerfoot y compañeros de trabajo, aunque los primeros intentos en eclosión diapausa zooplancton huevos datan de la década de 1980. Desde papel seminal de Kerfoot, la metodología de resucitar especies de zooplancton se ha aplicado cada vez más frecuentemente, aunque propagada entre los laboratorios sólo a través de transferencia de conocimiento directo. Aquí, se describe una compensación que proporciona un protocolo paso a paso en la práctica de resucitar latente Daphnia magna huevos.
Dos estudios claves son siempre en que la respuesta de la aptitud del Resucitado Daphnia magna las poblaciones se mide el calentamiento, aprovechando la posibilidad de estudiar poblaciones históricas y modernas en la configuración del mismo. Finalmente, se discute la aplicación de tecnologías de secuenciación de próxima generación a etapas restablecidas o aún latentes. Estas tecnologías proporcionan una potencia sin precedentes en los procesos y mecanismos de la evolución si se aplica a poblaciones que han experimentado cambios en la presión de selección en el tiempo de la disección.

Datos empíricos a largo plazo son esenciales para la comprensión de la dinámica evolutiva y persistencia de las poblaciones naturales. Estos datos son generalmente difíciles de obtener debido a las dificultades logísticas asociadas con el acceso a las muestras temporales y el requisito de comprometerse a largo plazo para la recolección de datos. En los dos principales estudios presentados aquí, se ofrece evidencia empírica de la respuesta a la temperatura de una central zooplankter en ecosistemas de agua dulce sobre tiempo evolutivo. Esta opción está activada por el uso de los bancos de huevos latentes capas que proporcionan la oportunidad para estudiar la respuesta de las poblaciones históricas y sus descendientes modernos a la tensión ambiental en común configuración experimental.
Experimento de jardín común El experimento de jardín común demostró que todos los rasgos de historia de la vida respondieron a la temperatura (figura 6 y figura 7). El análisis de varianza reveló que todas las poblaciones (sub) responden a la temperatura mediante plasticidad (tabla 2), excepción de la mortalidad, que es insensible. Evidencia de cambios evolutivos (diferencias entre poblaciones (sub)) sólo se observó en tasa de crecimiento poblacional (tabla 2), que aumentó significativamente en dos de las tres poblaciones (sub) a 24 ° C (figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig6.jpg"> Figura 6: experimento de jardín común. Normas de reacción para rasgos de historia de la vida (fecundidad, tamaño y edad de madurez) y tasa de crecimiento poblacional (r) se muestran para cada población (sub) bajo temperatura calentamiento (24 ° C) en comparación con el jardín común y el actual régimen de temperatura (18 ° C). La tasa de crecimiento de la población 'r' se calcula mediante la ecuación de Eulerian (1). Se muestran los intervalos de confianza. Las poblaciones (sub) están codificadas por color: azul (): 1960-1970; (ii) verde: 1970-1985; (iii) rojo: > 1999. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig7.jpg"> Figura 7: mortalidad. Las tasas de mortalidad por población (sub) (1960-1970, 1970-1985; > 1999) aparecen bajo calentamiento (24 ° C) en comparación con los regímenes modernos de temperatura (18 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Experimento de mesocosmos Después de cuatro semanas de selección, representada por el calentamiento a 24 ° C, la frecuencia de las tres poblaciones (sub) no cambió significativamente (χ2 = 0.55, P = 0.76) en comparación con el inóculo inicial (figura 8). Entre los 30 genotipos inoculados en el experimento de mesocosmos, la mayoría fue identificada después de cuatro semanas de selección (figura 9). Concretamente, el 70% de los genotipos inoculados fueron recuperados, compatible con Poissonian expectativa de recuperar al menos un representante de cada genotipo en una muestra de 32 personas.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig8.jpg"> Figura 8: experimento de competencia - frecuencia de la población. Promedio de población mediana y cuartiles (25 demayo y 75th), se muestra para las tres poblaciones (sub) de D. magna después de cuatro semanas de selección en los experimentos de competencia de mesocosmos (24 ° C), en comparación con una frecuencia igual inicial (en el comienzo). Las poblaciones (sub) son colores como se muestra en la figura 6. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56637/56637fig9.jpg"> Figura 9: experimento de competencia - frecuencia de genotipo. Frecuencias genotípicas: promedio mediana y cuartiles (25 demayo y 75th), aparecen después de cuatro semanas de exposición al calentamiento (24 ° C) en comparación con una inicial igual frecuencia de genotipos (línea punteada). Nombres en el eje x son el ID de genotipos inoculados, agrupado por población (sub) (azul, 1960-1970; verde, 1970-1985; rojo, > 1999). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/56637fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lugar geométrico</td>
