Estamos agradecidos a la investigación Federación FRABio y la plataforma de proyección de imagen de TisBio (Univ. de Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Biomoléculaires funcional des conjuntos) para proporcionar el entorno técnico conducente a la consecución de este trabajo.

Nota: Los medios MS ½ líquidos y sólidos deben ser preparados previamente como se describe en la tabla adicional 1.
1. cultivo de vegetales
<ol><li>
Cultivo de plantas lino de 2 meses de edad
	<ol>
<li>Sembrar las semillas de lino (Linum usitatissimum L.) en macetas de plástico con abono de maceta.</li>
		<li>Crecer lino en cámaras de crecimiento a 22 º C con un fotoperiodo de 16 h/8 h día/noche.</li>
		<li>Equipar a las plantas con soporte vertical después de 1 mes y crecer hasta los 2 meses de edad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de plántulas lino de 2 semanas de edad
	<ol>
<li>Envuelva 12 semillas de lino en un trozo de tela de queso y fije con una banda elástica para hacer un paquete. Nota: Llevar a cabo los siguientes pasos bajo condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Coloque el paquete de semillas en un frasco de vidrio previamente esterilizado 250 mL.</li>
		<li>Añada 70 mL de 70% EtOH en la botella y suavemente agitar durante 1 minuto.</li>
		<li>Retire con cuidado el EtOH por decantación, dejando el paquete en la botella.</li>
		<li>Añadir 100 mL de hipoclorito sódico al 2% y agitar suavemente durante 10 minutos.</li>
		<li>Retirar la solución de hipoclorito de sodio por decantación, dejando el paquete en la botella.</li>
		<li>Repita los pasos 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Añadir 100 mL de agua ultrapura estéril y agitar durante 1 minuto.</li>
		<li>Repita el paso 1.2.8 3 veces, en aumentar el tiempo de lavado para cada aclarado (5, 10 y 15 min).</li>
		<li>Caliente medio MS ½ sólido, viértala en una caja de cultura estéril de la planta a una altura de 2 cm y dejar enfriar hasta la solidificación.</li>
		<li>Coloque delicadamente cada semilla en medio sólido, utilizando pinzas estériles.</li>
		<li>Cierre la caja estéril.</li>
		<li>Transferir la caja a una cámara de crecimiento a 22 º C con un fotoperiodo de 16 h/8 h día/noche y crecer plántulas lino durante 2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabólica incorporación de reporteros química
Nota: A continuación se presentan tres modelos experimentales: etiquetado i) metabólica de los cortes transversales de tallo, tallos ii) todo y iii) planta de semillero. Cada protocolo se presenta una repetición biológicos y cantidades se pueden adaptadas al número de repeticiones biológicas requiere. Las soluciones de monolignol se preparan de soluciones comunes que se realizan como se describe en la tabla 2 antes del experimento. Las soluciones stock pueden almacenar varios meses a-20 ° C. El HAZ: GALK o H:G proporciones pueden ajustarse todos los diseños experimentales por encargo.
<ol><li>Incorporación de reportero químico en 2 cortes transversales de tallo de lino de meses
	<ol>
<li>Preparar una solución de reportero químico de 300 μL conteniendo 10 μm de GALK y 10 de HAZ en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice del HAZ/Gproducto alcalino solución y transferir a un pozo de una placa de 48 pozos con una micropipeta.</li>
		<li>Preparar un 300 μL control negativo solución 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice H/G solución y transferir a un segundo pozo de la misma placa de 48 pozos.</li>
		<li>Corte el tallo de una planta de lino meses 2 a 10 cm sobre el nivel del suelo utilizando una hoja de afeitar nueva.</li>
		<li>Delicadamente preparar 50 secciones transversales a mano alzada del tallo con la hoja de afeitar (aproximadamente 150-250 μm de espesor).</li>
		<li>Colocar inmediatamente los cortes transversales en medio MS ½ estéril líquido en un vidrio de reloj.</li>
		<li>Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo lleno de HAZ/Gproducto alcalino solución.</li>
		<li>Repita el paso 2.1.8 para bien llenado con H/G solución (control negativo).</li>
		<li>Repita el paso 2.1.8 un tercio bien llena con 300 μL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).</li>
		<li>Incube la placa en luz continua en una cámara de crecimiento a 20 ° C durante 20 horas.</li>
		<li>Retirar la solución de monolignol en cada pocillo con una micropipeta.</li>
		<li>Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporación de reportero químico en 2 meses los vástagos todo lino
	<ol>
<li>Preparar una solución de reportero químico de 5 mL que contiene 10 μm de GALK y 10 de HAZ en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice del HAZGALK solución y transferencia a una prueba de vidrio de 20 cm de alto tubo con una pipeta.</li>
		<li>Preparar una solución de control negativo de 5 mL que contiene 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice el HG de solución y transferir a una prueba de vidrio de 20 cm de alto tubo.</li>
		<li>Preparar un tercer tubo de vidrio que contiene 5 mL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).</li>
		<li>Corte el tallo de una planta de lino meses 2 a 10 cm sobre el nivel del suelo utilizando una hoja de afeitar nueva. Deseche el sistema radicular y la parte inferior del tallo y proceder al siguiente paso con la parte superior de la espiga de la planta.</li>
