Wir sind verpflichtet, die Forschung Verband FRABio und die TisBio imaging Plattform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblagen Biomoléculaires) für die Bereitstellung der technischen Rahmenbedingungen zur Erreichung dieses Ziels arbeiten.

Hinweis: Flüssige und feste ½ MS Medien müssen vorher wie in ergänzenden Tabelle1beschrieben vorbereitet werden.
1. die Pflanzenkultur
<ol><li>
Kultur der 2 Monate alten Flachs Pflanzen
	<ol>
<li>Säen Sie Flachs (Linum Usitatissimum L.), in Kunststoff-Töpfe mit Blumenerde Kompost.</li>
		<li>Wachsen Flachs in Klimakammern bei 22 ° C mit einer Photoperiode von 16 h/8 h Tag/Nacht.</li>
		<li>Statten Sie Pflanzen mit vertikalen Stütze nach 1 Monat und wachsen Sie, bis sie 2 Monate alt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur von 2 Wochen alten Flachs Sämlinge
	<ol>
<li>12 Leinsamen in ein Stück Käse Tuch wickeln und mit einem Gummiband zu einem Bündel zu beheben. Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte unter sterilen Bedingungen unter einem Laminar-Flow-Abzug.</li>
		<li>Legen Sie die Samen-Bundle in einer zuvor autoklaviert 250 mL Glasflasche.</li>
		<li>Fügen Sie 70 mL 70 % EtOH in der Flasche und sanft für 1 min rühren.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die EtOH durch Dekantieren beim Verlassen des Bündels in die Flasche.</li>
		<li>100 mL 2 % Natriumhypochlorit zugeben und 10 Minuten sanft köcheln.</li>
		<li>Entfernen Sie die Natriumhypochlorit-Lösung durch Dekantieren beim Verlassen des Bündels in die Flasche.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5-1.2.6.</li>
		<li>100 mL sterilen Reinstwasser hinzufügen und 1 min. köcheln.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3 Mal auf Erhöhung der Spülung Zeit für jedes spülen (5, 10 und 15 min).</li>
		<li>Festen ½ MS Medium warm, Gießen Sie sie in eine sterile Pflanze-Kultur-Box bis zu einer Höhe von 2 cm und abkühlen lassen bis zum erstarren.</li>
		<li>Zart legen Sie jeder Samen auf festem Medium mit sterilen Pinzette.</li>
		<li>Schließen Sie das steril.</li>
		<li>Übertragen Sie die Box zu einer Kammer, Wachstum bei 22 ° C mit einer Photoperiode von 16 h/8 h Tag/Nacht und Flachs Sämlinge für 2 Wochen zu wachsen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabolische Einbeziehung der Chemie Reporter
Hinweis: Drei experimentelle Modelle sind nachstehend: i) metabolische Kennzeichnung von Stammzellen Querschnitte, Ii) ganze Stengel und (Iii) Pflanzensämlinge. Jedes Protokoll ist für eine biologische replizieren vorgestellt und Mengen lässt sich die Anzahl der erforderlichen biologischen Replikationen anpassen. Monolignol Lösungen sind aus Stammlösungen hergestellt, die vorgenommen werden, wie in Tabelle 2 vor dem Experiment beschrieben. Die Stammlösungen können mehrere Monate bei-20 ° c gelagert werden Die HAZ: GALK oder H:G Proportionen können angepasst werden, um alle experimentellen Sonderanfertigungen passen.
<ol><li>Chemie Reporter Einbindung in 2 Monate alten Flachs Stamm Querschnitte
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 300 µL Chemie Reporter Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und überträgt es auf einen Brunnen einer 48-Well-Platte mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 300 µL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und auf einen zweiten Brunnen von den gleichen 48-Well-Platte übertragen.</li>
		<li>Schneiden Sie den Stiel eines 2 Monate alten Flachs-Pflanze 10 cm über dem Boden mit einer neuen Rasierklinge.</li>
		<li>Bereiten Sie zart 50 Freihand transversalen Querschnitte des Stammes mit der Rasierklinge (ca. 150-250 µm dick).</li>
		<li>Die Querschnitte sofort in sterile ½ MS Flüssigmedium in einem Uhrglas statt.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie erhalten ganze Querschnitte und zufällig verteilen 10 davon in der gut gefüllten mit HAZ/GALK -Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 für den gut gefüllten mit H/G Lösung (als Negativkontrolle).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 ein Drittel gut gefüllt mit 300 µL ½ MS Medium (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte in Dauerlicht in einer Kammer Wachstum bei 20 ° C für 20 h.</li>
		<li>Entfernen Sie die Monolignol-Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Chemie Reporter Einbindung in 2 Monate alten Flachs ganze Stiele
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 5 mL-Chemie Reporter-Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube mit einer Pipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 mL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube.</li>
		<li>Bereiten Sie eine dritte Reagenzglas mit 5 mL Medium ½ MS (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Schneiden Sie den Stiel eines 2 Monate alten Flachs-Pflanze 10 cm über dem Boden mit einer neuen Rasierklinge. Das Wurzelsystem und unteren Teil des Stammes wegschütten und fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt mit dem oberen Teil der Pflanzenstängel.</li>
