研究連合 FRABio および TisBio イメージング プラットフォームにお世話になっております (大リール、CNRS、FR 3688、FRABio、BiochimieStructurale et Fonctionnelle デ群集 Biomoléculaires) これを達成するために、技術的な環境を提供するため作業。

注: 液体と固体の ½ の MS メディアは補足の表 1に説明されているように事前準備されなければなりません。
1. 植物培養
<ol><li>
2 ヶ月歳の亜麻植物の文化
	<ol>
<li>ポッティングの堆肥を用いたプラスチックの鉢の亜麻 (アマl.) の種をまきます。</li>
		<li>成長日長 16 h/8 h と 22 ° C で培養室内で亜麻デイ/ナイト。</li>
		<li>1 ヶ月後の垂直方向のサポートが付いている植物を装備し、2 ヶ月齢になるまでに成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 週齢亜麻苗の文化
	<ol>
<li>チーズの布の部分に 12 の亜麻の種子をラップし、バンドルを作るためのゴムバンドで固定します。 注: は、層流ヒューム フードの下で無菌条件下で次の手順を実行します。</li>
		<li>以前オートクレーブ 250 mL の瓶に種子バンドルを配置します。</li>
		<li>70% の 70 mL を加えてエタノール ボトルと優しく 1 分間かき混ぜます。</li>
		<li>ボトルにバンドルを残しながらデカンテーションによって、江藤を慎重に取り外します。</li>
		<li>2% ナトリウム次亜塩素酸を 100 mL を加え、10 分間ゆっくりかき混ぜます。</li>
		<li>ボトルにバンドルを残しながらデカンテーションによってナトリウム次亜塩素酸のソリューションを削除します。</li>
		<li>1.2.5-1.2.6 の手順を繰り返します。</li>
		<li>滅菌超純水水 100 mL を加え、1 分間かき混ぜます。</li>
		<li>(5、10、15 分) 各リンスのすすぎ時間を増やすことに 3 回 1.2.8 のステップを繰り返します。</li>
		<li>固体 ½ MS 培地を暖かい、2 cm の高さに滅菌プラント カルチャー ボックスにそれを注ぎ、凝固までそれはクールダウンをしましょう。</li>
		<li>繊細な滅菌鉗子を用いた固体中の各シードを配置します。</li>
		<li>滅菌ボックスを閉じます。</li>
		<li>日長 16 h/8 h の 22 ° C の成長チャンバー ボックスに転送昼/夜 2 週間亜麻の苗を育てると。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 代謝化学記者定款
注: 3 つの実験モデルを以下に示します: 幹断面、ii) 全体の茎と三苗の i) 代謝ラベリングします。各プロトコルは 1 つの生物学的複製し量は必要な生物的複製の数に適応することができます.このソリューションは、実験前に表 2に説明されているように作られている株価ソリューションから用意しています。溶液は-20 ° C で数ヶ月保存できます。HAZ: GALKまたはH:G比率は、すべてカスタムメイドの実験的デザインに合うように調整できます。
<ol><li>2 ヶ月歳の亜麻の茎断面に化学薬品レポーター設立
	<ol>
<li>GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 300 μ L 化学レポーター ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦HAZ/GALKソリューションし、マイクロ ピペットで 48 ウェル プレートの 1 つの井戸に転送。</li>
		<li>液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 300 μ L 否定的な制御ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦H/Gソリューションと同じ 48 ウェル プレートの 2 番目の井戸に転送します。</li>
		<li>新しいかみそりの刃を使用して土壌レベルより 10 cm 上で 2 ヶ月歳亜麻植物の茎をカットします。</li>
		<li>繊細なかみそりの刃 (約 150-250 μ m 厚) を使用して茎の 50 のフリーハンド横断面を準備します。</li>
		<li>すぐに時計ガラスの液体滅菌 ½ MS 培地にクロス セクションを配置します。</li>
		<li>目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、 Hアリゾナ州でもいっぱいで、それらの 10 をランダムに配布/GALKソリューション。</li>
		<li>Hもいっぱいの繰り返し手順 2.1.8/Gソリューション (マイナス コントロール) として。</li>
		<li>ステップ 2.1.8 (共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地の 300 μ L でいっぱいよく第三者に対して繰り返します。</li>
		<li>20 h 20 ° C で成長槽内連続光でプレートを孵化させなさい。</li>
		<li>マイクロ ピペットの各ウェルにこのソリューションを削除します。</li>
		<li>½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>2 ヶ月歳の亜麻全体茎に化学薬品レポーター設立
	<ol>
<li>GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 5 mL 化学レポーター ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦HAZ/高さ 20 cm ガラス テストにはピペットでチューブGALKソリューションと転送。</li>
		<li>液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 5 mL 否定的な制御ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦H/Gソリューションと転送高さ 20 cm ガラス テストするチューブします。</li>