		<li>No sumerja la base del tallo entero cortado en el tubo que contiene el HAZ/Gproducto alcalino solución. Coloque el vástago en su solución de incubación inmediatamente después del retiro de la raíz del sistema con el fin de evitar que se resequen. Nota: Si el método se aplica a las plantas más jóvenes/mayores u otras especies, el volumen de las soluciones de monolignol debe ajustarse según el tamaño / edad de la planta y el diámetro de su tallo.</li>
		<li>Coloque el vástago en un soporte vertical para mantenerlo recto.</li>
		<li>Sellar el tubo con parafilm para evitar la evaporación de la solución.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.6-2.2.9 para la muestra control negativo con el H/G de solución.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.6-2.2.9 para la muestra de control de fondo de fluorescencia que contiene el medio MS ½.</li>
		<li>Incubar cada tallo de 20 h de luz continua con una lámpara de neón.</li>
		<li>Después de 20 h de incorporación metabólica, quite el tallo se incubaron en la HAZ/Gproducto alcalino solución y enjuague con medio MS ½.</li>
		<li>Corte y deseche la parte inferior 1 cm del tallo con una hoja de afeitar y luego preparar un cilindro de alta de 1 cm de la base del tallo restante.</li>
		<li>Preparar 20 secciones transversales a mano alzada (aproximadamente 150-250 μm de espesor) de este cilindro y colóquelos inmediatamente en un vidrio de reloj con medio MS ½.</li>
		<li>Poner 500 μl de medio MS ½ en un pozo de una placa de 48 pozos.</li>
		<li>Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo que se llena con solución de MS ½.</li>
		<li>Repita los pasos del 2.2.13-2.2.17 para el vástago de control negativo se incubaron con la solución de H/G .</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.13-2.2.17 para el vástago de control del fondo de la fluorescencia se incubaron con medio MS ½.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución en cada pocillo con una micropipeta.</li>
		<li>Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporación de reportero químico en 2 semanas de edad lino las plantas de semillero Nota: Los pasos siguientes todos llevan a cabo en condiciones estériles.<ol>
<li>Preparar una solución de reportero químico de 2 mL que contiene 10 μm de GALK y 10 de HAZ en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice del HAZGALK solución y transferencia a una prueba de 20 cm de altura vidrio tubo con una pipeta.</li>
		<li>Preparar una solución de control negativo de 2 mL que contiene 10 μm de G y 10 h en medio líquido de MS ½ estéril.</li>
		<li>Vórtice el HG de solución y transferir a una prueba de 20 cm de altura vidrio del tubo.</li>
		<li>Preparar un tercer tubo de vidrio de 20 cm de alto que contiene 2 mL de medio MS ½ (como control de fondo para ajustar la línea base de fluorescencia durante el posterior procesamiento de datos de imágenes de microscopía confocal).</li>
		<li>Delicadamente saque el medio MS ½ sólido utilizando un par largo de pinzas una plántula de lino de 2 semanas de edad (sección 1.2. arriba).</li>
		<li>Transferir suavemente la plántula al tubo que contiene el HAZ/Gproducto alcalino solución, asegurando que sus raíces se sumergen en la solución.</li>
		<li>Cerrar el tubo de vidrio con un tapón de plástico para evitar la evaporación.</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.6-2.3.8 para el tubo de control negativo con el H / G de solución.</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.6-2.3.8 para el tubo de control de fondo de fluorescencia que contiene el medio MS ½.</li>
		<li>Incubar cada plántula en luz continua en una cámara de crecimiento de 20 h a 20 ° C.</li>
		<li>Delicadamente saque la plántula se incubaron en la HAZ/Gproducto alcalino solución y enjuague con medio MS ½.</li>
		<li>Delicadamente preparar cortes transversales a mano alzada 20 (aproximadamente 150-250 μm de espesor) de la hipocotila.</li>
		<li>Poner 500 μl de medio MS ½ en un pozo de una placa de 48 pozos.</li>
		<li>Inspeccione visualmente y seleccionar cortes transversales todo intactos y distribuir al azar 10 de ellos en el pozo que se llena con solución de MS ½.</li>
		<li>Repita los pasos del 2.3.12-2.3.15 para la plántula del control negativo se incubaron con la solución de H/G .</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.12-2.3.15 para la planta de control de fondo de fluorescencia se incubaron con medio MS ½.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución en cada pocillo con una micropipeta.</li>
		<li>Añadir 500 μl de medio MS ½ a cada pocillo, agitar suavemente durante 10 minutos y retire este enjuague la solución con una micropipeta. Repetir 4 veces y proceder a dicha etiqueta inmediatamente (sección 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. doble fluorescencia de etiquetado de muestras de sección de planta SPAAC y CuAAC
Nota: La dicha etiqueta protocolo es idéntica para todos los modelos experimentales 3 (sección 2).
<ol><li>
Promovido por la cepa etiquetado cicloadición de azidas alquino (SPAAC)
	<ol>
<li>Preparar 1 mL de una solución SPAAC 5 μm de DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 en medio líquido de MS ½ estéril. Vórtice de la solución y mantener en la oscuridad.</li>