			<td>UN</td>
			<td>Gama del tamaño (bp)</td>
			<td colspan="2">Cebadores (5' - 3')</td>
			<td>Etiqueta de tinte</td>
			<td>Repetir el motivo</td>
			<td>TM</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B008</td>
			<td rowspan="2">HQ234154</td>
			<td rowspan="2">150 – 170</td>
			<td colspan="2">F: TGGGATCACAACGTTACACAA</td>
			<td rowspan="2">VIC</td>
			<td rowspan="2">(TC) 9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B030</td>
			<td rowspan="2">HQ234160</td>
			<td rowspan="2">154-172</td>
			<td colspan="2">F: CCAGCACACAAAGACGAA</td>
			<td rowspan="2">MASCOTA</td>
			<td rowspan="2">(GA) 11
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B045</td>
			<td rowspan="2">HQ234168</td>
			<td rowspan="2">118 – 126</td>
			<td colspan="2">F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC</td>
			<td rowspan="2">NED</td>
			<td rowspan="2">(TG) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B050</td>
			<td rowspan="2">HQ234170</td>
			<td rowspan="2">234-248</td>
			<td colspan="2">F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(GAA) 6
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B064</td>
			<td rowspan="2">HQ234172</td>
			<td rowspan="2">135-151</td>
			<td colspan="2">F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA</td>
			<td rowspan="2">6FAM</td>
			<td rowspan="2">(TC) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B074</td>
			<td rowspan="2">HQ234174</td>
			<td rowspan="2">196-204</td>
			<td colspan="2">F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT</td>
			<td rowspan="2">NED</td>
			<td rowspan="2">(GT) 9
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B096</td>
			<td rowspan="2">HQ234181</td>
			<td rowspan="2">234-240</td>
			<td colspan="2">F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA</td>
			<td rowspan="2">VIC</td>
			<td rowspan="2">(AC) 15
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TTGAACCACGTCGAGGATTT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">B107</td>
			<td rowspan="2">HQ234184</td>
			<td rowspan="2">250-274</td>
			<td colspan="2">F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA</td>
			<td rowspan="2">MASCOTA</td>
			<td rowspan="2">(CT) 8
</td>
			<td rowspan="2">56</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: multiplex de Microsatellite. El NCBI adhesión número (AN), la información multiplex, las secuencias de la cartilla PCR, el rango de tamaño de polimerización en cadena, el motivo de repetición, el tinte usado para etiqueta que aparecen el primer avance y la temperatura de recocido (Tm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tasa de crecimiento del pop (r)</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evolución (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>30.309</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plasticidad (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>531.546</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plasticidad (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>65.137</td>
			<td>< 0.001</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mortalidad</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evolución (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>2.234</td>
			<td>0.1162</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plasticidad (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>2.679</td>
			<td>0.1071</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plasticidad (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8657</td>
			<td>0.164</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fecundidad</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evolución (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.8852</td>
			<td>0.1633</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plasticidad (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>6.8934</td>