		<li>(共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地 5 mL を含む第 3 ガラスの試験管を準備します。</li>
		<li>新しいかみそりの刃を使用して土壌レベルより 10 cm 上で 2 ヶ月歳亜麻植物の茎をカットします。根と茎の下の部分を破棄し、植物の茎の上部に、次の手順に進みます。</li>
		<li>Hアリゾナ州を含む管内全体カット茎の基部を浸す/GALKソリューション。乾燥からそれを防ぐためにインキュベーション ソリューションにおける根系を除去した直後の茎を配置します。 注: 若い/古い植物や他の種にメソッドを適用すると場合、モノリグノール ソリューションのボリュームが必要に応じて調整するサイズ/時代の植物の茎の直径。</li>
		<li>幹をまっすぐに保つために垂直方向のサポートに接続します。</li>
		<li>パラフィルム、溶液の蒸発を避けるためにガラス管をシールします。</li>
		<li>H否定的な制御サンプル手順 2.2.6-2.2.9 を繰り返す/Gソリューション。</li>
		<li>½ MS 培地を含む蛍光バック グラウンド コントロール サンプルの 2.2.6-2.2.9 の手順を繰り返します。</li>
		<li>ネオンの光を使用して連続光で 20 h のそれぞれの幹を孵化させなさい。</li>
		<li>代謝定款 20 時間後HAZ培養幹を削除/GALKソリューション、½ の MS 培地でそれをすすいでください。</li>
		<li>カットしかみそりの刃を使用してください幹の 1 cm 下を破棄し、残りの茎の根元から 1 cm の高いシリンダーを準備しています。</li>
		<li>慎重にこのシリンダーから 20 フリーハンド横断面 (約 150-250 μ m 厚) を準備し、時計ガラスの ½ の MS 培地でいっぱいですぐにそれらを配置します。</li>
		<li>48 ウェル プレートのウェル 1 個で 500 μ L の ½ の MS 培地を置きます。</li>
		<li>目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、½ MS ソリューションでいっぱいよくそれらの 10 をランダムに配布します。</li>
		<li>2.2.13-2.2.17 H/Gソリューションと培養陰性対照幹の手順を繰り返します。</li>
		<li>蛍光バック グラウンド コントロール幹の手順 2.2.13-2.2.17 ½ MS 培地で培養を繰り返します。</li>
		<li>マイクロ ピペットの各ウェルにソリューションを慎重に取り外します。</li>
		<li>½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>2 週齢亜麻苗に化学薬品レポーター設立 注: 次の手順は、すべて実施無菌条件の下で。<ol>
<li>GALKの 10 μ M と 10 μ M の液体滅菌 ½ MS 培地でHアリゾナ州を含む 2 mL 化学レポーター ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦HAZ/ピペットとチューブに 20 cm の高さのガラスのテストGALKソリューションと転送。</li>
		<li>液体滅菌 ½ MS 培地でHの 10 μ M と 10 μ M のGを含む 2 mL 否定的な制御ソリューションを準備します。</li>
		<li>渦H/Gソリューションと転送して、20 cm の高さのガラスのテスト チューブします。</li>
		<li>(共焦点顕微鏡画像の後続のデータ処理中に蛍光のベースラインを調整するバック グラウンド コントロール) として ½ MS 培地 2 mL を含む第 3 高さ 20 cm ガラス試験管を準備します。</li>
		<li>繊細な長いピンセットのペアを使用して固体の ½ の MS 培地から 2 週齢亜麻苗を削除 (セクション 1.2. の上)。</li>
		<li>優しくH のアリゾナ州を含む管に苗を転送/GALKソリューション、そのルーツがソリューションに没頭していることを確保します。</li>
		<li>蒸発を避けるためにプラスチック製のキャップとガラス管を閉じます。</li>
		<li>H を持つ否定的な制御管の手順 2.3.6-2.3.8 を繰り返す/G ソリューション。</li>
		<li>½ MS 培地を含む蛍光バック グラウンド コントロール チューブの 2.3.6-2.3.8 の手順を繰り返します。</li>
		<li>各苗成長室 20 ° C で 20 時間の連続光を孵化させなさい</li>
		<li>繊細なHAZ培養苗を削除/GALKソリューション、½ の MS 培地でそれをすすいでください。</li>
		<li>繊細な胚軸部 20 フリーハンド断面 (approximatively 150 250 μ m 厚) を準備します。</li>
		<li>48 ウェル プレートのウェル 1 個で 500 μ L の ½ の MS 培地を置きます。</li>
		<li>目視で確認、そのまま全体 2 次元断面を選択し、½ MS ソリューションでいっぱいよくそれらの 10 をランダムに配布します。</li>
		<li>2.3.12-2.3.15 H/Gソリューションと培養陰性対照の苗を手順を繰り返します。</li>
		<li>蛍光バック グラウンド コントロール苗の手順 2.3.12-2.3.15 ½ MS 培地で培養を繰り返します。</li>
		<li>マイクロ ピペットの各ウェルにソリューションを慎重に取り外します。</li>
		<li>½ MS 培地の 500 μ L を各ウェルに追加、10 分間穏やかにかき混ぜ、リンス液をマイクロ ピペットでこれを削除します。4 回繰り返すし、すぐにラベルの至福 (セクション 3) に進みます。</li>
	</ol></li>
</ol>3 SPAAC と CuAAC による工場断面試料の二重蛍光標識
注: 至福の分類のプロトコルは、すべて 3 実験モデル (セクション 2) の同じです。