		<li>Después del lavado final pasos del Protocolo de incorporación metabólica [2.1.13, 2.2.21 o 2.3.19 dependiendo del diseño experimental elegido], retire el medio MS ½ y agregar 300 μL de la solución SPAAC por pozo con una micropipeta.</li>
		<li>Blinde la placa de 48 pozos de luz cubriéndola con papel de aluminio o colocando en una caja.</li>
		<li>Agitar suavemente la placa sobre un agitador mecánico de 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cobre-catalizada etiquetado cicloadición de azidas alquino (CuAAC)
	<ol>
<li>Lave cada bien 4 veces como se describe en el paso 2.1.13 manteniendo la placa en la oscuridad.</li>
		<li>Preparar 1 mL de una solución CuAAC ascorbato de sodio 2.5m m, 0.5m m de CuSO4 y 5 μm 5-TAMRA-PEG3-azida en medio líquido de MS ½ estéril. Vórtice de la solución y mantener en la oscuridad. Nota: Esta solución CuAAC debe estar recién preparada antes de usarlo y no se puede almacenar más de unos pocos días a 4 ° C.</li>
		<li>Retire el medio MS ½ en cada pozo y directamente agregar 300 μL de la solución CuAAC por bien utilizando una micropipeta.</li>
		<li>Agitar suavemente la placa sobre un agitador mecánico de 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
		<li>Eliminar la solución CuAAC utilizando una micropipeta.</li>
		<li>Usando una micropipeta, agregar 500 μl de ½ MS, revuelva en la oscuridad durante 10 minutos luego retirar esta solución de lavado. Repetir dos veces.</li>
		<li>Agregar 500 μl de una solución de MeOH/agua 7:3, revolver en la oscuridad durante 1 h y extraer la solución PRECAUCIÓN: Metanol es tóxico por contacto con la piel o inhalación y es señalado como un carcinógeno humano. Su utilización requiere de guantes y campanas de vapores químicos.</li>
		<li>Agregar 500 μl de ½ MS, revuelva en la oscuridad durante 10 min luego retirar la solución. Repetir 4 veces.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montaje de muestras en microscopio de diapositivas
<ol><li>Lugar 5 gotas de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Depositar cuidadosamente cada HAZ/GALKetiquetados sección transversal de la diapositiva.</li>
	<li>Aplicar esmalte de uñas en dos lados opuestos de la diapositiva.</li>
	<li>Cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire.</li>
	<li>Retire el medio de montaje exceso con una toalla de papel.</li>
	<li>Sellar la muestra con esmalte de uñas en los 4 lados. Deja las uñas barniz seco a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min).</li>
	<li>Repita los pasos 4.1-4.6 para las secciones transversales H/G del control negativo.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1-4.6 para las secciones de control del fondo de la fluorescencia.</li>
	<li>Almacenar las diapositivas a 4 ° C en la oscuridad hasta la observación bajo un microscopio confocal. Nota: Los portaobjetos preparados se pueden guardarse por varias semanas a varios meses dependiendo de la calidad de la preparación. Si una nueva observación debe realizarse después del almacenamiento, asegurar que las muestras no se han secado.</li>
</ol>5. adquisición de imagen de Microscopía Confocal de fluorescencia
<ol><li>Encienda todas las unidades necesarias del sistema de microscopía confocal en el orden correcto según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Seleccionar el objetivo deseado con la máxima apertura numérica y adaptado las longitudes de onda de excitación y de emisión (por ejemplo, objeto 60 x, N.A. 1.2. Canal de Autofluorescencia: λex 405 nm, λem 450 nm 25; Canal de HAZ SPAAC: λex 488 nm, λem 525 nm 25; CuAAC GALK canal: λex 561 nm, λem 595 nm 25; modo secuencial).</li>
	<li>Seleccione los parámetros deseados para la generación de imágenes en el software (12 - o 16-bit requerido, tamaño de pixel adaptado al criterio de Nyquist).</li>
	<li>Colocar el portaobjetos/g HAZALK en la platina del microscopio y colocar la muestra bajo la lente del objetivo.</li>
	<li>Observar y buscar la región deseada del tejido de la planta.</li>
	<li>
Adquirir imágenes confocal de alta calidad de doblemente marcada HAZ/G muestraALK .
	<ol>
<li>Seleccione el plano más fluorescente en el eje z.</li>
		<li>Ajuste de ganancia, alimentación offset y láser para conseguir la distribución óptima de la señal a lo largo de la toda gris nivel para cada canal (autofluorescencia, HAZ y GALK). Deben aplicarse los mismos parámetros para todas las adquisiciones siguientes.</li>
		<li>Iniciar la adquisición de la imagen seleccionada y guarde el archivo. Repita para cada área relevante de la muestra. Nota: reconstrucciones 3D de la Z-stack también pueden ser adquiridas si es necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con la misma configuración, adquisición de imágenes de muestra sin etiquetar sólo incubada en MS ½ para determinar el nivel de Autofluorescencia (control de fondo de la fluorescencia como se describe en la sección 2).</li>
	<li>Con la misma configuración, adquisición de imágenes para las muestras control negativo que se incubaron con nativos monolignols H/G para determinar adherencia inespecífica fluoróforo a la muestra.</li>
	<li>Tratamiento de los datos se aplican a las imágenes adquiridas a restar fondo autofluorescence señales en tanto H/G control negativo y/g HAZALK imágenes.</li>
</ol>