		<li>Tauchen Sie die Basis des ganzen Schnitt Stammes in das Röhrchen mit dem HAZ/GALK -Lösung. Legen Sie den Stamm in die Inkubation Lösung unmittelbar nach Entnahme des Wurzelsystems um es vor dem Austrocknen zu verhindern. Hinweis: Wenn die Methode auf jüngere/ältere Pflanzen und/oder andere Arten angewendet wird, die Lautstärke von Monolignol Lösungen muss eingestellt werden je nach Größe / Alter der Pflanze und der Durchmesser der seinen Stamm.</li>
		<li>Legen Sie den Stamm auf einer vertikalen Stütze, es gerade zu halten.</li>
		<li>Versiegeln Sie das Glasrohr mit Parafilm Verdampfung der Lösung zu vermeiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.9 für die negativ-Kontrolle-Probe mit dem H/G -Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.9 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrollprobe mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie jeder Stamm für 20 h im Dauerlicht mit einer Neon-Licht.</li>
		<li>Nach 20 Uhr metabolische Gründungsurkunde, entfernen Sie den Stiel in der HAZinkubiert /GALK Lösung und spülen Sie ihn mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Geschnitten Sie und verwerfen Sie unten 1 cm des Stiels mit einer Rasierklinge zu und dann bereiten Sie einen 1 cm hohen Zylinder von der Basis des restlichen Stammes.</li>
		<li>Sorgfältig bereiten Sie 20 Freihand transversalen Querschnitte (ca. 150-250 µm dick) aus dieser Zylinder und legen Sie sie sofort in einem Uhrglas mit ½ MS Medium gefüllt.</li>
		<li>Setzen Sie 500 µL ½ MS Medium in einem Brunnen der 48-Well-Platte.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie intakt ganze Querschnitte und 10 von ihnen in den Brunnen gefüllt mit ½ MS Lösung zufällig zu verteilen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13-2.2.17 für die Negativkontrolle Schaft mit H/G Lösung inkubiert.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13-2.2.17 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrolle Schaft mit ½ MS Medium inkubiert.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Einbindung der Chemie Reporter in 2 Wochen alten Flachs Sämlinge Hinweis: Die folgenden Schritte sind alle unter sterilen Bedingungen durchgeführt.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 2 mL Chemie Reporter Lösung mit 10 µM GALK und 10 µM von HAZ in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Vortex HAZ/GALK Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube mit einer Pipette.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 2 mL Negativkontrolle Lösung mit 10 µM g und 10 µM von H in sterilen ½ MS Flüssigmedium.</li>
		<li>Wirbel der H/G -Lösung und Transfer zu einer 20 cm hohen Glas-Test tube.</li>
		<li>Bereiten Sie eine dritte 20 cm hohen Reagenzglas mit 2 mL ½ MS Medium (als Hintergrund Drehregler zum Einstellen der Fluoreszenz-Baseline während der Weiterverarbeitung der Daten der konfokalen Mikroskopie Bilder).</li>
		<li>Zart einen 2 Wochen alten Flachs Sämling aus der festen ½ MS Medium mit einer langen Pinzette entfernen (Abschnitt 1.2. oben).</li>
		<li>Den Keimling sanft auf das Röhrchen mit der HAZübertragen /GALK Lösung, um sicherzustellen, dass seine Wurzeln in die Lösung eingetaucht werden.</li>
		<li>Schließen Sie das Glasrohr mit einer Kunststoffkappe um Verdunstung zu vermeiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die Negativkontrolle Röhre mit dem H / G-Lösung.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die Fluoreszenz Hintergrund Steuerrohr mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Inkubieren Sie jeder Sämling in Dauerlicht in einer Kammer Wachstum 20 h bei 20 ° C.</li>
		<li>Zart entfernen den Keimling in der HAZinkubiert /GALK Lösung und spülen Sie ihn mit ½ MS Medium.</li>
		<li>Bereiten Sie zart 20 Freihand Querschnitte (ca. 150-250 µm Dicke) der Keimachse.</li>
		<li>Setzen Sie 500 µL ½ MS Medium in einem Brunnen der 48-Well-Platte.</li>
		<li>Sichtprüfung und wählen Sie intakt ganze Querschnitte und 10 von ihnen in den Brunnen gefüllt mit ½ MS Lösung zufällig zu verteilen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.12-2.3.15 für die Negativkontrolle Sämling mit H/G Lösung inkubiert.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.12-2.3.15 für die Fluoreszenz Hintergrund Kontrolle Sämling mit ½ MS Medium inkubiert.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Lösung in jedem Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Jedes gut 500 µL ½ MS Medium hinzufügen, 10 Minuten sanft köcheln und entfernen Sie diese Lösung mit einer Mikropipette spülen. 4 Mal wiederholen und weiter zum Glück sofort beschriften (Abschnitt 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. dual Fluoreszenz Kennzeichnung von Pflanzenproben Querschnitt durch SPAAC und CuAAC
Hinweis: Die Seligkeit Kennzeichnung Protokoll ist identisch für alle 3 experimentelle Modelle (Abschnitt 2).
<ol><li>
Stamm-gefördert Kennzeichnung Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC)
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 mL einer SPAAC Lösung mit 5 µM DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 in sterilen ½ MS Flüssigmedium. Wirbel die Lösung und im Dunkeln halten.</li>
		<li>Nach dem letzten Waschen Schritte des metabolischen Einbeziehung Protokolls [2.1.13, 2.2.21 oder 2.3.19 je nach der gewählten Versuchsanordnung], entfernen das ½ MS Medium und 300 µL der SPAAC Lösung pro Bohrloch mit einer Mikropipette.</li>
		<li>48-Well-Platte vor Licht zu schützen, durch abdecken mit Alufolie oder indem man sie in eine Box.</li>
		<li>Rühren Sie die Platte leicht auf einem mechanischen Schüttler für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kupfer-katalysierte Kennzeichnung Azid-Alkinen Cycloaddition (CuAAC)
	<ol>
<li>Waschen Sie jeweils gut 4 mal wie beschrieben im Schritt 2.1.13 unter Beibehaltung der Plattenrandes im Dunkeln.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mL einer CuAAC Lösung mit 2,5 mM Natrium Ascorbat, 0,5 mM CuSO4 und 5 µM 5-TAMRA-PEG3-Azid in sterilen ½ MS Flüssigmedium. Wirbel die Lösung und im Dunkeln halten. Hinweis: Diese CuAAC Lösung muss vor Gebrauch frisch vorbereitet werden und kann nicht mehr als ein paar Tage bei 4 ° c gelagert werden</li>
		<li>Entfernen Sie das ½ MS Medium in jedem Bohrloch zu und fügen Sie direkt 300 µL der CuAAC Lösung pro nun mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Rühren Sie die Platte leicht auf einem mechanischen Schüttler für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die CuAAC-Lösung mit einer Mikropipette.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette, fügen Sie ½ MS 500 µL, im Dunkeln für 10 min rühren Sie, dann entfernen Sie diese Waschlösung. Zweimal wiederholen.</li>
		<li>500 µL einer 7:3-MeOH/Wasser-Lösung hinzufügen, rühren in der Dunkelheit für 1 h dann entfernen Sie die Lösung Achtung: Methanol ist giftig durch Hautkontakt oder einatmen, und bezeichnet man als menschliches Karzinogen. Die Nutzung erfordert chemischen Rauch Hauben und Handschuhe.</li>
		<li>Fügen Sie ½ MS 500 µL, in der Dunkelheit für 10 min rühren Sie, dann entfernen Sie die Lösung. Wiederholen Sie 4 Mal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Montage der Proben auf Mikroskop gleitet
<ol><li>Platz 5 Tropfen Eindeckmittel auf einen Glas-Objektträger.</li>
	<li>Hinterlegen sorgfältig jede HAZ/GALKQuerschnitt auf der Folie markiert.</li>
	<li>Nagellack auf zwei gegenüberliegenden Seiten der Folie auftragen.</li>
	<li>Decken Sie die Folie mit einem Deckgläschen. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Eindeckmittel mit einem Papiertuch.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Probe mit Nagellack auf allen 4 Seiten. Lassen Sie den Nagel Lack trocken bei Raumtemperatur (ca. 30 min).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 für die Negativkontrolle H/G Querschnitte.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 für die Fluoreszenz-Hintergrund-Kontrolle-Querschnitte.</li>
	<li>Lagern Sie die Folien bei 4 ° C bis zur Beobachtung unter einem confocal Mikroskop im Dunkeln. Hinweis: Unterschiedliche Musterpräparate können für mehrere Wochen bis zu mehreren Monaten, abhängig von der Qualität der Zubereitung gespeichert werden. Wenn eine neue Beobachtung soll erfolgen nach Lagerung, sicherzustellen, dass die Proben nicht ausgetrocknet.</li>
</ol>5. die Bilderfassung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Schalten Sie alle benötigten Einheiten des Systems der konfokalen Mikroskopie in der richtigen Reihenfolge gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Wählen Sie das gewünschte Ziel mit maximaler numerischer Apertur und Anregung und Emission Wellenlängen angepasst (z.B. obj 60 X, N.A. 1.2. Autofluoreszenz Kanal: λex 405 nm, λEm 450 nm 25; SPAAC HAZ Kanal: λex 488 nm, λEm 525 nm 25; CuAAC GALK Kanal: λex 561 nm, λEm 595 nm 25; sequenziellen Modus).</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschten Parameter für die Generierung von Bildern in der Software (12 oder 16-Bit erforderlich, Pixelgröße angepasst an das Nyquist-Kriterium).</li>
	<li>Legen Sie die Folie HAZ/gALK auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie die Probe unter der Objektivlinse.</li>
	<li>Beobachten Sie und finden Sie die gewünschte Region von Pflanzengewebe.</li>
	<li>
Erwerben Sie qualitativ hochwertige konfokale Bilder von doppelt beschriftete HAZ/gALK Probe.
	<ol>
<li>Wählen Sie die am meisten fluoreszierende Ebene in der z-Achse.</li>
		<li>Stellen Sie zu gewinnen, Offset und Laser macht, optimale Signalverteilung entlang der gesamten grauen Pegelbereich für jeden Kanal (Autofluoreszenz, HAZ und GALK) zu erreichen. Die gleichen Parameter müssen alle folgenden Akquisitionen beantragt werden.</li>
		<li>Den Erwerb des ausgewählten Bilds zu starten und die Datei speichern. Wiederholen Sie für jeden relevanten Bereich der Probe. Hinweis: 3D-Rekonstruktionen Z-Stapel können auch bei Bedarf erworben werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit den gleichen Einstellungen, erwerben Sie Bilder untagged Probe nur in ½ MS die Autofluoreszenz bestimmen (Fluoreszenz Hintergrundkontrolle wie in Abschnitt 2 beschrieben) inkubiert.</li>
	<li>Mit den gleichen Einstellungen, Abrufen von Bildern für die Negativkontrolle Proben inkubiert mit nativen Monolignols H/G unspezifische Fluorophor Haftung auf die Probe zu bestimmen.</li>
	<li>Datenverarbeitung auf die erworbenen Bilder zu subtrahieren Hintergrund Autofluoreszenz Signale in H/G Negativkontrolle Bilder und HAZ/gALK Bilder anwenden.</li>
</ol>

<ol>
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Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wie bereits erwähnt ist das duale Kennzeichnung BLISS Protokoll in diesem Papier präsentiert eines der ersten Beispiele für eine SPAAC/CuAAC Kombination in Vivo12,23. Jeder Schritt wurde gründlich optimiert und validiert, und es ist sehr wichtig, dass die Reihenfolge, in der die beiden klicken Chemie Kennzeichnung Reaktionen werden sequentiell durchgeführt, eingehalten wird (d. h. SPAAC zuerst, gefolgt von CuAAC). Alle Kreuz-Kontrollen haben gezeigt, dass jede Kennzeichnung Schritt spezifisch ist, wenn das BLISS-Protokoll angewandte23 ist : Durchführung der SPAAC Schritt führt zunächst zu hoch chemische Kennzeichnung HAZ -Azid Funktionen durch die Cyclooctyne funktionalisiert Fluorophor durch Reaktion mit schnellen Kinetik [3 + 2] Cycloaddition. Nachdem HAZ Einheiten markiert sind, kann der CuAAC Schritt erfordern copper(I) katalysiert Aktivierung von GALK terminal Alkinen Generierung von Triazol Links durch Reaktion mit der Azid-Fluor-545-Sonde erfolgen. Im Gegensatz dazu der umgekehrten Reihenfolge (d. h. CuAAC zuerst, gefolgt von SPAAC) sollte nicht verwendet werden, da sie zu GALK und HAZ Einheit führt Kreuz-Kupplung, die konkurriert mit Fluorophor Ligatur und führt zu einen dramatischen Verlust des Signals . Es ist auch wichtig zu betonen die Notwendigkeit, die zwischengeschalteten Waschschritten unspezifische Färbung zu vermeiden.
Wir haben gezeigt, dass unsere Methode auf verschiedenen biologischen Experiment Designs angewendet werden kann. Die Glückseligkeit Kennzeichnung Protokoll war zunächst auf Freihand Querschnitte der Flachs Stämme (ca. 150-250 µm dick) aufgetragen, die zuvor schneiden und mit der Klick-Ready Monolignols inkubiert wurden. Obwohl diese Konstruktion den Vorteil, die benötigten Mengen an Chemie Reporter hat (wie Inkubation Volumen reduziert werden) zu minimieren und die Produktion von statistischen Wiederholungen zu erleichtern, ist es nicht, streng genommen, eine in Vivo -System und in einigen Fällen können nicht alle Aspekte der real räumlich-zeitliche Lignification Dynamik wider. In einer zweiten experimentellen Design passten wir daher das BLISS-Protokoll an eine Methode, die zuvor verwendet wurde, um die Aufnahme der radioaktiven Monolignols im Kiefer und Gingko27zu studieren. Bei diesem Ansatz die Wurzeln und Stängel der Pflanze sind räumlich getrennt und die Basis des ganzen Stammes wird in der Monolignol Lösung in was "Blumenvase" Ansatz genannt werden kann inkubiert. Nach dem Ausscheiden aus den Stielen der gewünschten (Inkubationszeit), werden Querschnitte geschnitten und das BLISS-Protokoll durchgeführt. Dies erlaubt uns zu zeigen, (i) dass die geänderten Monolignols durch den lebenden Stamm transportiert werden und fließen in den wachsenden Polymere Lignin in den Zellwänden und (Ii), dass die Lokalisierung Muster im Wesentlichen identisch mit dem des Querschnitts Ansatz. Diese Art von Experiment hat das Verdienst, in eine echte lebende Pflanze durchgeführt / live Zelle nähern, so dass mehr Experimente und mehr eingehende Studien, erfordert aber größere Mengen an Chemie Reporter. Schließlich diente das BLISS-Protokoll auch mit Flachs-Pflanze-Sämlinge, vertritt eine echte Streckenmodell, in denen der Chemie Reporter durch die Wurzeln aufgenommen werden müssen vor dem Transport, des Stamms, lebt. Während dieses Modell hat den klaren Vorteil in lebenden Pflanzen, in der Praxis durchgeführt wird es beschränkt sich auf Jungpflanzen und eignet sich nicht wirklich für die Untersuchung von Lignification Dynamik in Altanlagen aus praktischen Gründen (lange Inkubationszeit, erhöhte Menge der Chemie Reporter). Dennoch, diese drei Experiment Designs ergänzen und alle haben ihre vor- und Nachteile im Hinblick auf die praktischen Aspekte und biologische Bedeutung abhängig von der biologischen Frage beantwortet werden.
Entwickelt, um die Lignification Dynamik im Flachs zu studieren, unser Protokoll ist sehr anpassungsfähig, nicht nur in Bezug auf biologische Experiment Design, sondern auch im Hinblick auf seine Anwendung auf andere Pflanzen Arten und Organe/Gewebe. BLISS kann beispielsweise leicht übertragen werden, der Arabidopsis oder die Populus-Gattungen, die besser geeignet, um Studien mit Knock Out "oder" Knock-Down durch Mutation entstehende Variationen für verschiedene Gene sind. Im Prinzip können doppelte Kennzeichnung Studien mit unserem Ansatz auch auf andere Biomoleküle erweitert werden mithilfe von zwei verschiedene modifizierten Vorstufen der pflanzlichen Zellwand Polymere - einschließlich aller drei wichtigsten Monolignols oder ihre metabolische Vorläufer sowie diverse Monosaccharide, die die Polysaccharid-Matrix darstellen. Seit seiner Gründung wurde Bioorthogonal Chemie in der Tat hauptsächlich entwickelt, um Glykane/Polysaccharide durch metabolische Oligosaccharid engineering (MOE)4,5,17,28zu untersuchen, aber überraschenderweise gab es nur sehr wenige Anwendungen, Biologie Pflanzen bisher7,8,9,10,11,12. Im Hinblick auf die Kompatibilität der Reaktionen war die Studie von Lignin in der Tat einem komplexen Fall zu lösen, da beide chemischen Reporter in der gleichen netzförmigen Polymer eingearbeitet werden. Die Möglichkeit der unbeschrifteten HAZ- warGALK Querverbindung entsteht Bildung das Hauptproblem, aufgrund der räumlichen Nähe der GALK und HAZ Einheiten innerhalb der 3D zu überwinden Struktur von Lignin23, eine Einschränkung, die möglicherweise nicht vorhanden, wenn die beiden chemischen Reporter nicht einbezogen werden in die gleiche Art von Biopolymer oder in der gleichen räumlichen Region einer bestimmten Zelle.
In größerem Umfang konnte die BLISS-Methodik im Wesentlichen auf eine Zweifarben-Fluoreszenz imaging Studie in Bakterien oder tierischen Modellen, die mit zwei unterschiedlichen chemischen Reporter trägt ein Azid und terminal Alkinen Tag, bzw. angewendet werden.

In den letzten zwei Jahrzehnten entstanden die Chemie Reporter-Strategie als eine leistungsstarke zweistufige Methodik, die Dynamik und die Funktionen der nicht genetisch codierte Biomoleküle zu untersuchen. 1 , 2 , 3 in dieser Strategie ein synthetisches Analogon das Biomolekül von Interesse mit einer kleinen Modulation – der Chemie Reporter – ist zunächst metabolisiert des lebenden Organismus, und dann eine chemische Sonde (zB., ein Fluorophor für Fluoreszenz konfokale Mikroskopie-Tomographie) ist der eingebaute Reporter über Bioorthogonal Click Chemie kovalent verbunden. Die Sonde muss rasch und gezielt reagieren mit der eingeführten chemische Modifikation während inert gegenüber jedem Biomoleküle im lebenden System vorhanden. Diese Methode überwindet in vielerlei Hinsicht die Grenzen der gemeinsamen Biokonjugaten Techniken durch den Einsatz von hochspezifischen Klick Chemie man damit die Möglichkeit zu verfolgen, Metaboliten oder Biomakromoleküle, die zuvor nicht zugänglich waren in lebenden Systemen4,5,6.
Trotz der schnell wachsenden Popularität dieser mächtigen Methode in bakterielle und tierischen Zellen sind Berichte über den Einsatz in Pflanzenbiologie überraschend wenige und weit zwischen7,8,9,10, 11,12. Wir interessierten uns vor allem bei der Anwendung dieser Strategie in Pflanzen, die Bildung von Lignin, eines der am weitesten verbreiteten Biopolymere auf dem Planeten und ein wichtiger Bestandteil von Lignozellulose Biomasse zu studieren. 13 , 14 Lignin ist ein phenolischen Polymer, das spielt eine wichtige strukturelle und schützende Rolle in der Entwicklung und Leben der höheren Pflanzen.
Es besteht im Allgemeinen aus drei 4-Hydroxyphenylpropanoid Moieties: H (p- Hydroxyphenyl), G (Guaiacyl) und S (Syringyl) Einheiten bzw. abgeleitet von drei "Monolignols" (p- Coumaryl, Coniferyl und Sinapyl Alkohole) sind über den Phenylpropanoid Weg im Zytoplasma der Zelle (Abbildung 1) synthetisiert. Nach dem Export in der Zellwand, Monolignols oxidiert sind radikale durch Peroxidasen oder Laccases nach dem durchlaufen sie rein chemischen radikalen Kupplungsreaktionen Lignin Polymere polymerisieren, bezeichnet ein Prozess Lignification. 15 , 16 obwohl Lignine stark beeinflussen die industrielle Verwertung vieler pflanzlicher Produkte, die wissenschaftliche Gemeinschaft hat noch einen langen Weg zu gehen, um die komplizierten Mechanismen Lignification zu entschlüsseln.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Abbildung 1: der Lignification-Prozess in Pflanzenzellen. Monolignols sind Biosynthesized aus Phenylalanin in der Zellflüssigkeit. Nach dem Export in der Zellwand, Monolignols oxidiert sind radikale durch Peroxidasen oder Laccases nach dem durchlaufen sie rein chemischen radikalen Kupplungsreaktionen Lignin Polymere polymerisieren, bezeichnet ein Prozess Lignification. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Obwohl Berichte über den Einsatz von Bioorthogonal Reaktionen Glycan Analyse zahlreich sind, sind2,3,17 ihre Anwendungsbeispiele auf andere Arten von Biomolekülen weniger. Die Verwendung der Bioorthogonal Chemie für Lignin Bioimaging Zwecke wurde erst vor kurzem erstmals von Tobimatsu Et al. 8 in Arabidopsis Thaliana über die Einbeziehung von Coniferyl Alkohol Surrogate in das Polymer Lignin informieren wo es bildet die G-Einheiten,8,9 so demonstriert die Machbarkeitsstudie, die Chemie Reporter Strategien gelten in diesem Zusammenhang. Die Verwendung von CuAAC wurde auch anhand eine unterschiedliche Coniferyl-Alkohol-Derivat ein paar Monate später von Bukowski Et Al. 9 jedoch Lignin enthält auch H und S Einheiten und ein tieferes Verständnis des Lignification Prozesses erfordert mehr wissen über wie alle die Monolignols in das Polymer einbezogen werden und welche Faktoren kann Einfluss auf seine Zusammensetzung. Neue Fortschritte in diesem Bereich ist heute abhängig von der Entwicklung von effizienten Methoden mehrere chemische Reporter in lebenden Systemen gleichzeitig verfolgen. Obwohl ein paar Artikel über Glykoproteinen in den letzten Jahren18,19,die Grundlagen haben bleibt20,21,22, doppelte Kennzeichnung Ansätze eine große Herausforderung dar Bioorthogonal Chemie. Wenn eine reproduzierbare Single-Beschriftung klicken Sie auf Protokoll ist schwer zu entwickeln, dann doppelte Kennzeichnung Ansätze, die die Optimierung im Tandem von zwei sich gegenseitig erfordern sind kompatibel Bioorthogonal Reaktionen auf zwei separaten chemischen Reporter noch schwieriger. Die wenigen Beispiele, die diesen Aspekt Pionier verwendet eine Kombination von Stamm-gefördert-Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC) und Alken-kurz inverse elektronische Nachfrage Diels-Alder (DAInv) Reaktionen Glykoproteinen in tierischen Zellen zu studieren. Allerdings dachten wir, dass die Bioorthogonality der DAinv Reaktion nicht in dieser Anwendung aufgrund der strukturellen Merkmale des Lignins garantiert werden könnte (bestehend aus elektronenreichen substituierte Cinnamyl-Art Monomere, die mit Elektron-Armen reagieren können Dienes wie die kurz-Sonden verwendet im DAinv Reaktionen) und dass das unspezifische Kennzeichnung erzeugen kann. Darüber hinaus erfordert die DAInv Reaktion chemische Griffe, die synthetisch schwer zu Zugang, wie auch als sperrig und lipophilen erhöhen dadurch die Möglichkeit, dass die Rate der Aufnahme, Transport und/oder Lokalisierung der chemischen Industrie Reporter in Vivo können betroffen sein. Gelten wir als sei Letzteres besonders relevant bei einem Klick Chemie Ansatz für das Studium Lignification, wir entschieden eine andere Richtung und entwickelt eine Bioorthogonal Ligation Imaging sequentielle Strategie (Glückseligkeit) mit einem Kombination von Strain-Promoted Azid-Alkinen Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer katalysierte Azid-Alkinen Cycloaddition (CuAAC) in-vivo. 23
Diese zwei Reaktionen sind in der Tat die zwei wichtigsten Bioorthogonal klicken Sie auf Reaktionen, die bisher verwendet wurden, und vor allem in der wenigen Beispiele des Lignins imaging, die wurden vor kurzem veröffentlicht. 8 , 9 unsere Doppelstrategie Kennzeichnung ermöglicht den Einsatz einer Azid glyko-auf einem Monolignol Reporter und ein terminal Alkinen andererseits zwei chemischen Griffe, die (i) Plattierung in Richtung biologisch relevante Strukturen und (Ii) sehr klein (Abbildung 2 ). Infolgedessen wird die Auswirkungen dieser synthetischen Modifikationen auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der das Biomolekül untersuchten minimiert, wodurch mögliche Diskrepanzen zwischen den natürlichen und unnatürlichen Monolignol Substraten in den Bereichen Verkehr und Metabolization Preise während der metabolische Aufnahme Schritt. Obwohl die Kombination von SPAAC und CuAAC auf den ersten Blick sehr intuitiv scheint, ist es nach unserer Kenntnis nur das zweite Beispiel doppelte Kennzeichnung mit dieser Strategie und die erste Anwendung auf Strukturen als Glykoproteinen. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Abbildung 2: BLISS doppelte Kennzeichnung Strategie. Tagged Analoga von native H und G Monolignols sind chemische Reporter HAZ und GALK . Sie fließen zunächst in die wachsende Lignin Polymere der Zellwände durch exogene Fütterung (Schritt 1). Cyclooctyne - und Azid-funktionalisiert fluoreszierende Sonden werden dann nacheinander auf die eingebaute Reporter durch Bioorthogonal ligiert Chemie klicken: die SPAAC Reaktion (Schritt 2) ist hochspezifisch HAZ Einheiten und ist gefolgt von einer CuAAC Reaktion ( Schritt 3), das ist spezifisch GALK Einheiten (Schritt 3), so dass die konkrete Lokalisierung von beiden Reportern unabhängig voneinander in der gleichen Probe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wir erstens entwickelt und validiert das Azid-Tags Monolignol Reporter HAZ (Ersatz von p- Coumaryl Spiritus) und Vorläufer des Lignins H Einheiten und dann entwickelt der Glückseligkeit Kennzeichnung Doppelstrategie in dem dient es zusammen mit der zuvor berichtete Alkinen getaggt GALK,9 (Ersatz von Coniferyl Alkohol) und Vorläufer des Lignins G Einheiten. In diesem reproduzierbare Protokoll entwickelt und getestet in Flachs ist eine wirtschaftlich bedeutende Pflanzenarten, die dual metabolische Einbindung der HAZ und GALK in Lignin zuerst vor dem sequentiellen SPAAC/CuAAC erreicht. Kennzeichnung. Hier sind tagged HAZ Einheiten zunächst speziell über die SPAAC Ligatur der ein Cyclooctyne funktionalisiert Fluorophor, gefolgt von CuAAC-vermittelten Ligatur von zweiten fluoreszierende Sonden auf tagged GALK gekennzeichnet Einheiten. Diese Methode kann wurde verwendet, um die Dynamik von Lignification Prozessen in pflanzlichen Zellwänden zu untersuchen und angewandte in Vivo , Querschnitte, lebenden Stämme sowie Sämlinge von verschiedenen Pflanzenarten einzudämmen.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin ist eines der am weitesten verbreiteten Biopolymere auf dem Planeten und ein wichtiger Bestandteil von Lignozellulose Biomasse. Dieser phenolischen Polymeren spielt eine wichtige strukturelle und schützende Rolle in die Entwicklung und das Leben der höheren Pflanzen. Obwohl die komplizierten Mechanismen Lignification Prozesse in Vivo stark die industrielle Verwertung vieler pflanzlicher Produkte auswirken, hat die wissenschaftliche Gemeinschaft noch einen langen Weg zu gehen, um sie zu entziffern. In einem einfachen drei-Stufen-Workflow ermöglicht das doppelte Kennzeichnung Protokoll enthaltenen Bioimaging Studien aktiv verholzenden Zonen von Pflanzengewebe. Der erste Schritt besteht in der metabolischen Gründung von zwei unabhängigen chemischen Reporter, Surrogate von zwei einheimischen Monolignols, die Anlass zu Lignin H und G-Einheiten. Nach Einarbeitung in die wachsenden Lignin Polymere ist jeder Reporter dann speziell mit eigenem fluoreszierende Sonde über eine sequentielle Kombination von Bioorthogonal SPAAC/CuAAC klicken Sie auf Reaktionen gekennzeichnet. In Kombination mit Lignin Autofluoreszenz, dieser Ansatz führt zu der Generation von dreifarbigen Lokalisierung Karten von Lignin in pflanzlichen Zellwänden durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie und präzise räumliche informiert über das Vorhandensein oder Fehlen von active Lignification Maschinen auf der Skala des pflanzlichen Geweben, Zellen und verschiedenen Zellwand Schichten.

Klicken Sie mithilfe des vorgestellten BLISS-Protokolls mit synthetischen Monolignol Analoga und Bioorthogonal Chemie, es ist möglich, die Dynamik des Lignification Prozesses in lebenden Pflanzen zu visualisieren. Im Gegensatz zu etablierten Techniken für Lignin zielt Visualisierung (z. B. histochemische Färbung, Immunolocalization oder Autofluoreszenz), das "Doppelklick" Protokoll ausschließlich das Lignin hergestellt de Novo bei der metabolischen Gründung treten Sie ein und unterscheidet es von der bereits vorhandenen Lignins der Probe mit Dreikanal-zelluläre Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3). H AZ-Einheiten werden erkannt, mit der Anregung und Emission Wellenlängen des DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110, die speziell auf Natriumazid Funktionen geklickt wird integriert HAZ Moleküle während der SPAAC-Schritt (λex 501 nm /λEm 526 nm, Grün-Kanal), während GALK-Einheiten sind ähnlich wie bei den charakteristischen Wellenlängen der Azidefluor 545-Sonde, die speziell auf die integrierte terminal Alkinen Tags der G geklickt wird erkannt ALK während der CuAAC-Schritt (λex 546 nm /λEm 565 nm, roten Kanal); der dritte Kanal entspricht bereits vorhandene Lignin, das erkannt wird mit seiner intrinsischen Autofluoreszenz bei 405 nm (Blaukanal). Dieser Ansatz führt zu der Generation von dreifarbigen Lokalisierung Karten von Lignin in pflanzlichen Zellwänden, die genaue räumliche über das Vorhandensein Auskunft oder Fehlen von aktiven Lignification Maschinen zwischen verschiedenen Geweben eines Organs (Abbildung 3A ), zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der gleichen Gewebe (Abb. 3 b-C) und verschiedenen Wandschichten der gleichen Zelle (Abbildung 3D). In anderen Worten, erlaubt diese Methode uns zu markieren, und speziell die "aktiven" Lignification Websites (HAZ und GALK Kanäle) zu lokalisieren durch differenzieren von Zonen wo Lignin bei einer früheren gebildet wurde Bühne der Pflanzenentwicklung (Autofluoreszenz Kanal). Darüber hinaus die Empfindlichkeit der Technik wird drastisch verbessert, im Vergleich zu Autofluoreszenz, und viel kleinere Mengen von frisch synthetisierte Lignin können erkannt (Abb. 3 b).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Abbildung 3: Imaging eingearbeitete Monolignol chemische Reporter in Flachs Stiele. (A) die Hälfte eines handgemachten transversale Abschnitts eines Flachs Stammes, rekonstruierte Bild. (B) Näheres zu den ersten Schichten des Xylem differenzieren. Links Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau, 405 nm), mittleren Bereich: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und HAZ Fluoreszenz (grün, 526 nm) Kanäle, Rechts: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und GALK Fluoreszenz (rot, 565 nm) Kanäle. Der Pfeil zeigt die erste beschriftete Zellwand aus das Kambium illustrieren die erhöhte Empfindlichkeit der Glückseligkeit im Vergleich zu Autofluoreszenz. (C) Beschriftung in verschiedenen Zelle Arten von sekundären Xylem und (D) auf sekundäre Xylem Zellen zur Veranschaulichung der Kennzeichnung Variationen in verschiedenen Schichten der gleichen Zellwand hautnah. Links Panel: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und HAZ Fluoreszenz (grün, 526 nm) Kanäle, mittleren Bereich: fusionierte Lignin Autofluoreszenz (blau) und GALK Fluoreszenz (rot, 565 nm) Kanäle, Recht Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau), HAZ (grün) und GALK (rot) Fluoreszenz Kanäle zusammengeführt. HAZ und GALK Co Lokalisierung ist in gelb dargestellt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Chemie Reporter Strategien wie die hier vorgestellte Methode der Glückseligkeit oder die einzige Kennzeichnung Verfahren zuvor von Tobimatsu Et Al. veröffentlicht 8 können daher eine viel feinere Studie als bisher zugängliche Methoden wie Immuno- oder histochemische Färbung und sehr einfach zu implementieren. Zum Beispiel Abbildung 4 zeigt, dass die Signalintensität HAZ/GALK Einbau in Faser Tracheiden/Schiffe (FT) von der Flachs sekundäre Xylem ist sehr hoch in den ersten paar Zellwänden aus dem Kambium aber in älteren Zellen verringert schrittweise. Dieses Profil ist entgegengesetzt zu der die Autofluoreszenz und zeigt an, dass die maximale Lignification in den ersten zwei bis drei FT Zellschichten aus dem Kambium sehr schnell erreicht wird. Im Gegensatz dazu Strahl (R) Zellen erscheinen weiterhin Lignification zu viel späteren Phasen ihrer Entwicklung als HAZ/GALK Einbau ist viel beständiger in den Wänden aller Zellen aus dem Kambium, das Mark. Es ist nicht verwunderlich, dass FT und R Zelltypen kontrastierenden Lignification Dynamik, anzeigen, da dieser Zelltypen unterschiedliche biologische Rollen mit zugehörigen Unterschiede in ihrer Entwicklungs-Programm haben. FTs sind in der Tat länglichen Röhren, die Reifen und schnell sterben, lassen Toten leere Zellen mit dicken verholzten Mauern, die wesentliche Rollen in mechanische Abstützung und vertikalen Transport von Wasser und Mineralien, zu spielen, während die engen Reihen von R-Zellen, die zu komponieren das xylem Strahlen sind in ihrem Reifen und funktionellen Zustand ohne dicken verholzten Wände lebendig.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Abbildung 4: zellspezifische Monolignol Reporter Einbindung in Flachs Xylem. Bright-Feld konfokalen Mikroskopie auf (A) Teil eines Freihand Querschnitts aus Flachs Stamm. Rosa (Ray Parenchymzellen, R) und gelb (Faser Tracheid Zellen, FT) Pfeile zeigen Vektoren aus der kambiale Zone auf dem Mark und gescannt für Lignin Autofluoreszenz bei 405 nm (B), HAZ Fluoreszenz bei 526 nm (C) und G ALK Fluoreszenz bei 565 nm (D). (E) Blick auf das sekundäre Xylem. Links Panel: Lignin Autofluoreszenz (blau), HAZ (grün) und GALK (rot) Fluoreszenz Kanäle zusammengeführt. HAZ und GALK Co Lokalisierung ist in gelb dargestellt. Rechts: Schematische Darstellung der sekundäre Xylem Struktur in den Flachs Stamm. V, Schiff; FT, Faser Tracheid; R, Ray Parenchym Zelle. Diese Zahl wurde von Lion Et Al. modifiziert 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von zwei unterschiedliche chemische Reporter, H und G-Einheiten mit zwei Bioorthogonal Reaktionen im BLISS Protokoll entsprechend weitere quantitative Ergebnisse erzielt werden. Multiplex Kennzeichnung Strategien wie BLISS weitere Erkenntnisse über die Kontrolle von Monolignol Einbeziehung Verhältnisse unter verschiedenen Bedingungen könnten und zur Entschlüsselung des schwer fassbaren Lignification Prozess beitragen könnte. Wenn die relativen Anteile der H, G und S Monolignols in Lignine in der Tat sehr unterschiedlich je nach Spezies, Gewebe, Alter oder Umweltbedingungen des Werks sind, werden die komplizierten Mechanismen, die diese Komposition Regeln noch nicht vollständig verstanden. Die doppelte Kennzeichnung Technologie stellt eine leistungsfähige Methode der Untersuchung einige der Parameter, die Lignin Zusammensetzung zu regulieren. Zum Beispiel unterschiedliche HAZ: GALK Verhältnis mit Wonne erlaubt uns zu zeigen, dass Lignin Zusammensetzung im sekundären Xylem Gewebe direkt abhängig von Monolignol Verfügbarkeit innerhalb der Zellwände, und nicht auf Peroxidase/Laccase Spezifität (Abbildung 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Abbildung 5: Wirkung der Inkubation Flachs Stem Abschnitte mit unterschiedlichen prozentualen Verhältnis von HAZ und GALK. H-AZ: GALK% Verhältnisse über jeder Spalte Zahlen gegeben sind. Oben: zusammengeführt HAZ und GALK Kanäle. Unten: Histogramme, durchschnittliche Fluoreszenzintensität HAZ und GALK für die verschiedenen % Verhältnisse angibt. Werte werden als Mittelwert von der mittleren Fluoreszenzintensität in Graustufen ± SD Skala ausgedrückt bar = 100 µm. diese Zahl verändert wurde, vom Löwen Et Al. 23 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Flachs wird für seine Bastfasern (BF) angebaut, die zur Herstellung von Textilien, Luxus-Papiere oder umweltfreundliche Verbundwerkstoffe verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt ihrer industriellen Verwertung ist, dass sie sehr niedrige Niveaus von Lignin in den Zellwänden enthalten sind charakterisiert durch eine extrem dicke S2/G sekundäre Ebene19,24. BLISS kann Lignification Dynamik Unterschiede zwischen den verschiedenen Schichten der gleichen Zellwand hervorheben. Abbildung 6A zeigt, dass HAZ und GALK Reporter Einarbeitung beschränken sich auf die Zelle Ecken und Mittellamelle/primäre Zellwand der einige aber nicht alle Bastfasern. Das völlige Fehlen von Lignification in die Dicke Bast sekundäre Zelle Wand Faserschicht auch bei Monolignol chemische Reporter exogen geliefert enthüllt, die ihren Hypolignified Zustand ergibt sich aus dem Fehlen einer molekularen Umgebung geeignet für enzymatisch vermittelten Oxidation und Einbeziehung der Monolignols in einer wachsenden Polymerkette und, dass es nicht nur durch die transkriptionelle Regulierung der Monolignol Biosynthese Gene wie bereits berichtet,25. Diese Beobachtung korreliert auch mit der Tatsache, dass Leinsamen Peroxidase, die Gene Up-in den äußeren Stamm Geweben des Flachs chemische lbf1 mutierten geregelt sind, die verholzten Bastfasern26besitzt.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Abbildung 6: BLISS hebt Zellwand Unterkonstruktion oder Layer-spezifische Unterschiede. (A) linken: Hellfeld Bild eines Abschnitts Flachs Stamm. Der Kreis zeigt ein Faserbündel. Rechten Seite: Großaufnahme auf Bastfasern. Fusionierte HAZ und GALK Kanäle (mit und ohne Hellfeld) zeigen, dass Lignification beschränkt sich auf Zelle Ecken (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) und Mittellamelle/primäre Zellwand der einige Bastfasern. BF, Bast Faser; Par, Parenchym Zelle; M, Mittellamelle; P, primären Zellwand; S1, erste Schicht des sekundären Zellwand; S2/G, sekundäre Schicht/gallertartige Schicht von sekundären Zellwand. (B) 2D Scheibe und 3D-Rekonstruktion der konfokalen Z-Stapel-Zoom der Flachs Wurzelbereich Endodermis. Casparian-Streifen (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) nur zeigt Autofluoreszenz und keine HAZ oder GALK. Die damit verbundenen Fluorogramm zeigt eine GALK/hAZ Anti-Korrelation: hohe grüne Fluoreszenz ist im Zusammenhang mit niedrigen rotes Signal (Kortex) und umgekehrt (Endodermis). Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Schließlich bieten Zweifarben-Methodik auch wertvolle Informationen über den "Lignification Zustand" der Zellwand Teilstrukturen in verschiedenen Entwicklungsstadien und Pflanzenorganen anders als den Schaft. Beispielsweise zeichnet sich die Endodermis der Flachs Wurzeln durch die Existenz einer Casparian Band in die radiale und transversale Zellwände in den frühen Phasen der Entwicklung. Dieser Band der hydrophoben Biopolymer, gemacht von Suberin und/oder Lignin, verhindert, dass Wasser und gelöste Stoffe durch die Wurzel, aus der Eingabe passiv durch den Apoplast aufgegriffen und zwingt sie zum Durchlaufen der Plasmamembran über einen Symplastic Weg, damit einen Beitrag zur der selektive Aufnahme Kapazitäten von Pflanzenwurzeln. Bei Anwendung auf Flachs Wurzeln zeigte unsere Strategie, dass HAZ und GALK in den tangentialen Wänden der endodermische Zellen ebenso wie in Teilen der radialen Wände fließen wo befindet sich die Casparian-Band fehlt (Abbildung 6 b). Völlige Abwesenheit von Monolignol Reporter Einbindung in die Casparian-Band selbst zeigt jedoch, dass es in diesem Entwicklungsstadium reif ist, während die anderen Wände noch die Website weiter Biopolymer Ablagerung sind. Die rekonstruierte 3D-Ansicht eines Z-Stack bringt deutlich die Casparian Band ans Licht. Interessant ist, die Wände der einige kortikalen Zellen neben der Endodermis erwies auch in der Lage der Einbeziehung HAZ bevorzugt (dabei auf die Anwesenheit von Lignin/Suberin in den Flachs Wurzelrinde) aber nicht GALK. Co Lokalisierung Analyse zeigte eine Anti-Korrelation zwischen HAZ und GALK, die die Existenz von zellspezifische Wand Struktur/enzymatische Maschinerie in diesen zwei angrenzende Zelle Arten vorschlagen.
Zusätzliche Tabelle1: Vorbereitung der festen ½ MS Medium <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Zusätzliche Tabelle 2: Vorbereitung der Chemie Reporter Stammlösungen <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, ein dual Kennzeichnung Protokoll zur Untersuchung Lignification Dynamik, wurde entwickelt. Mit synthetischen Monolignol klicken Sie Reporter und eine sequentielle Kombination aus SPAAC und CuAAC Bioorthogonal Reaktionen, diese Methode ebnet den Weg für eingehende Analyse der Faktoren, die die Biogenese der Lignine in Plantaregulieren.

Visualisierung von Lignification Dynamik in Anlagen mit Klicken Sie auf Chemie: doppelte Kennzeichnung ist Glückseligkeit!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K Aufrufe.  Université de Lille. BLISS, ein dual Kennzeichnung Protokoll zur Untersuchung Lignification Dynamik, wurde entwickelt. Mit synthetischen Monolignol klicken Sie Reporter und eine sequentielle Kombination aus SPAAC und CuAAC Bioorthogonal Reaktionen, diese Methode ebnet den Weg für eingehende Analyse der Faktoren, die die Biogenese der Lignine in Plantaregulieren.

Serie: Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Forschung

Biochemie

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biologie

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik mit Calcofluor im Moos Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Entwicklungsbiologie

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>Expansionsmikroskopie zur Visualisierung intrazellulärer sialylierter Glykane mittels MOE

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
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Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
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Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

Metabolische Kennzeichnung

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

Visualisierung von Lignification Dynamik in Anlagen mit Klicken Sie auf Chemie: doppelte Kennzeichnung ist Glückseligkeit!

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik mit Calcofluor im Moos Physcomitrium patens

Histochemische Färbung von

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Metabolische Kennzeichnung