<ol><li>
ひずみ昇格アジ化物アルキンの環化付加反応 (SPAAC) のラベル付け
	<ol>
<li>DBCO ペグ4-5 5 μ M を含む SPAAC 溶液の 1 mL を準備/6-液体滅菌 ½ MS 培地で carboxyrhodamine 110。渦ソリューション暗闇の中に保管してください。</li>
		<li>最終洗浄後 [2.1.13、2.2.21 または選ばれた実験的なデザインによって 2.3.19] 代謝結合のプロトコルの手順は ½ MS 培地を削除し、マイクロ ピペットでウェルあたり SPAAC ソリューションの 300 μ L を追加します。</li>
		<li>アルミ箔でカバーやボックスに置くことで、光から 48 ウェル プレートをシールドします。</li>
		<li>周囲温度で暗闇の中 1 h の機械的シェーカーでプレートを優しくかき混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
銅触媒を用いたアジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) のラベル付け
	<ol>
<li>暗闇の中でプレートを維持しながらも 4 回 2.1.13 のステップで説明されている各を洗ってください。</li>
		<li>アスコルビン酸ナトリウム 2.5 mM, 0.5 mM CuSO4 , 5 耽羅ペグ3の 5 μ M の CuAAC の溶液 1 mL を準備-液体滅菌 ½ MS 培地でアジ。渦ソリューション暗闇の中に保管してください。 注: この CuAAC ソリューションたて使用する前に準備する必要があります、4 ° C で数日以上を格納できません。</li>
		<li>各ウェルに ½ MS 培地を取り外して直接マイクロ ピペットを使用してあたり CuAAC ソリューションの 300 μ L を追加します。</li>
		<li>周囲温度で暗闇の中 1 h の機械的シェーカーでプレートを優しくかき混ぜます。</li>
		<li>マイクロ ピペットを使用して、CuAAC ソリューションを削除します。</li>
		<li>マイクロ ピペットを使用して、½ MS を 500 μ l 添加、10 分間暗闇の中で攪拌し、この洗浄液を削除します。2 回繰り返します。</li>
		<li>7:3 のメタノール/水溶液を 500 μ l 添加、1 h の暗闇の中で攪拌し、ソリューションを削除 注意: メタノールは皮膚への接触や吸入によって有毒である、人間の発癌物質として指定されています。その利用には、化学の発煙のフードと手袋が必要です。</li>
		<li>½ MS を 500 μ l 添加、暗闇のなかで 10 分攪拌ソリューションを削除します。4 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 顕微鏡でサンプルの取り付けスライドします。
<ol><li>ガラス顕微鏡スライドでメディアをマウントの場所 5 が値下がりしました。</li>
	<li>慎重に各HAZを沈殿物/GALKスライドの断面をタグ付き。</li>
	<li>スライドの対向する二辺にマニキュアを適用します。</li>
	<li>観察のスライドをカバーします。空気の泡を避けるために注意してください。</li>
	<li>紙タオルを使用してメディアを余分なマウントを削除します。</li>
	<li>4 四方をマニキュアでサンプルをシールします。ワニス乾燥室温 (約 30 分) で爪をしましょう。</li>
	<li>否定的な制御/G の H断面について、手順 4.1 4.6。</li>
	<li>蛍光バック グラウンド コントロール断面について、手順 4.1 4.6。</li>
	<li>共焦点顕微鏡観察まで、暗闇の中で 4 ° C でスライドを保存します。 注: 準備の質によって数ヶ月に数週間の準備されたスライドを格納できます。新しい観察をストレージした場合は、サンプルが乾燥していないことを確認します。</li>
</ol>5. 画像の取得蛍光共焦点顕微鏡
<ol><li>製造元の指示に従って正しい順序で共焦点顕微鏡システムの必要な単位をすべてオンにします。</li>
	<li>最大開口を希望する目標を選択し、励起と放射の波長を合わせられる (例えば、obj. 60 x、n. a. 1.2。蛍光チャネル: λex 405 nm、λem 450 nm 25;SPAAC Hアリゾナ州チャネル: λex 488 nm、λem 525 nm 25;CuAAC GALKチャネル: λex 561 nm、λem 595 nm 25;シーケンシャル モード)。</li>
	<li>ソフトウェア (12 ビットまたは 16 ビット必要、ナイキスト基準に適応したピクセル サイズ) の画像の生成のための目的のパラメーターを選択します。</li>
	<li>顕微鏡ステージ上HAZ/GALKスライドを置き、対物レンズの下でサンプルを配置します。</li>
	<li>観察、植物組織の目的の地域を見つけます。</li>
	<li>
高品質二重標識 HAZ/G の共焦点画像を取得ALKサンプル。
	<ol>
<li>Z 軸には、大部分の蛍光灯の平面を選択します。</li>
		<li>ゲインを調整 (蛍光、 HAZとGALK) 各チャネルの全体灰色レベル範囲に沿って最適な信号の分配を達成するためにオフセットとレーザーの力。同じパラメーターは、すべての次の買収の適用する必要があります。</li>
		<li>選択した画像の取得を起動し、ファイルを保存します。サンプルの関連する各地域を繰り返します。 注: 3 D Z スタック再構成必要に応じて取得することがも。</li>
	</ol>
</li>
	<li>同じ設定を使用すると、自発レベル (蛍光バック グラウンド コントロールのセクション 2 の説明に従って) を決定する ½ MS 培養のみタグなしのサンプルの画像を取得します。</li>
	<li>同じ設定を使用すると、ネイティブ monolignols H/Gのサンプルに非特異蛍光粘着を決定すると培養陰性対照サンプルの画像を取得します。</li>
	<li>H/G陰性対照画像でHAZ/GALK画像引き算バック グラウンド蛍光信号を取得した画像にデータ処理を適用します。</li>
</ol>

<ol>
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Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

前述したように、本稿で提示されたデュアル ラベル至福プロトコルは12,23体内SPAAC/CuAAC の組み合わせの最初の例の 1 つです。2 つが化学標識反応が行われるをクリックして順序を尊重することは非常に重要な各ステップは徹底的に最適化および検証され、(すなわち、SPAAC、順 CuAAC)。すべてクロス コントロールを示した、各付け、特定ブリス プロトコルが適用23 : まず化学高選択的につながる SPAAC ステップの実施によるHAZアジ化機能のラベル、高速な反応速度で [3 + 2] 環化付加反応による cyclooctyne 機能の fluorophore。Hアリゾナ州単位にタグは、アジ化蛍光 545 プローブとの反応によるトリアゾール リンクを生成するGALK末端アルキンの銅 (i) 触媒による活性化を施行した CuAAC ステップは実施できます。対照的に、逆の順序で (すなわち、CuAAC、順 SPAAC) それGALKとHアリゾナ州単位につながるとは使用しないでください fluorophore 結紮と競合し、信号の劇的な損失を誘発するクロス カップリング.また、非特定の染色を避けるために中間洗浄のステップの必要性を強調することが重要です。
我々 は本手法を様々 な生物学的実験デザインを適用できることを示しています。至福の分類のプロトコルは最初、以前カット、インキュベートを準備ができてクリック monolignols 亜麻の茎 (約 150-250 μ m 厚) のフリーハンドの断面に適用。このデザインには、(インキュベーション ボリュームが減少)、化学薬品レポーターの必要数量を最小化して統計をレプリケートの生産を容易にする利点がありますが、それはない、厳密に言えば、体内システムといくつかの場合、木質化の実時空間的ダイナミクスのすべての側面を表さない場合があります。2 番目の実験的デザインしたがって松や銀杏の27の radiolabeled monolignols 定款を研究に使用していたメソッドにブリス プロトコルを適応しました。このアプローチで根や植物の茎を物理的に分離、全体の茎の基部は '花花瓶' アプローチと呼ばれることがあります何でこのソリューションの培養です。茎の目的 (インキュベーション) の時間を残し後、断面、カットと実行ブリス プロトコル。これは局在パターンは本質的と同一断面の (ii) (i) 変更された monolignols 生活幹を通して運ばれ、成長する細胞壁のリグニン ポリマーに組み込まれていると表示することができましたアプローチ。このタイプの実験の実際の生きた植物で行われているメリットがあります/生きているセル長い実験とより詳細な研究のアプローチが化学レポーターの大きい量が必要です。最後に、ブリス プロトコルは、亜麻の植物苗、実際の生活化学記者必要がありますに根を通して吸収される、幹を運ばれる前にプラント モデルを表すとも使われました。このモデルには実習では、生きた植物で行われているの明確な利点は若い実生植物に制限され適していません本当に実用的な理由から (長い培養時間、高架より古い植物の木質化の動力学を調査するため化学記者の量)。それにもかかわらず、これらの 3 つの実験デザインは相補、実用的な側面と答えられる生物学的問題の種類によって生物学的意義に関して、賛否があるすべて。
亜麻の木質化のダイナミクスを研究するために開発、我々 のプロトコルは小回り、生物学的実験デザインの面でだけでなく、他への応用の観点からも植物の種や臓器・組織。例えば、ブリスは、シロイヌナズナや様々 な遺伝子ノックアウトまたはノックダウン変異体を用いた研究により適しているポプラ属に簡単に転送できます。原則として、我々 のアプローチとデュアル ラベル研究も拡張できます他の生体分子への 2 植物細胞壁ポリマー - すべての 3 つの主な monolignols または彼らの代謝前駆体のさまざまなを含む個別変更された前駆体を用いた多糖類マトリックスを構成する単糖類。創業以来、bioorthogonal 化学確かに主に開発した糖/多糖類代謝糖鎖工学 (萌)4,5,17,28を調査するには驚くほどしかありませんでしたが、植物生物学に非常にいくつかのアプリケーション、これまで7,8,9,10、11,12。反応の互換性の面では、リグニンの研究は確かに両方の化学の記者が同じ網状高分子に組み込まれている解決するために複雑なケースだった。ラベルのないHアリゾナ州- の可能性GALK架橋形成されたGALKと 3 D 内Hアリゾナ州単位の空間的近接のために克服するために主要な問題リグニン23、ないあるかもしれない 2 つの化学記者が組み込まれていない場合同じ種類の生体高分子や特定のセルの同じ空間領域制限の構造。
広い範囲で至福の方法論はアジとターミナル アルキン タグをそれぞれベアリング 2 つの異なる化学記者を使用して細菌や動物モデルの任意の 2 色蛍光イメージング研究に本質的に適用でした。

過去 20 年間の化学薬品レポーター戦略動態および非遺伝子にエンコードされた生体分子の機能を調査するための強力な 2 段階の方法論として浮上しています。1,2,3この戦略で小さな変調-化学薬品レポーター -興味の生体分子の合成アナログはまず代謝される生きている有機体の化学プローブ順 (e.g、蛍光の蛍光。共焦点顕微鏡イメージング) 共有、bioorthogonal クリックケミストリーによって組み込まれた記者にリンクされます。急速に、特にプローブが反応する必要があります任意の生体分子の生きているシステムに存在する不活性でありながら導入化学修飾。多くの方法でこのメソッドは、非常に特定のクリック化学およびそれにより代謝物または以前アクセスできなかった生体高分子を追跡する機会を提供するを使用して共通化反応技術の限界を克服します。生活システム4,5,6。
細菌と動物の細胞でこの強力なメソッドの急成長している人気にもかかわらず植物生物学での使用を記述するレポートは、意外にも少数ありまでの間7,8,9,10、します。 11,12。地球上最も一般的な生体高分子の一つ、リグノ セルロース系バイオマスの主成分リグニンの形成を研究する植物でこの戦略を適用することに特に興味を持っていた。13,14リグニンはフェノール樹脂開発と高等植物の生活保護構造の重要な役割を果たしています。
一般的に 3 つの 4 hydroxyphenylpropanoid 鎖から成り立っています: H (p-ヒドロキシフェニル)、G (グアヤシル) と S (結果) の単位はそれぞれ 3 つから派生した、'monolignols' (p- coumaryl、コニフェリルとシナピル アルコール)フェニルプロパノイド経路 (図 1) 細胞の細胞質で合成されました。Monolignols の酸化細胞壁にエクスポートされている後ペルオキシダーゼまたはリグニン ポリマー重合する純粋化学の根本的なカップリング反応を受けるその後 laccases によってラジカルにプロセスは木質化と呼ばれます。15,16リグニンに強く影響を与える植物由来の多くの産業の物価安定政策が、製品、科学界は、木質化を調節する複雑なメカニズムを解読する長い道のりをまだ持っています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> 図 1: 植物細胞における木質化プロセス。Monolignols は細胞質でフェニルアラニンから生合成されます。Monolignols の酸化細胞壁にエクスポートされている後ペルオキシダーゼまたはリグニン ポリマー重合する純粋化学の根本的なカップリング反応を受けるその後 laccases によってラジカルにプロセスは木質化と呼ばれます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
糖鎖解析 bioorthogonal 反応の利用に関する報告が多数、2,3,17他生体分子の種類にその応用例は少ない。リグニン バイオ イメージング用 bioorthogonal 化学の使用が飛松らによって開拓されたばかり8 シロイヌナズナG 単位、8,9概念実証デモを形作るそれリグニン ポリマーにアルコール サロゲート コニフェリル定款についての情報を提供するために、化学薬品レポーターの戦略は、このコンテキストで適用されます。CuAAC の使用もによって示された数ヶ月別のコニフェリル アルコール誘導体を使用して後でブコウスキーら。9ただし、リグニンも H と S のユニットを含むし、木質化のプロセスのより深い理解は、monolignols のすべてが、ポリマーに組み込まれる方法についてより多くの知識を必要とするどのような要因がその組成を制御します。このフィールドの新しい進歩は現在生きているシステムで同時に複数の化学記者を追跡するための効率的な手法の開発に依存します。主要な課題にもかかわらず、糖鎖に関するいくつかの記事は、近年18,19,の基礎を築いたが20,21,22, デュアル アプローチをラベル付けのままbioorthogonal 化学。再現可能な単一ラベル クリック プロトコルが開発するは難しい、互いに 2 つのタンデムで最適化を必要とするアプローチをラベリングし、デュアルの場合 2 つの独立した化学記者に互換性のある bioorthogonal 反応がさらに困難。この面を開拓したほとんどの例は、動物細胞の糖鎖を勉強するひずみ昇格アジ化物アルキン環 (SPAAC) とアルケン tetrazine 逆の電子式需要 (DAinv) のディールス ・ アルダー反応の組み合わせを しました。ただし、我々 は、DAinv 反応の bioorthogonality は、(電子不足と反応することができます電子豊富な置換シンナミル タイプ単量体から成っているリグニンの構造機能のおかげでこのアプリケーションの保証されないかもしれないと思ったジエン DAinv 反作用で使用された tetrazine のプローブなど)、これが非固有のラベルを生成する可能性があります。加えて、DAinv反応がかさばるし、可能性を高めることにより脂溶性にあることと同様、アクセス困難な総合的化学処理が必要ですが設立、輸送および/または化学物質の局在化の率生体内で記者があります。後者の側面は木質化を研究するためのクリック化学アプローチの場合特に関連すると考えて、我々 別の方向を選んだ、Bioorthogonal 結紮イメージング逐次戦略 (至福) を使用して開発、Strain-Promoted アジ化物アルキン環 (SPAAC) と銅触媒によるアジ化物アルキン環 (CuAAC) の組み合わせ体内。23
これら 2 つの反応は、実際に 2 つの主な bioorthogonal をクリックして日付に使用されている反応とリグニンのいくつかの例では特に画像最近出版されました。8,9デュアル ラベリング戦略を有効に 1 つモノリグノール記者アジ化部位と、他のターミナル アルキン i) 関連する生物学的構造にたがわず、ii) は非常に小さなサイズ (図 2の 2 つの化学ハンドルの使用).その結果、調査の下で生体分子の物理化学的性質のこれらの合成の修正の影響を最小限交通の面で不自然なモノリグノール基板間不一致を減らすと代謝率代謝設立段階。SPAAC と CuAAC の組み合わせが、一見非常に直感的なようだがデュアルのマーキング以外の糖鎖構造にこの作戦の最初のアプリケーションを使用してのみ、2 番目の例我々 の知識です。12,23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> 図 2: ブリス デュアル戦略をラベリングします。化学記者 HAZ GALKは、ネイティブの H と G monolignols の類似するタグ。彼らは最初外因性 (ステップ 1) を供給することにより、細胞壁の成長のリグニンの重合体に組み込まれます。Cyclooctyne とアジ化-機能集積化蛍光プローブが、順番に組み合わされて組み込まれた記者に bioorthogonal によってクリックケミストリー: SPAAC 反応 (ステップ 2) 特異性が高く Hアリゾナ州単位の CuAAC 反応 (が続きますステップ 3) 単位 GALK (ステップ 3) の特定であるようにない両方の記者の特定のローカリゼーション独立して同じサンプルの。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
我々 は、まず設計アジ化タグ モノリグノール記者HAZ ( p- coumaryl アルコールの代理人) とリグニン H 単位の前駆体を検証し、連動される至福のデュアル ラベリング戦略を考案、タグ付きのアルキンGALK9 (コニフェリル アルコールの代理人) とリグニン G 単位の前駆体を報告しました。この再現可能なプロトコルを開発し、亜麻のテストでは、経済的に重要な植物、リグニンにHAZとGALKのデュアル代謝定款はシーケンシャル SPAAC/CuAAC の前に達成した最初ラベリング。ここでは、タグHアリゾナ州単位最初具体的にはラベルが付いています経由でタグGALK の 2 番目の蛍光プローブの CuAAC を介した結紮に続いて cyclooctyne 修飾 fluorophore の SPAAC 結紮ユニット。このメソッドは、植物細胞壁内の木質化のプロセスのダイナミクスを調べるに使用された、応用生体内で茎の断面、別の植物種の苗と同様、茎の生活をすることができます。

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

リグニンは地球上最も一般的な生体高分子の一つ、リグノ セルロース系バイオマスの主要なコンポーネントです。このフェノール樹脂は、開発と高等植物の生活に重要な構造、保護の役割を果たしています。強く木質化プロセス生体内で規定している複雑なメカニズムに影響を与える多くの植物由来製品産業の物価安定政策、科学界はまだそれらを解読するために行くには長い道のりを持っています。簡単な 3 ステップのワークフローでは、ここに記載したデュアル ラベリング プロトコルは、植物組織のゾーンを積極的に lignifying のバイオ イメージング研究をできます。最初のステップは、2 つの独立した化学記者リグニン H と G 単位に上昇を与える 2 つのネイティブ monolignols のサロゲートの代謝の定款で構成されます。高分子リグニンの成長に設立後各記者は、具体的に付いた bioorthogonal SPAAC/CuAAC クリック反応の連続の組み合わせで独自の蛍光プローブ。蛍光がリグニンと結合されて、このアプローチ共焦点蛍光顕微鏡による植物細胞壁のリグニンの 3色ローカリゼーション マップの生成をもたらすし、アクティブの有無で正確な空間情報を提供します植物組織、細胞と異なる細胞壁レイヤーの縮尺で木質化の機械。

クリックケミストリー合成モノリグノール類縁体および bioorthogonal を含む提示至福のプロトコルを使用して、それは生きている植物の木質化の過程のダイナミクスを可視化することが可能です。リグニンの確立された技術とは異なり組織化学的染色などタバコプロトプ蛍光)、この 'ダブルクリック' プロトコルのみ可視化対象リグニン生成・ デ ・ ノボ代謝結合の間ステップし、共焦点蛍光顕微鏡観察 (図 3) によるトリプル チャネル細胞イメージングとサンプルの既存のリグニンからそれを区別します。Hアリゾナ州-ユニットは、DBCO ペグ4-5 の励起・発光波長を使用して検出されます/6-アジ化機能にクリックしては特に carboxyrhodamine 110 SPAAC 段階 (λex HAZ分子を組み込まれて501 の nm/λem 526 nm、緑チャンネル) に対しGALK- G の法人端末アルキン タグにクリックしては特に azidefluor 545 プローブの特性の波長で単位が検出された同様にCuAAC 段階 (λex 546 nm/λem 565 nm、赤色チャネル)アルク3 番目のチャネルが 405 でその本質的な蛍光を使用して検出された既存のリグニンに対応 nm (青色チャネル)。このアプローチはさまざまな組織器官 (図 3 a の間木質化のアクティブな機械の存在で正確な空間情報を提供する植物細胞壁のリグニンの 3色ローカリゼーション マップ有無の世代になります)、同じ組織 (図 3B-C) 内と同じセル (図 3 D) の別の壁層内の別のセル型の間。つまり、この方法により、私たちを強調表示し、具体的には 'アクティブ' 木質化サイト (HAZとGALKチャンネル) をローカライズするリグニンが以前に結成のゾーンからそれらを区別します。植物開発 (蛍光チャネル) の段階です。さらに、蛍光と比較した場合、技術の感度が大幅に強化、新鮮な合成リグニンのはるかに小さい量がすることができます (図 3 b) を検出します。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> 図 3: 亜麻の茎に組み込まれたモノリグノール化学記者のイメージングします。(A) 亜麻の茎、再構成画像の手作りの横断セクションの半分。木部の区別の最初の層の (B) のクローズ アップ。左右パネル: リグニン蛍光 (青、405 nm)、中央のパネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と HAZ蛍光をマージ (緑、526 nm)、右側のパネルのチャンネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と GALK をマージ蛍光 (赤色、565 nm) チャンネル。矢印は、蛍光と比較して至福の感度を示すひこばえから最初のラベル付きセル壁を示します。(C) ラベリング異なる細胞タイプの二次木部および (D) は同じ細胞壁のさまざまな層のラベルのバリエーションを示す二次木部細胞にクローズ アップ。左右パネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と HAZ蛍光をマージ (緑、526 nm)、中央のパネルのチャンネル: リグニン自家蛍光特性 (青) と GALK蛍光をマージ (赤、565 nm) チャンネル、右パネル: リグニン自家蛍光特性 (青)、HAZ (緑) と GALK (赤) 蛍光チャネルを結合します。HAZと GALKの共局在が黄色で描かれています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ここで紹介した至福方法や飛松らによって、以前公開されて単一ラベル プロシージャなど化学薬品レポーター戦略8したがって、免疫組織化学的染色を実装する非常にシンプルでありながらなど以前はアクセス方法よりもはるかに細かい研究ができます。たとえば、図 4に示していますHアリゾナ州の信号強度/亜麻の二次木部の繊維仮道管/血管 (フィート)GALK定款は、ひこばえから最初のいくつかの細胞壁が非常に高く、古い細胞が徐々 に減少します。このプロファイルは、蛍光とは逆、その最大の木質化が非常に急速に形成層から最初の 2 ~ 3 FT 細胞層到達を示します。対照的に、レイ (R) 細胞がHアリゾナ州としての開発の多くの後の段階に木質化を継続する表示/GALK定款は力強さ、ひこばえからすべての細胞の壁により一定。驚くべきこれらの細胞型の発達プログラムで関連付けられている違いと異なる生物学的役割を持っているので FT と R のセルタイプが木質化の対照的なダイナミクスを表示ことはありません。FTs は確かに細長いチューブが成熟し、急速に死ぬ、R の狭い行セルに対し機械的なサポートと水とミネラルの鉛直輸送の両方で重要な役割を果たす木の厚さの壁を残して死んでセル構成、木部光線はせずに木の厚さの壁を機能的な成熟した状態で生きています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> 図 4: 亜麻の木部細胞特異モノリグノール記者設立。亜麻の茎からフリーハンド断面の部分の明視野共焦点顕微鏡ビュー (A)。ピンク (レイ柔細胞、R) と黄色 (繊維仮道管細胞の FT) 矢印髄に向かって形成ゾーンからのベクトルし、405 でリグニン蛍光のスキャンを示して nm (B)、526 で HAZ蛍光 nm (C) と GALK 565 で蛍光 nm (D)。二次木部の (E) 表示します。左右パネル: リグニン蛍光 (青)、HAZ (緑) と GALK (赤) 蛍光チャネルを結合します。HAZと GALKの共局在が黄色で描かれています。右側のパネル: 亜麻の茎の二次木部構造の模式図。V、容器;FT 繊維仮道管;R、レイ柔細胞。この図は、ライオンらから変更されています。23<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
さらに、する H と G-ユニット ブリス プロトコルで 2 つの bioorthogonal 反応に対応する 2 つの異なる化学記者の使用は、取得するより多くの量的な結果をことができます。ブリス モノリグノールの制御に関する様々 な条件で設立比率に追加の洞察力を提供できるとらえどころのない木質化プロセスの解読に貢献できると戦略をラベリングを多重化します。リグニンの H, G, S monolignols の相対的な割合が実際に種、組織、年齢または植物の環境条件によると非常に変数、この組成を調節する複雑なメカニズムが理解まだ完全ではないです。デュアル ラベリング技術は、リグニンの組成を調整するパラメーターのいくつかの調査の強力な方法を表します。たとえば、 HAZを変: GブリスとALK比二次木部組織でリグニン組成がモノリグノール可用性ではなく細胞壁内に直接依存して実証することができましたラッカーゼ ・ ペルオキシダーゼの特異性 (図 5)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> 図 5: HAZと GALKの異なるパーセント比で亜麻の茎切片の培養の効果。HAZ: GALK比 % 上記各欄の数字。トップ: マージ HAZと GALKのチャンネルです。下: ヒストグラム Hアリゾナ州と異なる % 比 GALKの平均蛍光強度を示します。値は灰色のレベル ± SD. スケールで平均蛍光強度の平均値として表されますバー = 100 μ m. ライオンらからこの図が変更されています。23<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
亜麻は、繊維製品、高級紙や環境に優しい複合材料の製造に使用されるその靭皮繊維 (BF) の栽培されています。その産業の物価安定政策の重要な側面は、非常に厚い S2/G 二次層19,24によって特徴付けられる細胞壁のリグニンの非常に低いレベルが含まれていることです。ブリスは、同じ細胞壁のさまざまな層の木質化のダイナミクスの違いを強調表示できます。図 6A HAZとGALK記者定款がセルのコーナーとすべてではなくいくつかの靭皮繊維の中層/一次細胞壁に限定されることを示しています。モノリグノール化学記者が外因場合でも厚い靱皮繊維二次細胞壁レイヤーにおける木質化の合計不在供給の hypolignified 状態に適した分子環境の欠如から生じることを明らかに酵素によって酸化成長ポリマー鎖に monolignols の設立と、それがないモノリグノール生合成遺伝子の転写調節のためにだけ前述25を報告しました。この観測も事実とよく相関するその亜麻のペルオキシダーゼ遺伝子が調整される木の靭皮繊維26所有している亜麻化学lbf1変異体の外側の茎組織。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> 図 6: ブリス細胞壁構造やレイヤーに固有の相違点を強調表示します。(A) 左側のパネル: 亜麻の茎部明視野イメージ。マル印の繊維束。右側のパネル: 靱皮繊維上にクローズ アップ。HAZと GALKチャンネル (と明るいフィールドなし) を合併、木質がセルのコーナーに限定を示す (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) といくつかの靭皮繊維の中層/一次細胞壁。BF、靱皮繊維;パー、柔細胞;M の中層。P は、一次電池の壁;S1、二次細胞壁の最初の層二次細胞壁の S2/G、二次層/ゼラチン層。(B) の 2D スライスと共焦点 z スタックの 3次元再構成亜麻根の内皮の領域を拡大できます。カスパリー (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) のみ蛍光を表示し、HAZまたは GALKは組み込まれていません。関連付けられている fluorogram GALK/Hアリゾナ州反相関を示しています: 高蛍光グリーンは赤い信号 (皮質) その逆 (内皮) に関連付けられています。内鞘 (P)、内皮 (E)、Cortex (C)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
最後に、この 2 色の方法論は、様々 な発達段階や茎以外の植物器官で細胞壁部分の木質化の状態も貴重な情報を提供できます。たとえば、亜麻根の内皮は、開発の初期段階中に放射状および横断細胞壁のカスパリー バンドの存在によって特徴付けられます。疎水性高分子、スベリンやリグニン、作られてのこのバンド水と溶質、アポプラストを通じて受動的入力からルートによってとらを防止し、強制的にそれらに寄与する symplastic 経路を介して細胞膜を通過する、植物の根のカチオン容量。亜麻根に適用され、当社の戦略は HAZと GALKがカスパリー バンドが (図 6 b) 欠席は放射状の壁の部分のように内皮細胞同様の接線方向の壁に組み込まれていることを示した。ただし、定款モノリグノール記者カスパリー バンド自体の合計不在だ成熟したこの発達段階では、他の壁がまださらに生体高分子蒸着のサイト間を示します。Z スタックの再構成の 3D ビューは、明らかに光にカスパリー バンドをもたらします。興味深いことに、いくつかの皮質細胞、内皮細胞に隣接する壁はまた HAZを優先的に組み込むことができる証明 (リグニン/スベリン亜麻根野の存在を示すことにより) ない GALKが。共局在解析は、HAZと GALK、これらの 2 つの隣接するセルのタイプに特定の細胞壁構造/酵素機械の存在を示唆している間反相関を示した。
補足表 1: 固体の ½ の MS 培地の準備<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足テーブル 2: 化学薬品レポーターの貯蔵液の準備<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

ブリス、木質化のダイナミクスを研究するためのデュアル ラベル プロトコルが開発されました。合成モノリグノールを使用して記者と SPAAC と CuAAC bioorthogonal の連続の組み合わせ反応、この方法論は、 planta のリグニンの生合成を制御する要因の詳細な分析への道の道を開くをクリックします。

化学のをクリックして、植物の木質化のダイナミクスを可視化する: 二重分類は至福である!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K ビュー.  Université de Lille. ブリス、木質化のダイナミクスを研究するためのデュアル ラベル プロトコルが開発されました。合成モノリグノールを使用して記者と SPAAC と CuAAC bioorthogonal の連続の組み合わせ反応、この方法論は、 planta のリグニンの生合成を制御する要因の詳細な分析への道の道を開くをクリックします。

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

化学

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

生化学

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

生物学

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

発生生物学

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>MOEによる細胞内シアリル化糖鎖の可視化のための拡大顕微鏡

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
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<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
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Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

代謝ラベリング

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化学のをクリックして、植物の木質化のダイナミクスを可視化する: 二重分類は至福である!

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水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

ラベルフリーその場でイメージング

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

の組織化学的染色

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

代謝ラベリング