<ol>
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Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Como se mencionó anteriormente, el protocolo de dicha etiquetado doble presentado en este documento es uno de los primeros ejemplos de una combinación SPAAC/CuAAC en vivo12,23. Cada paso fue completamente optimizado y validado, y es muy importante que se respete el orden en que los dos haga clic en química reacciones Etiquetadoras se realizan secuencialmente (es decir, SPAAC primero, seguido por CuAAC). Todos los controles de Cruz-demostraron que cada paso etiquetado específico cuando el protocolo BLISS es aplicada23 : primero llevar a cabo el paso SPAAC conduce a la altamente estereoselectiva de HAZ azida funciones el fluoróforo cyclooctyne funcionalizados mediante una reacción de cicloadición [3 + 2] con cinética rápida. Una vez que se han etiquetado HAZ unidades, puede realizar el paso CuAAC requiere activación de cobre (i) catalizada de GALK alquinos terminales para generar enlaces de triazol por reacción con la sonda 545 azida-fluor. En contraste, el orden inverso (es decir, CuAAC en primer lugar, seguido de SPAAC) no debe utilizarse ya que conduce a la unidad GALK y HAZ Cruz-acoplamiento, que compite con el fluoróforo ligadura e induce una pérdida dramática de la señal . También es importante hacer hincapié en la necesidad de los pasos de lavado intermedio para evitar la tinción inespecífica.
Hemos demostrado que nuestro método puede aplicarse a varios diseños de experimento biológico. La dicha etiqueta protocolo primero fue aplicada a cortes transversales a mano alzada de tallos de lino (aproximadamente 150-250 μm de espesor) que previamente se corte y se incubaron con el monolignols haga clic en listo. Aunque este diseño tiene la ventaja de minimizar las cantidades necesarias de reportero químico (como se reducen los volúmenes de incubación) y de facilitar la producción de estadística se replica, no es, estrictamente hablando, un sistema en vivo y en algunos casos, puede no reflejar todos los aspectos de la dinámica espacio-temporal real lignificación. En un segundo diseño experimental, por lo tanto adaptamos el protocolo de felicidad a un método que fue utilizado previamente para estudiar la incorporación de monolignols radiomarcado en pino y gingko27. En este enfoque, las raíces y el tallo de la planta están físicamente separados y la base del tallo entero se incuba en la solución de monolignol en lo que puede ser llamado el enfoque 'florero'. Después de dejar los tallos el tiempo deseado (incubación), secciones transversales son corte y el protocolo de BLISS realizada. Esto nos permitió mostrar (i) que el monolignols modificados son transportados a través de la espiga de la vida y se incorporan en el crecimiento de polímeros de lignina en las paredes celulares y (ii) que el patrón de localización era esencialmente idéntico a la de la sección transversal enfoque. Este tipo de experimento tiene el mérito de ser realizada en una planta de la vida real / células vivas acercamiento permitiendo más experimentos y estudios más exhaustivos, pero requiere mayores cantidades de reportero químico. Finalmente, el protocolo de felicidad también se usó con plántulas de la planta del lino, que representan un verdadero modelo de planta en la que los reporteros química deben ser absorbidos por las raíces antes de ser transportados hasta la madre de vivir. Mientras que este modelo tiene la clara ventaja de ser realizada en plantas vivas, en la práctica, se limita a las plántulas jóvenes y no es realmente adecuado para investigar la dinámica de la lignificación en plantas más viejas por razones prácticas (tiempo de incubación largo, elevado cantidad de reporteros química). Sin embargo, estos diseños de tres experimento son complementarios y todos tienen sus pros y contras con respecto a los aspectos prácticos y significación biológica dependiendo del tipo de cuestión biológica a ser contestadas.
Desarrollado para estudiar la dinámica de la lignificación en lino, nuestro protocolo es altamente adaptable, no sólo en términos de diseño de experimento biológico, sino también en cuanto a su aplicación a otras plantas de especies y órganos/tejidos. Por ejemplo, felicidad puede ser fácilmente transferida a la Arabidopsis o los géneros Populus que son más susceptibles a los estudios con mutantes knock-out o knock-down para varios genes. En principio, estudios de etiquetado doble con nuestro enfoque pueden extenderse también a otras biomoléculas mediante el uso de dos distintos precursores modificadas de polímeros de pared celular de plantas - incluyendo todos tres monolignols principal o sus precursores metabólicos así como varios monosacáridos que constituyen la matriz de polisacárido. Desde sus inicios, bioorthogonal química de hecho fue principalmente desarrollado para investigar glycans/polisacáridos a oligosacáridos metabólica Ingeniería (MOE)4,5,17,28, Pero sorprendentemente ha habido solamente muy pocas aplicaciones a biología de la planta hasta7,8,9,10,11,12. En cuanto a la compatibilidad de las reacciones, el estudio de la lignina fue de hecho un caso complejo para resolver como dos reporteros químicos se incorporan en el mismo polímero reticulado. La posibilidad de HAZ-GALK reticulación formación era el principal problema a superar debido a la proximidad espacial de GALK y HAZ unidades dentro de la 3D estructura de lignina23, una limitación que no puede estar presente si no se incorporan los dos reporteros de químicos en el mismo tipo de biopolímero o en la misma región espacial de cualquier célula dada.
En un ámbito más amplio la dicha metodología esencialmente podría aplicarse a cualquier estudio de imágenes de fluorescencia de dos colores en modelos animales o bacterianos utilizando dos reporteros química distintos teniendo una azida y etiqueta del alquino terminal, respectivamente.