			<td>0.0117</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plasticidad (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>1.6511</td>
			<td>0.203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Talla de madurez</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evolución (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.211</td>
			<td>0.8106</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plasticidad (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>11.1361</td>
			<td>0,0017</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plasticidad (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.6586</td>
			<td>0.5225</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">La edad en la madurez</td>
			<td>DF</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evolución (Pop)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.7811</td>
			<td>0.4637</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Plasticidad (Temp)</td>
			<td>1</td>
			<td>8.0764</td>
			<td>0.0066</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Evol. Plasticidad (Pop x Temp)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.088</td>
			<td>0.9159</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Análisis de varianza (ANOVA). Análisis de varianza prueba si cambios en rasgos de historia de la vida y la tasa de crecimiento demográfico de las poblaciones de resucitado (secundaria) expuestos al calentamiento se explican por adaptación evolutiva (poblaciones), plasticidad (tratamiento de temperatura) y su término de interacción (evolución de la plasticidad). Significativas p-valores (p< 0,05) se muestran en negrita.
Video complementario 1: toma de muestras de núcleos de sedimento. Se muestra el uso de un nucleador de Big Ben. Big Ben es un tubo de aproximadamente 1,5 m de longitud con un diámetro interno de 14 cm. Consiste en un pistón en una cuerda y una cabeza de corer, que barras se unen para impulsar el tubo en el sedimento. Un sacatestigos se utilizan para el tubo de base que se implementa desde una pequeña embarcación de apoyo. El pistón es empujado hacia abajo en el sedimento por presión gravitatoria. Un marco se utiliza para apoyar el tubo durante el proceso de extrusión utilizando un gato de botella modificados que empuja el pistón hacia arriba. Cada capa de sedimento se recoge en una superficie plana de metal y transferido a las bolsas de muestreo transparente para almacenamiento a largo plazo [oscuro y frío (4 ° C) condiciones]. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video1_Sampling.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 2: sedimento tamizado. El equipo requerido para tamizar el sedimento es una balanza de precisión, tamices geológicos y bandejas de muestreo blanco. De cada capa de sedimento, por lo menos de 5 g se conservan para la datación radiométrica. El resto del sedimento se utiliza para aislar efipios. El sedimento es tamizado a través de dos tamices geológicos, uno con 1 mm y un segundo con 125 μm tamaño de malla, apilados uno encima del otro. Medio se vierte en el tamiz de malla de 1 mm para separar arcilla, invertebrados grandes y partículas. Medio de vertido en el segundo tamiz con malla de 125 μm separa D. magna efipios y pequeñas partículas. Alícuotas de sedimento se transfieren a una bandeja de muestreo blanco. D. magna efipios son vistos por el ojo en la bandeja de fondo blanco. Efipios de cada capa se recogen en cajas Petri separadas. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video2_Sieving_sediment.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 3: Decapsulation. Bajo un estereomicroscopio, efipios D. magna se abren con pinzas para microdisección mediante la aplicación de presión en el lomo de la caja de la quitina. La membrana interna del huevo se retira delicadamente y huevos de reclinación suavemente transferidos con una pipeta Pasteur a un plato de Petri que contiene 10 mL de medio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video3_Decapsulation.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 4: eclosión. Después de la exposición a fotoperiodo largo y 20 ° C, desarrollo del embrión se reanuda entre 48 horas y algunas semanas. Cuando el desarrollo es completo, los embriones liberarse de la cáscara de huevo y nadan libremente en el medio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56637/Supplementary_video4_Hatching.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

