Desarrollamos un método para reactivar células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de drosophila cultivados. Este método puede suministrar factores exógenos a los medios de cultivo y puede evaluar la reactivación de neuroblastos. Se podrían desarrollar mejores terapias con células madre mediante una mejor comprensión de cómo las células madre inactivas responden a las señales extrínsecas y entran en el ciclo celular.
Demostrando el procedimiento estará Susan Doyle, una científica investigadora de mi laboratorio. Para comenzar, escoja cuidadosamente aproximadamente de 20 a 25 larvas recién eclosionadas de la placa de agar de uva bajo un microscopio de disección. Llene una placa de Petri con aproximadamente dos mililitros de PBS y sumerja la punta de la herramienta que contiene larvas en PBS durante dos minutos.
Después de dos minutos, incline el plato en ángulo para acumular el líquido en la parte inferior, y con un pincel pequeño, cepille las larvas del líquido hasta el fondo de la placa de Petri. Recoja todas las larvas en el pincel y enjuague las larvas brevemente en etanol al 70% antes de transferirlas de nuevo a la placa de Petri que contiene PBS. Rocíe el área de trabajo, las herramientas de disección, las pinzas y dos platos de reloj de vidrio con etanol al 70% y déjelos secar en el banco.
Haga el medio de cultivo de Schneider suplementado, o SSM, y colóquelo en hielo. Pipetee un mililitro del medio en cada plato de reloj de vidrio. Usando una micropipeta con una punta estéril, transfiera las larvas recién eclosionadas de la placa de PBS al SSM en la primera placa de reloj de vidrio.
Diseccionar los cerebros de las larvas colocadas en la segunda placa de reloj de vidrio con SSM usando fórceps bajo un microscopio de disección y ajustando el aumento según sea necesario. Use un fórceps para agarrar los ganchos de la boca, y con el otro, agarre suavemente el cuerpo hasta la mitad y tire en la dirección opuesta para dividir la larva en dos pedazos. Después de diseccionar de 15 a 20 cerebros, agregue un mililitro de SSM en un pozo de una bandeja de cultivo estéril de 24 pocillos.
Usando una micropipeta y una punta estéril, transfiera los cerebros recién diseccionados al SSM, seguido de la incubación de los medios con cerebros durante 24 horas a 25 grados centígrados. Pipetear 10 microlitros de una cepa de 10 milimolares de 5-etinil-2'desoxiuridina, o EDU, con 990 microlitros de SSM en un tubo de microcentrífuga estéril, mezclar, luego pipetear un mililitro de EDU SSM en un pozo de la bandeja de cultivo estéril de 12 pocillos. Transfiera los cerebros usando una micropipeta con una punta estéril del pozo que contiene SSM al nuevo pozo que contiene la solución EDU SSM e incube durante una hora a 25 grados Celsius.
A continuación, transfiera los cerebros marcados con EDU a otro pozo en la misma bandeja de cultivo que contenga un mililitro de fijador y permita que los cerebros se fijen durante 20 minutos. Después de la fijación, transfiera rápidamente los cerebros a un minitray de 72 pocillos usando una micropipeta. Enjuague los cerebros tres veces en 10 microlitros de PBT y repita tres lavados durante 10 minutos cada uno, asegurándose de que los cerebros estén siempre cubiertos con un poco de líquido.
Pipete 10 microlitros de solución de bloqueo en los cerebros. Cubra la bandeja y séllela con una tira de parafilm alrededor del borde. La figura muestra células neuroblásticas EDU positivas y positivas para EDU de gran tamaño después de 24 horas de cultivo en SSM con insulina y tinción.
Después de 24 horas en los medios suplementados de Schneider sin insulina, los cerebros de tipo salvaje Oregon R recién eclosionados no tenían células neuroblásticas EDU positivas y positivas para NO DE GRAN TAMAÑO, aparte de las células neuroblásticas de cuatro cuerpos de hongos y una célula neuroblástica ventrolateral. Durante las imágenes confocales, ocasionalmente se observaron algunos hemisferios cerebrales con daño, como agujeros de tamaño pequeño a grande en el tejido cerebral explantado. Ningún cerebro con agujeros no se utilizó para el análisis.
Diseccionar los tejidos con cuidado y pipetear suavemente para evitar cualquier daño tisular. También trate de ser lo más estéril posible y no contaminar sus cultivos. Debido a que los medios de cultivo se pueden manipular fácilmente agregando diferentes factores, esta técnica se puede utilizar para abordar hipótesis futuras con respecto a la señalización extrínseca y la entrada y salida de la inactividad neuroblástica.