En las últimas dos décadas, la estrategia de reportero químico ha emergido como una metodología de dos etapas de gran alcance para investigar la dinámica y funciones de biomoléculas no genéticamente codificados. 1 , 2 , 3 en esta estrategia un análogo sintético de la biomoléculas de interés con una modulación pequeña – el reportero químico – es primero metabolizado por el organismo vivo y luego una sonda química (por ej., un fluoróforo para fluorescencia proyección de imagen de la microscopia confocal) es covalente a la reportera incorporada vía química del tecleo de bioorthogonal. La sonda debe reaccionar rápidamente y específicamente con la modificación introducida química siendo inerte a cualquier biomoléculas presentes en el sistema de vida. En muchos sentidos, este método supera las limitaciones de técnicas bioconjugation comunes a través del uso altamente específico haga clic en trompas de química proporcionando así la oportunidad de rastrear metabolitos o biomacromoléculas que eran previamente inaccesibles en la vida de los sistemas4,5,6.
A pesar de la creciente popularidad de este poderoso método en células bacterianas y animales, informes que describen su uso en Biología Vegetal son sorprendentemente pocos y lejos entre7,8,9,10, 11,12. Estábamos particularmente interesados en la aplicación de esta estrategia en las plantas para el estudio de la formación de la lignina, uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. 13 , 14 la lignina es un polímero fenólico que desempeña una función estructural y protectora vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores.
Generalmente se compone de tres partes de 4-hydroxyphenylpropanoid: H (p- hidroxifenil), G (guaiacyl) y S (syringyl) unidades derivan respectivamente de tres 'monolignols' (p- coumaryl, coniférico sinapyl alcoholes y) que son sintetiza a través de la vía fenilpropanoide en el citoplasma de la célula (figura 1). Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. 15 , 16 aunque lignins impactan fuertemente la valorización industrial de muchos derivados de plantas productos, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrar los intrincados mecanismos de regulación lignificación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Figura 1: el proceso de lignificación en células de la planta. Monolignols es biosintetizada a partir de fenilalanina en el citosol. Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque los informes sobre el uso de reacciones bioorthogonal para el análisis de glicanos son numerosos,2,3,,17 sus ejemplos de aplicación a otros tipos de biomoléculas son menos. El uso de la química bioorthogonal lignina Bioimagen fines fue promovido recientemente por Tobimatsu et al. 8 en Arabidopsis thaliana para proporcionar información sobre la incorporación de coniférico sustitutos de alcohol en el polímero lignina donde forma las unidades de G,8,9 demostrando así la prueba de concepto que estrategias de reportero químico son aplicables en este contexto. El uso de CuAAC fue también ilustra usando un derivado de alcohol coniférico diferentes unos meses más tarde por Bukowski et al. 9 sin embargo, lignina también contiene unidades H y S y una comprensión más profunda del proceso de lignificación requiere más conocimientos sobre cómo de la monolignols son incorporados en el polímero y qué factores pueden controlar su composición. Nuevos avances en este campo actualmente dependen del desarrollo de metodologías eficientes para seguir simultáneamente varios reporteros químicos en sistemas vivos. A pesar de que algunos artículos sobre glicanos sentaron las bases en los últimos años18,19,20,21,22, doble etiquetado enfoques siguen siendo un reto importante en bioorthogonal química. Si un reproducible etiquetado solo haga clic en protocolo es difícil de desarrollar, entonces doble etiquetado enfoques que requieren la optimización en tándem de dos mutuamente compatible bioorthogonal reacciones en dos reporteros químicos separados están aún más difíciles. Los pocos ejemplos que fue pionera en este aspecto utilizan una combinación de tensión promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y las reacciones de Diels-Alder (DAinv) de demanda electrónica inversa alkene tetrazina para estudiar glycans en las células animales. Sin embargo, pensamos que la bioorthogonality de la reacción de DAinv no puede ser garantizado en esta aplicación debido a las características estructurales de la lignina (que consiste en monómeros ricos en electrones substituido cinamil-tipo que pueden reaccionar con los pobres en electrones Dienes como las sondas de tetrazina utilizadas en reacciones de DAinv) y que esto puede generar no específicos de etiquetado. Además, la reacción deinv DA requiere manijas químicos sintético difícil acceso, como abultado y lipofílico aumentando la posibilidad de que la tasa de incorporación, transporte o localización de la sustancia reportero en vivo puede verse afectada. Como considera que este último aspecto es particularmente relevante en el caso de un enfoque de química haga clic en para el estudio de lignificación, elegimos una dirección diferente y desarrollado una ligadura del Bioorthogonal imagen secuencial estrategia (BLISS) utilizando un combinación de cicloadición de azidas alquino Strain-Promoted (SPAAC) y cicloadición azida-alquino catalizada por el cobre (CuAAC) en vivo. 23
Estas dos reacciones son los dos bioorthogonal principales, haga clic en reacciones que se han utilizado hasta la fecha, y más particularmente en los pocos ejemplos de la lignina de imágenes han sido publicados recientemente. 8 , 9 nuestra estrategia etiquetado dual permite el uso de una molécula de azida en un monolignol reportero y un alquino terminal por el otro, dos manijas química i) unreactive hacia estructuras biológicamente relevantes y ii) muy pequeño de tamaño (figura 2 ). Como resultado, el impacto de estas modificaciones sintéticas sobre las propiedades fisicoquímicas de las biomoléculas en estudio se reduce al mínimo reduciendo así posibles discrepancias entre los sustratos de monolignol natural y antinatural en términos de transporte y tasas de metabolización durante la etapa de incorporación metabólica. Aunque la combinación de SPAAC y CuAAC parece muy intuitiva a primera vista, es a nuestro conocimiento sólo en el segundo ejemplo de marca dual con esta estrategia y la primera aplicación en estructuras que no sean de glicanos. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Figura 2: BLISS doble etiquetado estrategia. Química reporteros HAZ y GALK son análogos de etiquetado de la nativa monolignols H y G. En primer lugar se incorporan en los polímeros de lignina creciente de las paredes celulares por la alimentación exógena (paso 1). Cyclooctyne - y azida-functionalized sondas fluorescentes entonces se unen secuencialmente a los reporteros incorporados por bioorthogonal química click: la reacción de SPAAC (paso 2) es altamente específica del HAZ unidades y es seguida por un CuAAC reacción ( Paso 3) que es específico de GALK unidades (paso 3), lo que permite la localización específica de ambos reporteros independientemente en la misma muestra. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Diseñado en primer lugar y validado la azida-tagged monolignol reportero HAZ (sustituto de p- coumaryl alcohol) y precursor de las unidades de lignina H y entonces ideó dicha doble estrategia de etiquetado en el que se utiliza en conjunto con la había divulgado previamente etiquetado alquino GALK,9 (sustituto de alcohol coniférico) y precursor de las unidades de G de lignina. En el presente Protocolo reproducible desarrollada y probada en lino, una especie de planta económicamente importante, la doble incorporación metabólica de HAZ y GALK en lignina se logra primero antes de SPAAC/CuAAC secuencial etiquetado. Aquí, etiquetado HAZ unidades primero están marcadas específicamente por medio de la ligadura de la SPAAC de un fluoróforo cyclooctyne funcionalizados, seguida de ligadura CuAAC-mediada de una segunda sonda fluorescente etiquetado GALK unidades. Este método fue utilizado para investigar la dinámica de los procesos de lignificación de las paredes celulares y puede ser aplicada en vivo para cortes transversales, viven tallos y plántulas de diferentes especies de plantas.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

La lignina es uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. Este polímero fenólico desempeña un papel estructural y protección vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores. Aunque los intrincados mecanismos de regulación procesos de lignificación en vivo fuertemente impactan la valorización industrial de muchos productos de origen vegetal, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrarlos. En un flujo de trabajo de tres pasos simple, el protocolo de etiquetado doble aquí presentado permite estudios de Bioimagen de activamente lignifying zonas de tejidos de la planta. El primer paso consiste en la incorporación metabólica de dos reporteros químicas independientes, sustitutos de los dos monolignols nativas que dan lugar a lignina unidades H y G. Después de la incorporación al cultivo de polímeros de lignina, cada reportero entonces se etiqueta específicamente con su propia sonda fluorescente mediante una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC/CuAAC clic reacciones. Combinado con autofluorescencia de lignina, este enfoque conduce a la generación de mapas de localización tricolor de lignina en las paredes celulares por microscopía de fluorescencia confocal y proporciona información espacial precisa de la presencia o ausencia de activo maquinaria de lignificación en la escala de los tejidos vegetales, células y capas de la pared celular diferente.

Mediante el protocolo BLISS presentado con bioorthogonal y análogos sintéticos monolignol química click, es posible visualizar la dinámica del proceso de lignificación en plantas vivas. A diferencia de técnicas establecidas para lignina visualización (como histoquímicas tinción, inmunolocalización o autofluorescencia), esta 'doble clic' protocolo exclusivamente dirigida la lignina producida de novo durante la incorporación metabólica paso y se diferencia de la lignina preexistente de la muestra con la proyección de imagen celular triple-channel por microscopía de fluorescencia confocal (figura 3). H AZ-unidades se detectan utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión de la DBCO-PEG de4-5/6-carboxyrhodamine 110 que específicamente se hace clic en funciones azida de incorporado HAZ moléculas durante el paso SPAAC (λex 501 nm /λem 526 nm, canal verde), mientras que GALK-unidades del mismo modo se detectan en las longitudes de onda característica de la sonda de azidefluor 545 que específicamente se hace clic en las etiquetas del alquino terminal incorporado de G ALK durante el paso de CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, rojo canal); el tercer canal corresponde a lignina preexistente, que se detecta con su intrínseca autofluorescence a 405 nm (canal azul). Este enfoque conduce a la generación de mapas de localización tricolor de lignina en las paredes celulares que proporcionan información espacial precisa de la presencia o ausencia de maquinaria activa lignificación entre diferentes tejidos de un órgano (Figura 3A ), entre diferentes tipos de células dentro del tejido del mismo (figura 3B-C) y dentro de capas diferentes de la pared de la misma célula (figura 3D). En otras palabras, esta metodología nos permite resaltar y específicamente localizar los sitios de 'active' lignificación (HAZ y GALK canales) por diferenciación de zonas donde la lignina se formó en una anterior etapa de desarrollo de las plantas (canal de Autofluorescencia). Además, la sensibilidad de la técnica se ha mejorado dramáticamente en comparación con autofluorescencia, y menor cantidad de lignina recién sintetizada puede ser detectada (figura 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Figura 3: proyección de imagen de reporteros química monolignol incorporado en los tallos del lino. (A) la mitad de una sección transversal de un tallo de lino, imagen reconstruida hechos a mano. (B) primer plano de las primeras capas de diferenciación de xilema. Panel de la izquierda: autofluorescence de lignina (azul, 405 nm), el panel central: combinado autofluorescence de lignina (azul) y HAZ de la fluorescencia (verde, 526 nm) canales, panel de la derecha: fusionado autofluorescence de lignina (azul) y GALK fluorescencia (rojo, 565 nm) canales. La flecha indica la primera pared celular marcada desde el cambium que ilustra el aumento de la sensibilidad de la dicha en comparación con autofluorescencia. (C) etiquetado en celda diferente tipos de xilema secundario y (D) de cerca en las células de xilema secundario que ilustra las variaciones Etiquetadoras en diferentes capas de la pared celular mismo. Panel de la izquierda: combinado autofluorescence de lignina (azul) y HAZ de la fluorescencia (verde, 526 nm) canales, panel central: fusionado autofluorescence de lignina (azul) y fluorescencia GALK (565 rojo, nm) canales, derecho panel: combinado autofluorescence de lignina (azul), HAZ (verde) y los canales de fluorescencia GALK (rojo). HAZ y GALK co-localización es representado en amarillo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Estrategias de reportero químico como el método de BLISS presentado aquí o los procedimientos de etiquetado individual previamente publicados por Tobimatsu et al. 8 por lo tanto puede permitir un estudio mucho más fino que los métodos previamente accesibles como inmuno - tinción histoquímica siendo muy sencillo de implementar. Por ejemplo, la figura 4 muestra que la intensidad de la señal de HAZGincorporación deALK en fibras traqueidas/vasos (FT) del lino xilema secundario es muy alta en las primera algunas paredes celular del cambium, pero disminuye progresivamente en las células más viejas. Este perfil es contraria a la de la autofluorescencia e indica que lignificación máxima se alcanza muy rápidamente en las capas primeras dos a tres pies de cambium. En cambio, células de los radios (R) parecen seguir lignificación hasta mucho más tarde de su desarrollo como HAZGALK incorporación es mucho más constante en las paredes de todas las células del cambium de la corteza. No es sorprendente que FT y R tipos de células muestran dinámica contrastada lignificación, puesto que estos tipos celulares tienen diferentes funciones biológicas asociadas diferencias en su programa de desarrollo. FTs son tubos hecho alargados que maduran y mueren rápidamente, deja células muertas vacías con paredes lignificadas gruesas que desempeñan un papel esencial en el soporte mecánico y transporte vertical de agua y minerales, mientras que las estrechas filas de R las células componen el xilema los rayos están vivos en su estado maduro y funcional sin necesidad de paredes lignificadas gruesas.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Figura 4: incorporación de reportero de monolignol celular específica en el xilema lino. Vista de microscopía confocal de campo brillante (A) de parte de un corte transversal a mano alzada de un tallo de lino. Rosa (células de parénquima de ray, R) y amarillo (celulas traqueaba fibra FT) las flechas indican vectores que abarca desde la zona de cambium hacia la médula y se analiza para la autofluorescencia de la lignina a 405 nm (B), HAZ fluorescencia a 526 nm (C) y G ALK fluorescencia en 565 nm (D). (E) vista del xilema secundario. Panel de la izquierda: combina canales de fluorescencia (roja) de Autofluorescencia (azul), HAZ (verde) y GALK de lignina. HAZ y GALK co-localización es representado en amarillo. Panel de la derecha: ilustración esquemática de la estructura del xilema secundario en tallo lino. V, buque; FT, traqueaba fibra; R, células de parénquima de ray. Esta figura ha sido modificada desde León et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Además, el uso de dos distintos reporteros química correspondiente a H y G-unidades con dos reacciones de bioorthogonal en el protocolo de dicha permite más resultados cuantitativos obtenidos. Multiplexado de etiquetado estrategias tales como BLISS podría proporcionar perspectivas adicionales sobre el control de monolignol cocientes de la incorporación en condiciones diferentes y podría contribuir a descifrar el proceso de lignificación esquivo. Si los porcentajes relativos de H, G y S monolignols en ligninas de hecho son muy variables según la especie, tejido, edad o condiciones ambientales de la planta, los intrincados mecanismos que regulan esta composición son aún no totalmente comprendidos. La tecnología de etiquetado dual representa una poderosa manera de investigar algunos de los parámetros que regulan la composición de la lignina. Por ejemplo, variando la HAZ: GALK relación con BLISS nos permitió demostrar que la composición de la lignina en los tejidos del xilema secundario es depende directamente de la disponibilidad de monolignol dentro de las paredes celulares, en lugar de especificidad de peroxidasa/Lacasa (figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Figura 5: Efecto de la incubación de secciones de tallo de lino con diferentes porcentajes proporciones de HAZ y GALK. HAZ: GALK% relaciones se dan por encima de cada columna de cifras. Arriba: combinan canales HAZ y GALK . Abajo: histogramas que indica intensidad de fluorescencia media de HAZ y GALK para las proporciones de diferentes %. Los valores se expresan como la media de la intensidad de fluorescencia media en niveles de gris escala de SD. de la barra = 100 μm. esta figura ha sido modificada desde León et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Lino se cultiva por sus fibras de líber (BF) que se utilizan para la fabricación de textiles, artículos de lujo o materiales compuestos ecológicos. Un aspecto importante de su valorización industrial es que contienen niveles muy bajos de lignina en sus paredes celulares, que se caracterizan por un S2/G extremadamente gruesa capa secundaria19,24. BLISS puede resaltar las diferencias de dinámica de lignificación entre las diferentes capas de la pared celular mismo. La figura 6A muestra que HAZ y GALK la incorporación de reportero se limita a las esquinas de celular y laminilla media primario pared de célula de las fibras de líber de algunos pero no todos. La ausencia total de lignificación en la capa de la pared celular secundaria gruesa fibra de estopa incluso cuando reporteros química monolignol exógeno suministrado revela que su estado de hypolignified surge de la ausencia de un entorno molecular adecuado para oxidación enzimático mediada y de monolignols incorporación a una cadena creciente del polímero, y que no es sólo debido a la regulación transcripcional de los genes de biosíntesis de monolignol previamente reportaron25. Esta observación también correlaciona bien con el hecho de lino peroxidasa genes para arriba-se