Estudios a largo plazo son esenciales para entender el proceso de evolución y los mecanismos de adaptación. Generalmente, estos estudios requieren compromisos más allá de la vida en tiempo de los investigadores. Aquí, un método de gran alcance se describe que avanza dramáticamente la colección de datos para generar datos longitudinales en los sistemas naturales.

Resurrección de latente Daphnia magna: protocolo y aplicaciones

Long-term studies enable the identification of eco-evolutionary processes that occur over extended time periods. In addition, they provide key empirical ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

18.2K vistas.  University of Birmingham. Estudios a largo plazo son esenciales para entender el proceso de evolución y los mecanismos de adaptación. Generalmente, estos estudios requieren compromisos más allá de la vida en tiempo de los investigadores. Aquí, un método de gran alcance se describe que avanza dramáticamente la colección de datos para generar datos longitudinales en los sistemas naturales.

Video: Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications

A Simple Approach to Manipulate Dissolved Oxygen for Animal Behavior Observations

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal behavior questions. The protocol described here provides a simple, reproducible, and controlled method to manipulate DO to study behavioral response in aquatic organisms resulting from hypoxic and anoxic conditions. While performing degasification of water with nitrogen is commonly used in laboratory settings, no explicit method for ecological (aquatic) application exists in the literature, and this protocol is the first to describe a protocol to degasify water to observe organismal response. This technique and protocol were developed for direct application for aquatic macroinvertebrates; however, small fish, amphibians, and other aquatic vertebrates could be easily substituted. It allows for easy manipulation of DO levels ranging from 2 mg/L to 11 mg/L with stability for up to a 5 min animal-observation period. Beyond a 5 min observation period water temperatures began to rise, and at 10 min DO levels became too unstable to maintain. The protocol is scalable to the study organism, reproducible, and reliable, allowing for rapid implementation into introductory teaching labs and high-level research applications. The expected results of this technique should relate dissolved oxygen changes to behavioral responses of organisms.

This article describes a simple and reproducible protocol to manipulate dissolved oxygen conditions in a laboratory setting for animal behavior studies. This protocol may be used in both teaching and research laboratory settings to evaluate organismal response of macroinvertebrates, fishes, or amphibians to changes in dissolved oxygen concentration.

Un enfoque simple para manipular el oxígeno disuelto para las observaciones de comportamiento animal

The ability to manipulate dissolved oxygen (DO) in a laboratory setting has significant application to investigate a number of ecological and organismal ...

Investigación

Medio ambiente

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Basic Methods for the Study of Reproductive Ecology of Fish in Aquaria

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a series of basic techniques are described to enable observations of the reproductive behavior of a wild-caught gobiid fish, as a model, kept in an aquarium. The method focuses on three steps: collection, transport, and observations of reproductive ecology of a substrate spawner. Essential aspects of live fish collection and transport are (1) preventing injury to the fish, and (2) careful acclimation to the aquarium. Preventing harm through injuries such as scratches or a sudden change of water pressure is imperative when collecting live fish, as any physical damage is likely to negatively affect the survival and later behavior of the fish. Careful acclimation to aquaria decreases the incidence death and mitigates the shock of transport. Observations during captive rearing include (1) the identification of individual fish and (2) monitoring spawned eggs without negative effects to the fish or eggs, thereby enabling detailed investigation of the study species' reproductive ecology. The subcutaneous injection of a visible implant elastomer (VIE) tag is a precise method for the subsequent identification of individual fish, and it can be used with a wide size range of fish, with minimal influence on their survival and behavior. If the study species is a substrate spawner that deposits adhesive eggs, an artificial nest site constructed from polyvinyl chloride (PVC) pipe with the addition of a removable waterproof sheet will facilitate counting and monitoring the eggs, lessening the investigator's influence on the nest-holding and egg-guarding behavior of the fish. Although this basic method entails techniques that are seldom mentioned in detail in research articles, they are fundamental for undertaking experiments that require the captive rearing of a wild fish.

A series of basic methods to enable the study of the reproductive ecology of fish kept in aquaria are described. These are useful protocols for collecting fish using SCUBA, transporting live fish, and observing the reproductive behavior of wild-caught fish kept in aquaria.

Métodos básicos para el estudio de la ecología reproductiva de los peces en acuarios

Captive-rearing observations are valuable for revealing aspects of fish behavior and ecology when continuous field investigations are impossible. Here, a ...

Comportamiento

Criopreservación de PGCs para la conservación a largo plazo de cepas de Drosophila

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and phenotypic changes. Development of an alternative method for long-term preservation without such changes is therefore imperative. Despite previous successful attempts, cryopreservation of Drosophila embryos is still not of practical use because of low reproducibility. Here, we describe a protocol for primordial germ cell (PGC) cryopreservation and strain revival via transplantation of cryopreserved PGCs into agametic Drosophila melanogaster (D. melanogaster) host embryos. PGCs are highly permeable to cryoprotective agents (CPAs), and developmental and morphological variation among strains is less problematic than in embryo cryopreservation. In this method, PGCs are collected from approximately 30 donor embryos, loaded into a needle after CPA treatment, and then cryopreserved in liquid nitrogen. To produce donor-derived gametes, the cryopreserved PGCs in a needle are thawed and then deposited into approximately 15&#160;agametic host embryos. A frequency of at least 15% fertile flies was achieved with this protocol, and the number of progeny per fertile couple was always more than enough to revive the original strain (the average progeny number being 77.2 &#177; 7.1), indicating the ability of cryopreserved PGCs to become germline stem cells. The average number of fertile flies per needle was 1.1 &#177; 0.2, and 9 out of 26 needles produced two or more fertile progeny. It was found that 11 needles are enough to produce 6 or more progeny, in which at least one female and one male are likely included. The agametic host makes it possible to revive the strain quickly by simply crossing newly emerged female and male flies. In addition, PGCs have the potential to be used in genetic engineering applications, such as genome editing.

