Siamo in debito con il FRABio di Federazione di ricerca e la piattaforma di imaging TisBio (Univ. di Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Biomoléculaires Fonctionnelle des Assemblages) per fornire l'ambiente tecnico idoneo per realizzare questo lavoro.

Nota: Liquidi e solidi ½ MS media deve essere preparato in anticipo, come descritto nella tabella 1 supplementare.
1. pianta cultura
<ol><li>
Cultura delle piante del lino di 2 mesi
	<ol>
<li>Seminare i semi di lino (Linum usitatissimum L.) in vasi di plastica utilizzando terriccio.</li>
		<li>Crescere del lino in camere di crescita a 22 ° C con un fotoperiodo di 16 h/8 h giorno/notte.</li>
		<li>Dotare le piante con supporto verticale dopo 1 mese e crescere fino a quando essi sono 2 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura di 2 settimana-vecchio lino piantine
	<ol>
<li>12 semi di lino in un pezzo di panno di formaggio di avvolgere e fissare con un elastico per fare un fascio. Nota: Eseguire i passaggi successivi in condizioni di sterilità sotto una cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Posizionare il pacchetto di semi in una bottiglia di vetro precedentemente sterilizzati nell'autoclave 250 mL.</li>
		<li>Aggiungere 70 mL di 70% EtOH in bottiglia e delicatamente mescolare per 1 min.</li>
		<li>Rimuovere con cautela l'EtOH per decantazione, lasciando il bundle in bottiglia.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL di ipoclorito di sodio al 2% e mescolare delicatamente per 10 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di ipoclorito di sodio per decantazione, lasciando il bundle in bottiglia.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL di acqua distillata sterile e mescolare per 1 min.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.8 3 volte, aumentare il tempo di risciacquo per ogni risciacquo (5, 10 e 15 min).</li>
		<li>Scaldare mezzo solido ½ MS, versarlo in una scatola di cultura pianta sterile per un'altezza di 2 cm e lasciate raffreddare fino a solidificazione.</li>
		<li>Posizionare delicatamente ogni seme su terreno solido utilizzando pinze sterili.</li>
		<li>Chiudere la finestra di sterile.</li>
		<li>Trasferire la casella a una camera di crescita a 22 ° C con un fotoperiodo di 16 h/8 h giorno/notte e coltivare piantine di lino per 2 settimane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabolica incorporazione dei reporter chimico
Nota: Tre modelli sperimentali sono presentati di seguito: i) metabolica etichettatura di sezioni trasversali di staminali, ii) interi steli e iii) pianta piantine. Ogni protocollo è presentato per una replica biologico e quantità può essere adattata al numero di repliche biologiche necessarie. Le soluzioni di monolignol sono preparate dalle soluzioni di riserva che sono fatti come descritto in tabella 2 prima dell'esperimento. Le soluzioni di riserva possono essere memorizzate diversi mesi a-20 ° C. La HAZ: GALK o H:G proporzioni possono essere regolate per adattarsi tutti i disegni sperimentali su misura.
<ol><li>Incorporazione di chimica reporter in 2 sezioni trasversali di mese-vecchio lino staminali
	<ol>
<li>Preparare un 300 µ l di soluzione chimica reporter contenente 10 µM di GALK e 10 µM di HAZ in liquido sterile a ½ MS.</li>
		<li>Vortice HAZ/GALK soluzione e trasferirlo in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con una micropipetta.</li>
		<li>Preparare un 300 µ l di soluzione controllo negativo contenente 10 µM di G e 10 µM di H in mezzo liquido sterile di ½ MS.</li>
		<li>Vortice H/G di soluzione e trasferirlo in un secondo pozzetto della piastra 48-pozzo stesso.</li>
		<li>Tagliare il gambo di una pianta di lino mesi 2 a 10 cm sopra il livello del suolo utilizzando una nuova lama di rasoio.</li>
		<li>Delicatamente preparare 50 sezioni trasversali a mano libera del gambo con la lama di rasoio (circa 150-250 µm di spessore).</li>
		<li>Posizionare immediatamente le sezioni trasversali in mezzo ½ MS liquido sterile in un vetro da orologio.</li>
		<li>Ispezionare visivamente, selezionare sezioni trasversali tutta intatte e distribuire in modo casuale 10 dei quali in ben riempito con HAZ/GALK soluzione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.1.8 per ben riempito con H/G di soluzione (come controllo negativo).</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.1.8 per un terzo ben riempito con 300 µ l di terreno di ½ MS (come il controllo dello sfondo per regolare la linea di base di fluorescenza durante la successiva elaborazione di dati di immagini di microscopia confocale).</li>
		<li>Incubare la piastra a luce continua in una camera di crescita a 20 ° C per 20 h.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di monolignol in tutti i pozzetti con una micropipetta.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di ½ MS in ciascun pozzetto, mescolare delicatamente per 10 minuti e rimuovere questo risciacquo soluzione con una micropipetta. Ripetere 4 volte e procedere alla beatitudine etichettatura immediatamente (sezione 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporazione di chimica reporter in 2 mesi lino interi steli
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di reporter chimico 5 mL contenente 10 µM di GALK e 10 µM di HAZ in liquido sterile a ½ MS.</li>
		<li>Vortice HAZ/GALK soluzione e il trasferimento di un test di vetro alta 20 cm tubo con una pipetta.</li>
		<li>Preparare una soluzione di controllo negativo 5 mL contenente 10 µM di G e 10 µM di H in mezzo liquido sterile di ½ MS.</li>
		<li>Vortice H/G di soluzione e il trasferimento di un test di vetro alta 20 cm tubo.</li>
		<li>Preparare una terza provetta di vetro contenenti 5 mL di terreno di ½ MS (come il controllo dello sfondo per regolare la linea di base di fluorescenza durante la successiva elaborazione di dati di immagini di microscopia confocale).</li>
		<li>Tagliare il gambo di una pianta di lino mesi 2 a 10 cm sopra il livello del suolo utilizzando una nuova lama di rasoio. Scartare il sistema della radice e la parte inferiore del gambo e procedere al passaggio successivo con la parte superiore del gambo della pianta.</li>
		<li>Non immergere la base del tronco intero taglio in provetta contenente HAZ/GALK soluzione. Posizionare l'attacco nella sua soluzione di incubazione immediatamente dopo la rimozione dell'apparato radicale, al fine di evitare che si secchi. Nota: Se il metodo è applicato a piante più giovani/anziani e/o altre specie, il volume di monolignol soluzioni deve essere regolato secondo la dimensione / età della pianta e il diametro del suo tronco.</li>
		<li>Fissare lo stelo ad un supporto verticale per tenerlo dritto.</li>
		<li>Sigillare il tubo di vetro con parafilm per evitare l'evaporazione della soluzione.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.6-2.2.9 per il campione di controllo negativo con la H/G di soluzione.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.6-2.2.9 per il campione di controllo di priorità bassa fluorescenza contenente il mezzo di ½ MS.</li>
		<li>Incubare ogni stelo per 20 h in luce continua utilizzando una luce al neon.</li>
		<li>Dopo 20 h di incorporazione metabolica, rimuovere lo stelo incubato in HAZ/GALK soluzione e sciacquare con ½ MS Media.</li>
		<li>Tagliare e scartare la parte inferiore di 1 cm di fusto utilizzando una lama di rasoio e poi preparare un cilindro alto 1 cm dalla base del gambo restante.</li>
		<li>Con cura preparare 20 sezioni trasversali a mano libera (circa 150-250 µm di spessore) da questo cilindro e metterli immediatamente in un vetro da orologio riempito con ½ MS Media.</li>
		<li>Mettere 500 µ l di terreno di ½ MS in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.</li>
		<li>Ispezionare visivamente, selezionare sezioni trasversali tutta intatte e distribuire a caso 10 di loro nel pozzo riempito con soluzione ½ MS.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 2.2.13-2.2.17 per lo stelo di controllo negativo incubato con la soluzione di H/G .</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.13-2.2.17 per l'asta di regolazione di priorità bassa fluorescenza incubati con ½ MS Media.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione in tutti i pozzetti con una micropipetta.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di ½ MS in ciascun pozzetto, mescolare delicatamente per 10 minuti e rimuovere questo risciacquo soluzione con una micropipetta. Ripetere 4 volte e procedere alla beatitudine etichettatura immediatamente (sezione 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporazione di chimica reporter in 2 settimana-vecchio lino piantine Nota: I passaggi seguenti sono tutti realizzati in condizioni di sterilità.<ol>
<li>Preparare una soluzione di chimica reporter di 2 mL contenente 10 µM di GALK e 10 µM di HAZ in liquido sterile a ½ MS.</li>
		<li>Vortice HAZ/GALK soluzione e il trasferimento di un test di 20 cm-alto vetro tubo con una pipetta.</li>
		<li>Preparare una soluzione di controllo negativo di 2 mL contenente 10 µM di G e 10 µM di H in mezzo liquido sterile di ½ MS.</li>
		<li>Vortice H/G di soluzione e il trasferimento di un test di 20 cm-alto vetro tubo.</li>
		<li>Preparare una terza provetta di vetro alta 20 cm, contenenti 2 mL di terreno di ½ MS (come il controllo dello sfondo per regolare la linea di base di fluorescenza durante la successiva elaborazione di dati di immagini di microscopia confocale).</li>
		<li>Rimuovere delicatamente un semenzale di lino 2-settimana-vecchio da coltura solido ½ MS utilizzando un lungo paio di pinzette (sezione 1.2. sopra).</li>
		<li>Trasferire delicatamente la piantina nella provetta contenente il HAZ/GALK soluzione, assicurando che le sue radici sono immerse nella soluzione.</li>
		<li>Chiudere il tubo di vetro con un tappo di plastica per evitare l'evaporazione.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.6-2.3.8 per il tubo di controllo negativo con la H / G di soluzione.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.6-2.3.8 per il tubo di controllo di priorità bassa fluorescenza contenente il mezzo di ½ MS.</li>
		<li>Incubare ogni piantina in luce continua in una camera di crescita per 20 h a 20 ° C.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il semenzale incubato in HAZ/GALK soluzione e sciacquare con ½ MS Media.</li>
		<li>Preparare delicatamente a mano libera 20 sezioni trasversali (circa 150-250 µm di spessore) dell'ipocotile.</li>
		<li>Mettere 500 µ l di terreno di ½ MS in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.</li>
		<li>Ispezionare visivamente, selezionare sezioni trasversali tutta intatte e distribuire a caso 10 di loro nel pozzo riempito con soluzione ½ MS.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 2.3.12-2.3.15 per il semenzale di controllo negativo incubato con la soluzione di H/G .</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.12-2.3.15 per il semenzale di controllo di priorità bassa fluorescenza incubati con ½ MS Media.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione la soluzione in tutti i pozzetti con una micropipetta.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di terreno di ½ MS in ciascun pozzetto, mescolare delicatamente per 10 minuti e rimuovere questo risciacquo soluzione con una micropipetta. Ripetere 4 volte e procedere alla beatitudine etichettatura immediatamente (sezione 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Doppia fluorescenza etichettatura dei campioni di sezione trasversale di piante da SPAAC e CuAAC
Nota: La beatitudine etichettatura protocollo è identica per tutti i 3 modelli sperimentali (sezione 2).
<ol><li>
Ceppo-promosso etichettatura Azide-alchino cicloaddizione (SPAAC)
	<ol>
<li>Preparare 1 mL di una soluzione SPAAC contenente 5 µM di DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 in liquido sterile a ½ MS. Vortice la soluzione e tenerlo al buio.</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale passaggi del protocollo metabolico incorporazione [2.1.13, 2.2.21 o 2.3.19 a seconda il disegno sperimentale scelto], rimuovere il mezzo di ½ MS e aggiungere 300 µ l della soluzione SPAAC per pozzetto con una micropipetta.</li>
		<li>Scudo, la piastra dalla luce 48 coprendo con carta stagnola o inserendolo in una scatola.</li>
		<li>Mescolare delicatamente la piastra con un agitatore meccanico per 1 h al buio a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rame-catalizzata di etichettatura Azide-alchino cicloaddizione (CuAAC)
	<ol>
<li>Lavare ogni ben 4 volte come descritto nel passaggio 2.1.13 mantenendo la piastra al buio.</li>
		<li>Preparare 1 mL di una soluzione di CuAAC contenente l'ascorbato di sodio 2,5 mM, 0,5 mM CuSO4 e 5 µM 5-TAMRA-PEG3-azide in liquido sterile a ½ MS. Vortice la soluzione e tenerlo al buio. Nota: Questa soluzione di CuAAC dovrà essere preparata prima dell'uso e non può essere memorizzata più di un paio di giorni a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di ½ MS in ciascun pozzetto e direttamente aggiungere 300 µ l della soluzione CuAAC per bene usando una micropipetta.</li>
		<li>Mescolare delicatamente la piastra con un agitatore meccanico per 1 h al buio a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di CuAAC utilizzando una micropipetta.</li>
		<li>Usando una micropipetta, aggiungere 500 µ l di ½ MS, mescolare al buio per 10 minuti, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripetere due volte.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di una soluzione di metanolo/acqua di 7:3, mescolare al buio per 1 h, quindi rimuovere la soluzione Attenzione: Metanolo è tossico per contatto con la pelle o inalazione e viene designato come agente cancerogeno umano. Il suo utilizzo richiede guanti e cappe chimiche.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di ½ MS, mescolare al buio per 10 minuti, quindi rimuovere la soluzione. Ripetere 4 volte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. montaggio di campioni su microscopio Slides
<ol><li>Posto 5 gocce di mezzo di montaggio su un vetrino per microscopio.</li>
	<li>Deposito con attenzione ogni HAZ/GALKetichetta sezione trasversale sulla diapositiva.</li>
	<li>Applicare lo smalto su due lati opposti della diapositiva.</li>
	<li>Coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Fare attenzione a evitare bolle d'aria.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso con un tovagliolo di carta.</li>
	<li>Sigillare il campione con smalto per unghie su tutti e 4 i lati. Lasciate che il chiodo vernice asciugare a temperatura ambiente (circa 30 min).</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.6 per le sezioni trasversali di controllo negativo H/G .</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.6 per le sezioni di controllo di priorità bassa fluorescenza.</li>
	<li>Conservare i vetrini a 4 ° C al buio fino a osservazione al microscopio confocale. Nota: Vetrini preparati possono essere memorizzati per parecchie settimane a parecchi mesi a seconda della qualità della preparazione. Se una nuova osservazione deve essere fatta dopo il deposito, è necessario assicurarsi che i campioni non hanno prosciugato.</li>
</ol>5. immagine acquisizione mediante microscopia confocale a fluorescenza
<ol><li>Accendere tutte le unità necessarie del sistema di microscopia confocale nel giusto ordine secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Selezionare lo scopo perseguito con la massima apertura numerica e adattato le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione (ad esempio, obj. 60 x, N.A. 1.2. Canale di autofluorescenza: λex 405 nm, λem 450 nm 25; Canale HAZ SPAAC: λex 488 nm, λem 525 nm 25; CuAAC GALK canale: λex 561 nm, λem 595 nm 25; modalità sequenziale).</li>
	<li>Selezionare i parametri desiderati per la generazione di immagini nel software (12 - o 16 bit richiesto, dimensione pixel adattato per il criterio di Nyquist).</li>
	<li>Porre il vetrino HAZ/GALK sul tavolino del microscopio e posizionare il campione sotto la lente dell'obiettivo.</li>
	<li>Osservare e cercare l'area desiderata del tessuto della pianta.</li>
	<li>
Acquisire immagini confocal di alta qualità di doppiamente etichettato HAZ/g campioneALK .
	<ol>
<li>Selezionare il piano più fluorescente nell'asse z.</li>
		<li>Regolare il guadagno, potenza laser e offset per ottenere una distribuzione ottimale del segnale lungo l'intero grigio intervallo del livello per ogni canale (autofluorescenza, HAZ e GALK). Gli stessi parametri devono essere applicati per tutti i seguenti acquisizioni.</li>
		<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine selezionata e salvare il file. Ripetere per ogni area pertinente del campione. Nota: ricostruzioni 3D Z-stack possono essere acquisiti anche se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando le stesse impostazioni, acquisire immagini di campione senza tag solo incubati in ½ MS per determinare il livello di autofluorescenza (controllo di fluorescenza dello sfondo come descritto nella sezione 2).</li>
	<li>Utilizzando le stesse impostazioni, acquisizione di immagini per i campioni di controllo negativo incubati con nativo monolignols H/G per determinare aspecifici fluoroforo adesione al campione.</li>
	<li>Applicare il trattamento dei dati per le immagini acquisite a sottrarre sfondo autofluorescence segnali in entrambe le immagini di controllo negativo H/G e HAZ/GALK immagini.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Come accennato in precedenza, il doppio protocollo BLISS etichettatura presentato in questa carta è uno dei primi esempi di una combinazione SPAAC/CuAAC in vivo12,23. Ogni passaggio è stato accuratamente ottimizzato e validato, ed è molto importante che sia rispettato l'ordine in cui i due clic su Chimica reazioni d'etichettatura vengono eseguite in modo sequenziale (cioè, SPAAC in primo luogo, seguito da CuAAC). Tutti i controlli di croce ha mostrato che ogni passaggio d'etichettatura è specifico quando il protocollo di BLISS è applicata23 : prima svolgere il passo SPAAC conduce alla chemoselective altamente etichettatura delle funzioni di azideAZ Hdella Cyclooctyne-funzionalizzate fluoroforo attraverso una reazione di cicloaddizione [3 + 2] con la cinetica veloce. Una volta HAZ unità sono contrassegnati, il passo di CuAAC che richiedono l'attivazione di rame (i) catalizzata di GALK alchini terminali per generare i collegamenti triazolo da reazione con la sonda 545 azide-fluor può essere effettuato. Al contrario, l'ordine inverso (cioè, CuAAC in primo luogo, seguito da SPAAC) non deve essere utilizzato come porta ad unità GALK e HAZ Croce-accoppiamento, che compete con la legatura fluoroforo e induce una drammatica perdita di segnale . È anche importante sottolineare la necessità dei passaggi di lavaggio intermedio per evitare colorazione aspecifica.
Abbiamo dimostrato che il nostro metodo può essere applicato a vari disegni di esperimento biologico. La beatitudine etichettatura protocollo fu applicata per la prima volta a sezioni trasversali a mano libera dei gambi del lino (circa 150-250 µm di spessore) che sono stati precedentemente tagliati e incubati con il monolignols clic-ready. Sebbene questo disegno ha il vantaggio di ridurre al minimo le quantità necessarie di reporter chimico (come sono ridotti volumi di incubazione) e di facilitare la produzione delle ripetizioni di statistiche, non è, strettamente parlando, un sistema in vivo e in alcuni casi, potrebbero non riflettere tutti gli aspetti della dinamica di lignificazione reale spazio-temporali. In un secondo disegno sperimentale, abbiamo adattato di conseguenza il protocollo BLISS a un metodo che è stato precedentemente utilizzato per studiare l'incorporazione di radiomarcato monolignols in pino e gingko27. In questo approccio, le radici e il gambo della pianta sono fisicamente separati e la base del gambo intero viene incubata nella soluzione monolignol in quello che può essere chiamato l'approccio di 'vaso di fiori'. Dopo aver lasciato i gambi il tempo desiderato (incubazione), sezioni trasversali sono il taglio e il protocollo di BLISS eseguita. Questo ci ha permesso di mostrare (i) che il monolignols modificate sono trasportati attraverso lo stelo di vivere e sono incorporati nella coltivazione di polimeri di lignina entro le pareti della cellula e (ii) che il modello di localizzazione era sostanzialmente identico a quella della sezione trasversale approccio. Questo tipo di esperimento ha il merito di essere eseguita in una pianta vivente reale / cellula viva approccio consentendo più esperimenti e studi più approfonditi, ma richiede una maggiore quantità di chimica reporter. Infine, il protocollo di beatitudine fu utilizzato anche con semenzali della pianta del lino, che rappresenta un vero e proprio living modello d'impianto in cui i giornalisti chimici devono essere assorbiti attraverso le radici prima di essere trasportati il gambo. Mentre questo modello ha il chiaro vantaggio di essere eseguita in piante vive, in pratica, è limitato ai giovani semenzali e non è molto adatto per lo studio di dinamiche di lignificazione nei vecchi impianti per motivi pratici (tempo di incubazione lungo, elevato quantità di giornalisti chimici). Tuttavia, questi disegni tre esperimento sono complementari e tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi per quanto riguarda gli aspetti pratici e significato biologico a seconda del tipo di domanda biologica a cui rispondere.
Sviluppato per lo studio della dinamica di lignificazione in lino, il nostro protocollo è altamente adattabile, non solo in termini di design esperimento biologico, ma anche in termini di sua applicazione altra pianta specie e organi/tessuti. Per esempio, BLISS possono essere facilmente trasferiti per l'Arabidopsis o generi Populus che sono più favorevoli agli studi con mutanti knock-out o knock-down per vari geni. In linea di principio, gli studi d'etichettatura dual con il nostro approccio possono essere esteso anche ad altre biomolecole utilizzando due distinti modificati precursori dei polimeri di parete cellulare vegetale - tra cui tutti i tre principali monolignols o loro precursori metabolici così come vari monosaccaridi che costituiscono la matrice polisaccaridica. Fin dalla sua nascita, bioorthogonal chimica è infatti stato principalmente sviluppato per indagare glicani/polisaccaridi attraverso metabolica oligosaccaride ingegneria (MOE)4,5,17,28, ma sorprendentemente ci sono stati solo pochissime applicazioni di biologia della pianta finora7,8,9,10,11,12. In termini di compatibilità delle reazioni, lo studio della lignina era infatti un complesso caso da risolvere come entrambi giornalisti chimici sono incorporati nel polimero reticolato stesso. La possibilità di adenoide HAZ-GALK cross-link formazione era il problema principale da superare dovuto la prossimità spaziale di GALK e HAZ unità entro il 3D struttura della lignina23, una limitazione che potrebbe non essere presente se i due reporter chimici non sono incorporati nello stesso tipo di biopolimero o nella stessa regione spaziale di ogni cellula.
In un ambito più ampio della metodologia di BLISS essenzialmente potrebbe essere applicata a qualsiasi studio di formazione immagine di fluorescenza di due colori nei modelli batteriche o animale utilizzando due distinti reporter chimico recanti un'azide e tag di alchini terminali, rispettivamente.

Negli ultimi due decenni, la strategia chimica reporter è emerso come una metodologia potente in due fasi per studiare le dinamiche e le funzioni delle biomolecole non geneticamente codificato. 1 , 2 , 3 in questa strategia un analogo sintetico di biomolecole di interesse con una modulazione piccola – il reporter chimico – in primo luogo viene metabolizzato dall'organismo vivente e quindi una sonda chimica (ad es., un fluoroforo per fluorescenza formazione immagine di microscopia confocale) è covalentemente al reporter incorporata tramite bioorthogonal clic chimica. La sonda deve reagire rapidamente e in modo specifico con la modificazione chimica introdotta pur essendo inerte a qualsiasi biomolecole presenti nel sistema vivente. In molti modi, questo metodo supera i limiti delle tecniche di bioconjugation comuni attraverso l'uso di legature di chimica altamente specifico clicca fornendo in tal modo la possibilità di tenere traccia di metaboliti o biomacromolecules che prima erano inaccessibili nella vita di sistemi4,5,6.
Nonostante la crescente popolarità di questo metodo potente in cellule batteriche e animali, rapporti che descrivono il suo uso in biologia vegetale sono sorprendentemente pochi e lontani tra7,8,9,10, 11,12. Eravamo particolarmente interessati nell'applicare questa strategia in piante di studiare la formazione della lignina, uno dei biopolimeri più diffusi del pianeta e una componente importante della coltura da biomassa lignocellulosica. 13 , 14 la lignina è un polimero fenolico che svolge un ruolo strutturale e protezione vitale nello sviluppo e nella vita delle piante superiori.
Generalmente è composto da tre gruppi di 4-hydroxyphenylpropanoid: H (p- idrossifenil), G (guaiacyl) e S (syringyl) unità derivate rispettivamente da tre 'monolignols' (p- coumaryl, coniferilico e sinapilico alcool) che sono sintetizzati attraverso la via fenilpropanoide nel citoplasma della cellula (Figura 1). Dopo essere esportati verso la parete cellulare, sono ossidati monolignols ai radicali di perossidasi o laccasi dopo che subiscono reazioni di accoppiamento radicale puramente chimico di polimerizzare a polimeri lignina, un processo definito lignificazione. 15 , 16 anche se le lignine impatto fortemente la valorizzazione industriale di molti vegetali prodotti, la comunità scientifica ha ancora una lunga strada da percorrere per decifrare i complessi meccanismi che regolano la lignificazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Figura 1: il processo di lignificazione nelle cellule vegetali. Monolignols sono biosynthesized da fenilalanina nel citosol. Dopo essere esportati verso la parete cellulare, sono ossidati monolignols ai radicali di perossidasi o laccasi dopo che subiscono reazioni di accoppiamento radicale puramente chimico di polimerizzare a polimeri lignina, un processo definito lignificazione. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Anche se numerosi rapporti sull'uso delle reazioni di bioorthogonal per l'analisi di glycan,2,3,17 loro esempi di applicazione ad altri tipi di biomolecole sono meno. L'uso di bioorthogonal chimica fini bioimaging lignina solo recentemente è stata introdotta da Tobimatsu et al. 8 in Arabidopsis thaliana per fornire informazioni sull'incorporazione di coniferil surrogati di alcol al polimero di lignina dove forma l'unità G,8,9 , dimostrando così la prova del concetto che strategie di chimica reporter sono applicabili in questo contesto. L'uso di CuAAC è stato anche illustrato utilizzando un derivato di Alcol coniferilico diverso qualche mese più tardi da Bukowski et al. 9 tuttavia, lignina inoltre contiene unità H e S e una più profonda comprensione del processo di lignificazione richiede più la conoscenza di come tutti i monolignols sono incorporati in polimero e quali fattori possono controllare la sua composizione. Nuovi progressi in questo campo dipendono attualmente lo sviluppo di metodologie efficaci per tenere traccia di reporter chimici multipli simultaneamente nei sistemi viventi. Anche se un paio di articoli su glicani hanno gettato le basi in ultimi anni18,19,20,21,22, doppia etichettatura approcci rimangono una sfida importante in bioorthogonal chimica. Se un protocollo riproducibile di clic singolo-etichettatura è difficile da sviluppare, quindi doppia etichettatura approcci che richiedono l'ottimizzazione in tandem di due reciprocamente compatibili bioorthogonal reazioni su due reporter chimico separato sono ancora più difficile. I pochi esempi che è stato il pioniere di questo aspetto ha usato una combinazione di ceppo-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e reazioni di Diels-Alder (DAinv) alchenico-tetrazine inversa richiesta elettronica per studiare glicani in cellule animali. Tuttavia, abbiamo pensato che il bioorthogonality della reazione DAinv potrebbe non essere garantito in questa applicazione a causa delle caratteristiche strutturali della lignina (che è costituito da monomeri di elettrone-ricchi sostituito cinnamil-tipo che possono reagire con carente di elettroni dieni come le sonde tetrazine utilizzate nelle reazioni di DAinv) e che questo potrebbe generare contrassegno non specifico. Inoltre, la reazione diinv DA richiede maniglie chimiche che sono sinteticamente difficile accesso, oltre ad essere ingombranti e lipofilico quindi sollevando la possibilità che il tasso di incorporazione, di trasporto e/o di localizzazione del prodotto chimico Reporter in vivo potrebbe essere interessato. Come abbiamo considerato che quest'ultimo aspetto è stato particolarmente rilevante nel caso di un approccio di chimica di click per lo studio di lignificazione, abbiamo scelto una direzione diversa e sviluppato un Bioorthogonal legatura Imaging sequenziale strategia (beatitudine) utilizzando un combinazione di Strain-Promoted Azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame catalizzato Azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in vivo. 23
Queste due reazioni sono infatti le due bioorthogonal principale fare clic su reazioni che sono stati utilizzati fino ad oggi, e più particolarmente in pochi esempi di lignina imaging che sono stati recentemente pubblicati. 8 , 9 il nostro duplice strategia di etichettatura consente l'utilizzo di una parte di azide sul un monolignol reporter e un alchino terminale da altro, due maniglie chimiche che sono ii) molto piccole dimensioni (Figura 2 e i) non reattivo verso biologicamente rilevanti strutture ). Di conseguenza, l'impatto di queste modifiche sintetiche sulle proprietà fisico-chimiche della biomolecola sotto studio è ridotto al minimo riducendo così possibili discrepanze tra i substrati monolignol innaturale e naturale in termini di trasporto e tariffe di metabolizzazione durante la fase di incorporazione metabolica. Sebbene la combinazione di SPAAC e CuAAC sembra molto intuitiva a prima vista, è a nostra conoscenza solo nel secondo esempio di doppia marcatura utilizzando questa strategia e la prima applicazione su strutture diverse da glicani. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Figura 2: BLISS doppia etichettatura strategia. Reporter chimico HAZ e GALK sono taggati analoghi del nativo monolignols H e G. In primo luogo sono incorporati nei polimeri di lignina crescente delle pareti della cellula alimentando esogeno (passaggio 1). Cyclooctyne e azide-funzionalizzati sonde fluorescenti in sequenza sono quindi legati ai reporter incorporato di bioorthogonal clic su chimica: la reazione di SPAAC (passaggio 2) è altamente specifica di unità HAZ ed è seguita da una (reazione di CuAAC Passo 3) che è specifico di unità GALK (passaggio 3), permettendo così la localizzazione specifica di entrambi giornalisti indipendentemente nello stesso campione. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Abbiamo in primo luogo progettato e convalidato l'azoturo-etichetta monolignol reporter HAZ (surrogato di p- coumaryl alcohol) e precursore delle unità di lignina H e poi messo a punto la strategia di etichettatura dual BLISS in cui è utilizzato in tandem con il precedentemente segnalati alchino-etichetta GALK,9 (surrogato di Alcol coniferilico) e precursore delle unità G lignina. In questo protocollo riproducibile sviluppato e testato in lino, una specie di pianta economicamente importante, l'incorporazione di metabolica dual di HAZ e GALK in lignina è in primo luogo raggiunto prima del sequenziale SPAAC/CuAAC etichettatura. Qui, con tag HAZ unità in primo luogo sono etichettati in particolare tramite la legatura di SPAAC di un fluoroforo cyclooctyne-funzionalizzati, seguita da CuAAC-mediato legatura di una seconda sonda fluorescente su tagged GALK unità. Questo metodo è stato usato per studiare la dinamica dei processi di lignificazione all'interno di pareti cellulari della pianta e può essere applicata in vivo per arginare le sezioni trasversali, vivono steli, come pure le piantine di diverse specie vegetali.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

La lignina è uno dei biopolimeri più diffusi del pianeta e una componente importante della coltura da biomassa lignocellulosica. Questo polimero fenolico gioca un ruolo strutturale e protettivo nello sviluppo e nella vita delle piante superiori. Anche se i meccanismi intricati che regolano processi lignificazione in vivo fortemente impatto la valorizzazione industriale di molti prodotti di origine vegetale, la comunità scientifica ha ancora una lunga strada da percorrere per decifrarli. In un semplice workflow di tre fasi, il doppio protocollo d'etichettatura presentato qui permette studi di Bioimmagini di attivamente lignifying zone di tessuti vegetali. Il primo passo consiste nell'incorporazione metabolica di due reporter indipendente chimico, surrogati dei due monolignols nativo che danno origine alla lignina unità H e G. Dopo l'incorporazione in polimeri di lignina in crescita, ogni giornalista quindi è specificamente etichettata con propria sonda fluorescente tramite una combinazione sequenza di bioorthogonal SPAAC/CuAAC clic reazioni. Combinato con lignina autofluorescenza, questo approccio conduce alla generazione di mappe di localizzazione tre colori della lignina all'interno di pareti cellulari della pianta mediante microscopia a fluorescenza confocale e fornisce precise informazioni spaziali sulla presenza o sull'assenza del principio attivo macchinari di lignificazione alla scala di tessuti vegetali, cellule e parete cellulare diversi strati.

Utilizzando il protocollo presentato di BLISS che coinvolge bioorthogonal e gli analoghi sintetici monolignol scegliere chimica, è possibile visualizzare le dinamiche del processo di lignificazione in piante viventi. A differenza di tecniche consolidate per lignina visualizzazione (ad esempio istochimiche macchiatura, immunolocalizzazione o autofluorescenza), questo 'doppio click' protocollo esclusivamente mira la lignina prodotto de novo durante l'incorporazione metabolica passo e lo differenzia dalla lignina preesistente del campione con triplo canale imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza confocale (Figura 3). H AZ-unità vengono rilevati utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione della DBCO-PEG4-5/6-carboxyrhodamine 110 che specificamente si fa clic su funzioni di azoturo di incorporati HAZ molecole durante il passo SPAAC (λex 501 nm/λem 526 nm, canale verde), mentre GALK-unità allo stesso modo vengono rilevati presso le lunghezze d'onda caratteristiche della sonda azidefluor 545 che specificamente è cliccato sui tag incorporato alchini terminali di G ALK durante il passo di CuAAC (canale nm, rosso λex 546 nm/λem 565); il terzo canale corrisponde alla lignina pre-esistente, che è rilevato usando la sua intrinseco autofluorescence a 405 nm (canale blu). Questo approccio porta alla generazione di mappe di localizzazione tre colori della lignina all'interno di pareti cellulari della pianta che forniscono informazioni precise spaziale sulla presenza o assenza di macchinari di lignificazione attivo tra diversi tessuti di un organo (Figura 3A ), tra diversi tipi di cellule all'interno del tessuto stesso (Figura 3B-C) e all'interno di strati diversi della parete della cellula stessa (Figura 3D). In altre parole, questa metodologia ci permette di evidenziare e localizzare in modo specifico i siti di lignificazione 'attivo' (HAZ e GALK canali) da differenziandoli da zone dove la lignina è formata presso una precedente fase di sviluppo di pianta (autofluorescenza canale). Inoltre, la sensibilità della tecnica è migliorata drammaticamente rispetto ad autofluorescenza, e molto più piccola quantità di lignina appena sintetizzato può essere rilevato (Figura 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Figura 3: Imaging dei reporter chimico monolignol incorporato in lino steli. (A) la metà di una sezione trasversale fatta a mano di un gambo del lino, l'immagine ricostruita. (B) Close-up dei primi strati di differenziazione xylem. Pannello sinistro: lignina autofluorescenza (blu, 405 nm), Pannello centrale: fuse lignina autofluorescenza (blu) e HAZ fluorescenza (verde, 526 nm) canali, Pannello di destra: fuse lignina autofluorescenza (blu) e GALK fluorescenza (rosso, 565 nm) canali. La freccia indica la prima parete cellulare con etichetta dal cambio che illustrano la sensibilità aumentata di beatitudine confrontato con autofluorescenza. (C) etichettatura nella cella diversa tipi di xylem secondario e (D) si chiudono su cellule di xylem secondario che illustra le variazioni d'etichettatura in diversi strati della parete della cellula stessa. Pannello sinistro: fuse lignina autofluorescenza (blu) e HAZ fluorescenza (verde, 526 nm) canali, Pannello centrale: fuse lignina autofluorescenza (blu) e fluorescenza GALK (rosso, 565 nm) canali, diritto pannello: fuse lignina autofluorescenza (blu), HAZ (verde) e i canali di fluorescenza GALK (rosso). HAZ e GALK co-localizzazione è raffigurata in giallo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Strategie di reporter chimico come il metodo BLISS presentato qui o le procedure di etichettatura singolo precedentemente pubblicate da Tobimatsu et al. 8 può pertanto consentire uno studio molto più preciso rispetto ai metodi precedentemente accessibili come immuno - o colorazione istochimica pur essendo molto semplice da implementare. Per esempio, la figura 4 illustra che l'intensità del segnale per HAZ/GALK incorporazione in fibra tracheidi/navi (FT) di lino xilema secondario è molto elevato nelle pareti cellulari pochi prime dal cambio ma diminuisce progressivamente nelle cellule vecchie. Questo profilo è opposta a quella del autofluorescence e indica che quel lignificazione massima viene raggiunta molto rapidamente nei primi strati delle cellule due o tre FT dal cambio. Al contrario, il raggio (R) cellule sembrano continuare lignificazione a più stadi del loro sviluppo come HAZ/GALK incorporazione è molto più costante nelle pareti di tutte le cellule dal cambio per il midollo. Non sorprende che tipi di cellule FT e R visualizzare contrasto lignificazione dinamiche, poiché questi tipi di cellule hanno diversi ruoli biologici con associate differenze nel loro programma di sviluppo. FTs sono tubi infatti allungate che maturo e muoiono rapidamente, lasciando le cellule morto vuote con spesse mura lignificata che svolgono un ruolo essenziale supporto meccanico e trasporto verticale di acqua e minerali, e considerando che le righe strette di R cellule che compongono lo xilema i raggi sono vivi nel loro stato maturo e funzionale senza avere pareti spesse lignificate.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Figura 4: incorporazione di reporter monolignol cellula-specifico in lino xilema. Vista di microscopia confocale Bright-campo (A) di parte di una sezione trasversale a mano libera da uno stelo di lino. Rosa (ray parenchima cellule, R) e giallo (cellule della fibra tracheid, FT) frecce indicano vettori si estende dalla zona cambial verso il midollo e analizzati per lignina autofluorescence a 405 nm (B), HAZ fluorescenza a 526 nm (C) e G ALK fluorescenza a 565 nm (D). (E) View di xilema secondario. Pannello sinistro: fuse canali lignina autofluorescenza (blu), HAZ (verde) e GALK fluorescenza (rossa). HAZ e GALK co-localizzazione è raffigurata in giallo. Pannello di destra: illustrazione schematica della struttura secondaria xilema nel gambo del lino. V, vaso; FT, tracheid fibra; R, cellula del parenchima di ray. Questa figura è stata modificata da Lion et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Inoltre, l'uso di due distinti reporter chimico corrispondente a H e G-unità con due bioorthogonal reazioni nel protocollo BLISS permette di ottenere più risultati quantitativi. Multiplexed etichettatura strategie come BLISS potrebbe fornire ulteriori approfondimenti sul controllo dei monolignol rapporti di incorporazione in varie condizioni e potrebbe contribuire a decifrare il processo di lignificazione sfuggente. Se le percentuali relative dei monolignols H, G e S in lignine sono infatti molto variabile secondo la specie, tessuto, età o condizioni ambientali dell'impianto, è possibile che i complessi meccanismi che regolano questa composizione ancora non completamente sono capiti. La tecnologia d'etichettatura dual rappresenta un potente modo di indagare alcuni dei parametri che regolano la composizione di lignina. Ad esempio, variando la HAZ: GALK rapporto con BLISS ha permesso di dimostrare che composizione di lignina in tessuti di xylem secondario dipende direttamente dalla disponibilità monolignol all'interno delle pareti delle cellule, piuttosto che su perossidasi/laccasi specificità (Figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Figura 5: Effetto di incubazione sezioni di gambo del lino con percentuali differenti rapporti di HAZ e GALK. HAZ: rapporti di % GALKsono dato sopra ogni colonna delle figure. Top: fuse canali HAZ e GALK . Fondo: gli istogrammi che indica l'intensità di fluorescenza media di HAZ e GALK per i rapporti diversi %. I valori sono espressi come media dell'intensità media di fluorescenza in livelli di grigio ± SD. scala bar = 100 µm. questa figura è stata modificata da Lion et al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lino viene coltivato per le sue fibre liberiane (BF) che vengono utilizzati per la fabbricazione di prodotti tessili, articoli di lusso o materiali compositi eco-compatibili. Un aspetto importante della loro valorizzazione industriale è che essi contengono livelli molto bassi di lignina in loro pareti della cellula, che sono caratterizzati da un forte spessore S2/G strato secondario19,24. BLISS può evidenziare le differenze di dinamica di lignificazione tra i diversi strati della parete della cellula stessa. Figura 6A Mostra che HAZ e GALK incorporazione di reporter sono limitati a cella angoli e parete cellulare medio lamella/primario di alcune ma non tutte le fibre liberiane. La totale assenza di lignificazione nello strato parete spessa liberiane fibra cella secondaria anche quando monolignol chimica reporter sono esogenicamente fornito rivela che il loro stato di hypolignified nasce dall'assenza di un ambiente molecolare adatto l'ossidazione mediata enzimaticamente e incorporazione di monolignols in una catena crescente del polimero, e che non è solo a causa di regolazione trascrizionale di geni di biosintesi di monolignol come precedentemente segnalato25. Questa osservazione anche correla bene con il fatto che lino perossidasi geni sono up-regolati nei tessuti del lino chimica lbf1 mutante che possiede fibre Liberiane lignificata26stelo esterno.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Figura 6: BLISS evidenzia differenze specifiche della sottostruttura o strato di parete cellulare. Pannello di sinistra (A): campo chiaro immagine di una sezione di fusto del lino. Il cerchio indica un fascio di fibre ottiche. Pannello di destra: stretta su fibre liberiane. Fuse canali HAZ e GALK (con e senza campo chiaro) mostrando che lignificazione è limitata agli angoli delle cellule (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) e parete cellulare medio lamella/primario di alcune fibre liberiane. BF, liberiane fibra; Par, cellula del parenchima; M, lamella centrale; P, parete primaria delle cellule; S1, il primo strato della parete cellulare secondario; S2/G, secondario strato/gelatinoso strato della parete cellulare secondario. (B) 2D fetta e ricostruzione 3D della z-stack di confocal zoom della regione endodermis radice del lino. La striscia di Casparian (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) solo Visualizza autofluorescenza e non incorporare HAZ o GALK. L'associato fluorografia Mostra un GALK/hAZ anti-correlazione: alta fluorescenza verde è associato a basso segnale rosso (corteccia) e vice-versa (endodermis). Periciclo (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Infine, questa metodologia di due colori può anche fornire informazioni preziose sullo 'stato lignificazione' della parete cellulare sottostrutture alle varie fasi di sviluppo e in altri organi della pianta rispetto lo stelo. Per esempio, endodermis delle radici del lino è caratterizzato dall'esistenza di una banda di Casparian nelle sue pareti cellulari radiali e trasversali durante le prime fasi di sviluppo. Questa banda di biopolimero idrofobo, fatto di Suberina e/o lignina, impedisce di acqua e soluti presi dalla radice penetri passivamente attraverso l'apoplasto e li costringe a passare attraverso la membrana plasmatica tramite un itinerario simplastico contribuendo così alla capacità di assorbimento selettivo delle radici delle piante. Quando applicato alle radici del lino, la nostra strategia ha mostrato che HAZ e GALK sono incorporati nelle pareti tangenziali delle cellule endodermiche pure come nelle parti dei muri radiali dove la band di Casparian è assente (Figura 6B). Tuttavia, totale assenza di incorporazione di reporter monolignol nella banda Casparian sé indica che è maturo in questa fase inerente allo sviluppo mentre le altre pareti sono ancora il sito di deposizione di biopolimero ulteriormente. Visualizzazione 3D ricostruita di uno z-stack porta chiaramente la band Casparian alla luce. Interessante, le pareti di alcune cellule corticali adiacenti al endodermis anche dimostrato in grado di incorporare HAZ preferenzialmente (indicando così la presenza di lignina/suberina nella corteccia radice del lino) ma non GALK. Analisi di co-localizzazione ha mostrato un'anti-correlazione tra HAZ e GALK, che suggeriscono l'esistenza di macchinario struttura/enzimatico parete cellula-specifico in questi due tipi di cellule adiacenti.
Supplementare tabella 1: preparazione del mezzo solido ½ MS <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare tabella 2: preparazione delle soluzioni madri chimica reporter <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, un doppio protocollo d'etichettatura per lo studio delle dinamiche di lignificazione, è stato sviluppato. Utilizzando sintetico monolignol reporter e una combinazione sequenza di SPAAC e CuAAC bioorthogonal fare clic su reazioni, apre questa metodologia il modo per un'analisi approfondita dei fattori che regolano la biogenesi di lignine in planta.

Visualizzazione di lignificazione Dynamics in piante con chimica clicca: doppia etichettatura è beatitudine!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

visualizing-lignification-dynamics-plants-with-click-chemistry-dual

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K Views.  Université de Lille. BLISS, un doppio protocollo d'etichettatura per lo studio delle dinamiche di lignificazione, è stato sviluppato. Utilizzando sintetico monolignol reporter e una combinazione sequenza di SPAAC e CuAAC bioorthogonal fare clic su reazioni, apre questa metodologia il modo per un'analisi approfondita dei fattori che regolano la biogenesi di lignine in planta.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Ricerca

Chimica

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Biochimica

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base all'autofluorescenza nativa

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Senza etichetta In situ</emImaging> di lignificazione in pareti delle cellule vegetali

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biologia

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Biologia dello sviluppo

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia ad espansione per la visualizzazione di glicani sialilati intracellulari tramite MOE

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
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In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
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Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
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Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

Marcatura metabolica

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

Visualizzazione di lignificazione Dynamics in piante con chimica clicca: doppia etichettatura è beatitudine!

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Analizzando la dinamica delle proteine che utilizzano l'idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

Misurazione delle interazioni tra sonde fluorescenti e lignina nelle sezioni delle piante mediante sFLIM in base all'autofluorescenza nativa

Senza etichetta In situ di lignificazione in pareti delle cellule vegetali

Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens

Colorazione istochimica di

Visualizzazione della sialilazione intracellulare con la chimica a scatto e la microscopia ad espansione

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