regulación en los tejidos del tallo exterior del químico lino lbf1 mutante que posee fibras lignificadas de bast26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Figura 6: BLISS destaca diferencias específicas de la subestructura o la capa de la pared celular. (A) panel de la izquierda: imagen de campo claro de una sección de tallo de lino. El círculo indica un haz de fibras. Panel derecho: cerrar en fibras de líber. Combina canales HAZ y GALK (con y sin campo brillante) mostrando que lignificación se limita a las esquinas de la célula (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) y laminilla media primario pared de célula de algunas fibras de líber. BF, fibra de la estopa; Par, células de parénquima; M, laminilla media; P, pared de célula primaria; S1, la primera capa de la pared celular secundaria; S2/G, secundaria capa/gelatinoso capa de la pared celular secundaria. Corte 2D (B) y reconstrucción 3D de zoom z-pila confocal de la región de la endodermis de la raíz lino. La banda de Caspary (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) sólo muestra Autofluorescencia y no incorporar HAZ o GALK. El fluorogram asociado muestra una GALK/hAZ la correlación: alta fluorescencia verde se asocia a baja señal roja (corteza) y viceversa (endodermis). Periciclo (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por último, esta metodología dos colores también puede proporcionar información valiosa sobre el 'estado de lignificación' de subestructuras de la pared celular en las distintas etapas del desarrollo y en órganos de la planta que no sea la madre. Por ejemplo, el endodermis de las raíces de lino se caracteriza por la existencia de una banda de Caspary en sus paredes celulares transversales y radiales durante las primeras etapas de desarrollo. Esta banda de biopolímero hidrofóbica, de suberina y lignina, evita que el agua y solutos por la raíz entren pasivamente a través del apoplasto y les obliga a pasar a través de la membrana del plasma vía simplástica contribuyendo así a la capacidad de absorción selectiva de raíces de la planta. Cuando se aplica a las raíces de lino, nuestra estrategia demostró que HAZ y GALK sean incorporadas en las paredes tangenciales de las células endodermales, así como en partes de las paredes radiales donde la banda de Caspary es ausente (Figura 6B). Sin embargo, la ausencia total de monolignol incorporación de reportero en la banda de Caspary sí mismo indica que es madura en esta etapa del desarrollo mientras que las otras paredes son todavía el sitio de deposición del biopolímero más. La vista 3D reconstruida de una pila de z claramente saca la banda de Caspary a la luz. Curiosamente, las paredes de algunas células corticales adyacentes al endodermis también demostró ser capaces de incorporar HAZ preferencial (lo que indica la presencia de lignina/suberina en la corteza de la raíz lino) pero no GALK. Análisis de colocalización demostraron una correlación contra entre HAZ y GALK, que sugieren la existencia de maquinaria enzimática/estructura pared celular específica en estos dos tipos de células adyacentes.
Suplemento tabla 1: preparación del medio sólido de MS ½ <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplemento tabla 2: preparación de soluciones stock de reportero químico <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, un etiquetado de dos protocolos para estudiar la dinámica de la lignificación, fue desarrollado. Con sintética monolignol reporteros y una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC y CuAAC haga clic en reacciones, esta pavimenta la manera a un análisis profundo de los factores que regulan la biogénesis de lignina en la plantade la metodología.

Visualización dinámica de lignificación en plantas con la química Click: doble etiquetado es felicidad!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K vistas.  Université de Lille. BLISS, un etiquetado de dos protocolos para estudiar la dinámica de la lignificación, fue desarrollado. Con sintética monolignol reporteros y una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC y CuAAC haga clic en reacciones, esta pavimenta la manera a un análisis profundo de los factores que regulan la biogénesis de lignina en la plantade la metodología.

Video: Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Investigación

Química

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Combinación de imágenes Raman y Análisis Multivariante para visualizar Lignina, Celulosa y Hemicelulosa en el Muro de la Célula Vegetal

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Bioquímica

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Medición de interacciones entre sondas fluorescentes y lignina en secciones de plantas por sFLIM basado en autofluorescencia nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biología

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

Imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular usando calcofluor en musgo Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Biología del Desarrollo

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopía de expansión para la visualización de glicanos sialilados intracelulares mediante MOE

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
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