Autor destacado: Criopreservación de PGC: un enfoque alternativo hacia la preservación a largo plazo de cepas de Drosophila 

A long-term preservation method for Drosophila strains as an alternative to the frequent transfer of adult flies to fresh food vials is highly desirable. This protocol describes the cryopreservation of Drosophila primordial germ cells and strain revival via their transplantation to agametic host embryos.

Criopreservación de células germinales primordiales y reactivación de cepas de Drosophila

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and ...

Genética

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biología

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of genetic manipulations with this model has supplanted pharmacological approaches that are commonplace in other animal models and cell-based assays. Here we describe recent advances in a protocol that enables application of small molecules to the developing fruit fly embryo. The method details steps to overcome the impermeability of the eggshell while maintaining embryo viability. Eggshell permeabilization across a broad range of developmental stages is achieved by application of a previously described d-limonene embryo permeabilization solvent (EPS1) and by aging embryos at reduced temperature (18 &#176;C) prior to treatments. In addition, use of a far-red dye (CY5) as a permeabilization indicator is described, which is compatible with downstream applications involving standard red and green fluorescent dyes in live and fixed preparations. This protocol is applicable to studies using bioactive compounds to probe developmental mechanisms as well as for studies aimed at evaluating teratogenic or pharmacologic activity of uncharacterized small molecules.

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction of small molecules to the developing Drosophila embryo offers great potential for characterizing biological activity of novel compounds, drugs, and toxins as well as for probing fundamental developmental pathways. Methods described herein outline steps that overcome natural barriers to this approach, expanding the utility of the Drosophila embryo model.

Un método de permeabilización de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes are controlled by the complex interplay between NSC intrinsic genetic programs with NSC extrinsic factors, local and systemic. In the genetic model organism, Drosophila melanogaster, NSCs, known as neuroblasts (NBs), switch from quiescence to proliferation during the embryonic to larval transition. During this time, larvae emerge from their eggshells and begin crawling, seeking out dietary nutrients. In response to animal feeding, the fat body, an endocrine organ with lipid storage capacity, produces a signal, which is released systemically into the circulating hemolymph. In response to the fat body-derived signal (FBDS), Drosophila insulin-like peptides (Dilps) are produced and released from brain neurosecretory neurons and glia, leading to downstream activation of PI3-kinase growth signaling in NBs and their glial and tracheal niche. Although this is the current model for how NBs switch from quiescence to proliferation, the nature of the FBDS extrinsic cue remains elusive. To better understand how NB extrinsic systemic cues regulate exit from quiescence, a method was developed to culture early larval brains in vitro before animal feeding. With this method, exogenous factors can be supplied to the culture media and NB exit from quiescence assayed. We found that exogenous insulin is sufficient to reactivate NBs from quiescence in whole-brain explants. Because this method is well-suited for large-scale screens, we aim to identify additional extrinsic cues that regulate NB quiescence versus proliferation decisions. Because the genes and pathways that regulate NSC proliferation decisions are evolutionarily conserved, results from this assay could provide insight into improving regenerative therapies in the clinic.

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

A method to reactivate quiescent neural stem cells in cultured Drosophila brain explants has been established. Using this method, the role of systemic signals can be uncoupled from tissue-intrinsic signals in the regulation of neural stem cell quiescence, entry and exit.

Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Resurrección de latente Daphnia magna: protocolo y aplicaciones

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Criopreservación de células germinales primordiales y reactivación de cepas de Drosophila

Criopreservación de células germinales primordiales y reactivación de cepas de Drosophila

Criopreservación de células germinales primordiales y reactivación de cepas de Drosophila

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia

Un método de permeabilización de

Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados