La investigación realizada por los autores fue apoyada en parte por subvenciones de la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo acuerdo de concesión no. 229239 y de la Fundación AO, exploratoria investigación colaborativa investigaciones programa aguda Cartílago daños/lesión, defecto (CRP ACI) bajo el proyecto Bioactive y biomiméticos andamios para regeneración de cartílago (BIOCART).

1. uno mismo-montaje preparación de andamio (SAPS) de péptido
<ol><li>Preparar una solución de 0,5% del péptido RAD16-I en 20% (p/v) de sacarosa, en un tubo de microcentrífuga. Someter a ultrasonidos la solución del péptido por 20 min en un baño de ultrasonidos a la máxima potencia y a temperatura ambiente (RT) para asegurar una mezcla homogénea. Nota: El volumen de solución a preparar dependerá de la cantidad de encapsulados deseado. RAD16-me péptidos no sufren degradación en estas condiciones de sonicación.</li>
	<li>Diluir la solución de péptido preparada en el paso 1.1 con el volumen necesario de sacarosa al 10% (w/v) para obtener la concentración final deseada. Nota: Un factor importante a tener en cuenta es el ajuste de la concentración de péptido inicial ya que este parámetro depende de la rigidez de la matriz final. El RAD16-I solución péptido debe ser 2 x más concentrados que la concentración final deseada de la construcción 3D. Normalmente, el RAD16 final-las concentraciones de péptidos utilizadas son entre 0.15-0.5% (p/v).</li>
	<li>Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene la solución del péptido en un baño de ultrasonidos a temperatura ambiente durante 20 minutos para asegurar una mezcla homogénea. Nota: La solución de péptidos, si no se utiliza inmediatamente, puede almacenarse durante varios meses a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparación de suspensión de célula
<ol><li>Centrifugue la suspensión de células (obtenida después del tratamiento de la tripsina) en 60 x g y RT durante 5 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante con una pipeta Pasteur conectada a una línea de vacío y suspender el precipitado de células en 3 – 5 mL de sacarosa al 10% (w/v) utilizando una micropipeta. Proceder a contar las células usando un contador de células manual o automática. Nota: La solución de sacarosa al 10% (p/v) es un medio isotónico y no iónico que permite el mantenimiento de células y evita la congelación del péptido durante el proceso de mezcla.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 60 x g y RT por 5 min, retirar el sobrenadante y suspender el precipitado de células otra vez en el volumen necesario de sacarosa al 10% (w/v) para obtener doble la concentración celular final deseada (recomendable aproximadamente 4 x 106 células / mL).</li>
	<li>Coloque un número deseado de inserciones de cultivo de tejidos en cada pocillo de una placa de 6 pozos (uno insertar por encapsulación).</li>
	<li>Someter a ultrasonidos la solución péptido preparada en el paso 1 a potencia máxima y RT durante 5 minutos.</li>
	<li>Pipeta y coloque 40 μl de la suspensión de células (obtenida en 2.3) para cada encapsulación deseada además de aproximadamente 10 – 15% de volumen adicional en un tubo de microcentrífuga estándar.</li>
</ol>3. encapsulación de la célula 3D en SAPS
<ol><li>Mezclar un volumen igual de la RAD16-I solución de sacarosa al 10% (w/v) (40 μl por encapsulación) con un volumen igual de la suspensión celular (40 μl por encapsulación) preparado en el paso 2 para obtener una suspensión de células en la concentración de péptido deseado (en el 10% de sacarosa). Mezclar mediante pipeteo lentamente arriba y abajo de aproximadamente 10 veces. Evitar formación de burbujas durante la mezcla. Nota: Este paso es fundamental y debe realizarse con mucho cuidado ya que las células están bajo condiciones hostiles debido al péptido de bajo pH (aproximadamente 3.5 – 4.0).</li>
	<li>Usando una micropipeta, cuidadosamente cargar 80 μl de la suspensión en cada inserto.</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de medio de cultivo en el fondo del pozo para mojar la membrana insertar, permitiendo medios de difusión promover el peptide uno mismo-Asamblea y formación del hidrogel. Que el péptido gel durante aproximadamente 20 minutos en el gabinete de flujo. Nota: La manipulación de las muestras durante el ajuste de tiempo podría terminar en la fractura del gel.</li>
	<li>Muy lentamente agregar 40 μl de medio a la estufa y deje que se deslice hacia abajo la pared interna al gel. Nota: Normalmente, la carga de este volumen debe tomar entre 20-30 s.</li>
	<li>Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) durante 20 minutos. Este paso y sucesivas adiciones medio favorecerá la lixiviación de la sacarosa y equilibrado de las células con medio de cultivo.</li>
	<li>Añadir 60 μL de medio a la pared interna del parte movible, permitiendo que fluya hacia abajo de la pared. Aspire el medio del pozo, que es rico en sacarosa, y añadir 0,5 mL de medio fresco.</li>
	<li>Añadir 60 μL de medio poco a poco el prospecto y colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire el medio del pozo y agregar 2,5 mL de medio fresco en el pozo. Añadir 200 μL de medio en el inserto. Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2, ambiente humidificado) para mantener las células en condiciones adecuadas.</li>
	<li>Cambiar el medio cada día. Quitar el viejo medio de la parte inferior del pozo. Añadir 2,5 mL de medio fresco para el bien y 200 μL para la inserción. Nota: Si continúa la diferenciación de la célula, los medios de comunicación induce específica se añadirá a las culturas, dando como resultado el compromiso del tipo de célula deseada (véase abajo, diferenciación celular).</li>
</ol>4. célula viabilidad en 3D-SAPS
<ol> <li>Nota: El ensayo de viabilidad celular se conoce como vivos o muertos, así como ensayos de viabilidad/citotoxicidad.</li>
	<li>En un tubo de 15 mL, preparar el volumen necesario de una solución fresca de calceína AM de 2 μm y 2 μm de etidio homodímero-1 (EthD-1) en PBS con un vórtex para 10 s. Mantenga en la oscuridad. Nota: El volumen a utilizar para cada muestra dependerá el tamaño del bien según lo siguiente: 2 mL por cada pocillo de una placa multiwell de 6; 1 mL por cada pozo de una placa multiwell 12 y 0.5 mL para cada pocillo de una placa multiwell de 24.</li>
	<li>Usando una micropipeta, enjuagar las muestras 3D-SAPS 3 veces con 2 mL de PBS y a continuación, cubrirla con la solución preparada en el paso 4.1. Incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Usando una micropipeta, enjuague las construcciones con 2 mL de PBS 5 veces.</li>
	<li>Visualizar las muestras bajo un microscopio de fluorescencia utilizando 10 X o 20 aumentos.</li>
</ol>5. diferenciación de la célula
<ol><li>Células en cultivo (37 ° C, 5% CO2ambiente humidificado) en condrocitos Basal media (CBM) con crecimiento suplementos. Nota: La preparación del medio se describe en las instrucciones del fabricante (vea la Tabla de materiales).</li>
	<li>Inducir la diferenciación celular en el día 2 con condrogénica medio humano recombinante que contiene transformación de factor de crecimiento-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), ácido L-ascórbico 2-fosfato [AA2P] (25 μg/mL) y dexametasona (100 nM).</li>
	<li>Mantener la cultura por 4 semanas en una incubadora con un ambiente humidificado a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar condrogénica medio día.</li>
</ol>6. toluidina azul (TB) tinción
<ol><li>Lave las culturas SAPS 3D dos veces por agregar y quitar luego 2 mL de PBS con una micropipeta. Corregir agregando 2 mL de 2% (w/v) p-formaldehído en PBS durante 2 h a TA.</li>
	<li>Lavar dos veces con 2 mL de 0,1% Tritón X-100 en PBS (SAFT).</li>
	<li>Incubar con 2 mL de la TB de 0.05% en agua por 20 min a TA.</li>
	<li>Lavar varias veces (por lo menos 3 veces) con 2 mL de PBS hasta que la solución de PBS quitada es clara.</li>
	<li>Análisis de las muestras por inspección visual bajo un microscopio estereoscópico11,13,14. Nota: TB forma complejos con aniónicos glicoconjugados en la matriz extracelular, proteoglicanos (PG) y glicosaminoglicanos (GAG), que principalmente son secretadas por células condrocitos. Las muestras positivas se tiñen de azul.</li>
</ol>7. Western Blot
Nota: El procedimiento utilizado en este protocolo fue descrito en la referencia11.
<ol><li>Lyse 3D-construcciones en RIPA buffer que contiene inhibidor de la proteasa cóctel mediante pipeteo.</li>
	<li>Preparar el gel de acrilamida según los requisitos de volumen de gel (de los equipos corrientes de gel específico) y correr los lysates de la célula durante 90 minutos a 150 V16. Nota: Gel de acrilamida es generalmente preparado a una concentración de 7.5 – 10% (w/v), dependiendo del peso molecular de la proteína.</li>
	<li>Transferencia de las proteínas contenidas en el gel a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno aplicando 40 V durante 2 h a TA.</li>
	<li>Incubar la membrana PVDF a temperatura ambiente por 2 h en buffer de bloqueo (4% (p/v) en polvo leche descremada en SAFT) en un contenedor separado con suficiente volumen para cubrir la membrana.</li>
	<li>Incubar la membrana a temperatura ambiente durante 1 h con anticuerpos primarios a una concentración final de 1 mg/mL en SAFT. Ver la tabla de materiales.</li>
	<li>Añadir anticuerpos secundarios a una concentración de 1 mg/mL. Consulte la tabla de materiales.</li>
	<li>Preparar la membrana para la detección de hP con un sustrato quimioluminiscente16. Ver la tabla de materiales.</li>
	<li>Tomar imágenes de quimioluminiscencia16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Anteriormente, nuestro grupo y otros han descrito el uso de plataformas de la cultura (3D) tridimensional con célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. En el presente trabajo se describe un método sencillo y confiable de obtener cultura 3D sistemas que son aplicables a cualquier tipo de células de mamíferos incluyendo cualquier tipo de célula funcional, embrionaria o adulto células de vástago, o eventualmente, aislaron células disfuncionales de biopsias o tumores y así sucesivamente. Además, independientemente, si las células madre son de origen embrionario o adulto tendrían una mejor capacidad de compromiso de linaje en el entorno 3D que en 2D clásica de la cultura platos10,11,12, 13,14,15. Por lo tanto, el cultivo celular en este sistema daría lugar a la diferenciación en las estructuras como tejido funcionales que podrían ser utilizadas en diferentes aplicaciones, desde la biomedicina regenerativa o reparativa a plataformas toxicológicas y farmacológicas.
Hemos demostrado una ganancia clara en función de la célula porque el microambiente celular es similar a la de los tejidos naturales en cuanto a la estructura de la matriz y parámetros biomecánicos, biofísicos y biológicos. Sin embargo, como el sistema se vuelve más complejo, el número de parámetros que necesitan ser regulados también aumentos, que incluye la necesidad de una plataforma de apoyo externa (como un sistema de activa perfusión para evitar problemas asociados a fenómenos de transferencia de masa ). Las células cultivadas tridimensionalmente se desempeñan mejor en cuanto a la regulación de las actividades esenciales, como la migración, proliferación y diferenciación. Podrían formar redes complejas permitiendo mayor interferencia celular, que es en gran medida una consecuencia esencial de crecimiento y diferenciación en 3D. El hecho de que jugos podría crear condiciones en vitro similares a ésos matriz extracelular proteínas representa una ventaja desde un estudio racional del efecto producida por cada componente añadido al andamio (factor de crecimiento, polisacárido o señalización péptido) podría ser fácilmente realizado.
Las claras ventajas del uso de programas de ajuste estructural en comparación con otros andamios naturales, tales como colágeno tipo I y Matrigel, son los siguientes: 1) SAPS es un biomaterial sintético con mínima variación de lote a producción de hornada; 2) SAPS tiene la capacidad de ser funcionalizados con secuencias de péptidos específicos; y 3) presenta programas de ajuste estructural baja biodegradabilidad en vitro, que permite el mantenimiento de la construcción 3D con las mismas propiedades biofísicas, biomecánicas y estructurales en el tiempo. Sin embargo, la limitación del uso de jugos versus otros andamios se encuentra en la etapa de encapsulación, donde las células están en un ambiente hostil debido a bajo pH. Por lo tanto, este es un paso crítico en la metodología descrita. Por otra parte, es importante establecer la concentración de programas de ajuste estructural para cada tipo de célula específica antes de empezar cualquier experimento. Esto es, de hecho, esencial cuando las células se cultivan en o en estos biomateriales, ya que cada tipo de célula particular se presentan condiciones de crecimiento óptimo de biomecánica.
Por último, creemos que el diseño y la fabricación de este tipo de andamio de biomaterial mejoraría el desarrollo de modelos de tejido 3D más fisiológica y confiable para ayudar a la industria farmacéutica para desarrollar mejores enfoques terapéuticos para medicina regenerativa, cáncer o tratamiento médico.

Por muchas décadas, se ha realizado cultivo celular mamífero bajo condiciones experimentales utilizando sistemas de dos dimensiones clásicas de la cultura (2D) debido a problemas prácticos y económicos sin tener en cuenta los aspectos no-fisiológico. Aunque este sistema de cultivo ayuda a estudiar y comprender los mecanismos moleculares y celulares más, hoy sabemos que son necesarios nuevos paradigmas de la cultura de célula para el estudio de sistemas celulares más complejos. Por lo tanto, los sistemas de cultivo (3D) tridimensional son necesarios para recrear un microambiente que es basada, biomecánicamente y biológicamente más similar a la de los tejidos naturales. En los últimos años, los sistemas de cultivo 3D, en general, se han convertido en más frecuentes entre los investigadores y la industria puesto que representan un nuevo modelo de estudio o investigación en la que las células pueden crecer en el espacio, crean célula a célula o célula a matriz interacciones, migrar y Finalmente diferenciarse en linajes de células específicas.
El objetivo general de esta metodología es recrear una en vitro microambiente celular que está más cerca el microambiente en vivo . En particular, el andamio peptide uno mismo-montaje sintético (PAE) es un tipo de biomaterial con propiedades únicas; forma una red de poros de tamaño nanómetro hecha de interacciones débiles entre péptidos con propiedades mecánicas y estructurales similares de matrices extracelulares naturales. En otras palabras, la racionalidad detrás del uso de este material es que se crea un verdadero entorno en 3D que es ideal para obtener unidades de órganos o tejidos de pseudo-3D. Sin embargo, lo más importante, el contexto 3D permite la estructura 3D ganar nuevas funciones biológicas que normalmente no están presentes en las plataformas 2D de la cultura, tales como propiedades relacionadas con la arquitectura del tejido, fenómenos de transferencia de masa, patrón de la célula y eventualmente morfogénesis de tejidos, que son factores clave en futuras investigaciones y desarrollo de los tejidos funcionales y órganos1,2. Por otra parte, una ventaja de SAPS sobre sus contrapartes naturales (colágeno, Matrigel) es que son muy estables a temperatura ambiente y no requieren condiciones especiales de post producción, distribución o almacenamiento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. programas de ajuste estructural es fácil de manejar, cuando se desee; Geles 3D pueden obtenerse simplemente aumentando la fuerza iónica o ajustando el pH a la neutralidad1,2. Finalmente, la metodología aquí descrita ha sido ampliamente utilizado en vitro para promover el mantenimiento, crecimiento y diferenciación de varios tipos celulares, incluyendo condrocitos, hepatocitos, células endoteliales, osteoblastos, células neuronales, así como las células madre embrionarias y somáticas3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. en el presente trabajo, describimos el uso de un sistema de 3D-cultura humana condrocitos articulares Ampliadas (hACh) se diferencian en tejido similar al cartílago como se describió anteriormente11.
Aquí, se describe un método para células en cultivo en un sistema 3D usando programas de ajuste estructural. En este biomaterial sintético, las células se mezclan primero con una solución del péptido, que posteriormente se induce a la uno mismo-montar, crear una red de dimensiones nanométricas alrededor de las células y por lo tanto, crear un ambiente verdaderamente 3D (figura 1). Es importante considerar que el comportamiento celular está afectada por valores de rigidez de matriz (es decir, proliferación, migración y diferenciación). Por lo tanto, un control metodológico común es a células en cultivo en la parte superior del andamio del péptido con los mismos valores de rigidez (cultura en dos dimensiones).

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &amp;micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Se describe una técnica útil para el cultivo de células en un uno mismo-montaje andamio nanofibras de (3D) tridimensional. Este sistema de cultivo recrea un entorno que imita muy de cerca las características estructurales del tejido no polarizado. Además, la estructura particular de nanofibras intrínseca del andamio es transparente a luz visible, que permite la fácil visualización de la muestra bajo microscopio. Esta ventaja en gran parte se utilizó para estudiar la migración de la célula, organización, proliferación y diferenciación y así cualquier desarrollo de su función celular mediante tinción con colorantes específicos o sondas. Además, en este trabajo, describimos el buen funcionamiento de este sistema para estudiar fácilmente la redifferentiation de condrocitos articulares humanos ampliado en tejido cartilaginoso. Las células fueron encapsuladas en uno mismo-montaje de andamios de péptido y cultivadas bajo condiciones específicas para promover la condrogénesis. Las culturas tridimensionales demostraron buena viabilidad durante las 4 semanas del experimento. Como era de esperar, las muestras cultivadas con inductores condrogénica (en comparación con controles no inducido) teñido fuertemente positivas para el azul de toluidina (que tiñe los glicosaminoglicanos (GAGs) que están muy presentes en la matriz extracelular del cartílago) y expresó los marcadores moleculares específicos, incluyendo colágeno tipo I, II y X, según análisis de Western Blot. Este protocolo es fácil de realizar y puede utilizarse en los laboratorios de investigación, industrias y propósitos educativos en los cursos de laboratorio.

En el presente trabajo se describe un protocolo simple y rápido a células en cultivo en 3D usando programas de ajuste estructural para obtener datos cualitativos y cuantitativos fiables. SAP crea un microambiente 3D con propiedades únicas que permiten a las células cultivadas bajo condiciones deseadas para proceder al mantenimiento celular, proliferación y diferenciación3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. en nuestro grupo, varios estudios se han realizado con células progenitoras de tejido adiposo humano derivado (hAPC), condrocitos articulares humanos ampliado (hACh) y fibroblastos dérmicos normales humanos (hNDF) a la cultura, ampliar y diferenciarlos en tejido similar a cartílago10,11,12. Aquí, describimos la cultura 3D y rediferenciación de hACh ampliado en tejido similar a cartílago, como se describió anteriormente11. Por lo tanto, nos encapsulan las células en 3D-programas de ajuste estructural y la cultura les en medio de inducción condrogénica, como se describe en la figura 1 (y en el protocolo). Después de 24 h, las muestras se evaluaron la viabilidad con el ensayo de viabilidad de la citotoxicidad de vivos o muertos. Los resultados indican que un pequeño porcentaje de células fueron muerto (rojo) después de 5 días de encapsulación y casi células muertas no fueron observadas después de 4 semanas de la cultura (figura 2). A continuación, mancharon para el depósito de glicosaminoglicanos (GAG) en la matriz extracelular mediante la tinción de azul de toluidina. Como era de esperar, el grupo de inducción respondió adecuadamente al tratamiento, mostrando fuerte tinción (figura 2).
Finalmente, marcadores moleculares de los marcadores de la condrogénesis y la hipertrofia, incluyendo colágeno tipo I, II y X, se analizaron por western blot (figura 3). Colágeno de tipo que i (COL1) fue observado en los sistemas 2D y 3D, pero una banda inferior de ~ 130 kDa (que representa la proteína de COL1 madura procesada para ser ensamblada en la matriz extracelular) se observó sólo en 3D. Este resultado indica claramente que las células en diferenciación en tres dimensiones se debe proceder de una manera más fisiológica. Notable, colágeno tipo II (COL2) fue detectado - como una sola banda del esperado peso molecular presente en la matriz extracelular - sólo en construcciones 3D cultivadas bajo condiciones condrogénica. Por último, colágeno de tipo X (COL10) fue detectado en 2D y 3D construcciones cultivadas bajo condiciones condrogénica, indicando cierto grado de hipertrofia después de 4 semanas de la cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figura 1: representación esquemática de la encapsulación de la célula en 3D-SAPS. Representación esquemática de la encapsulación de hACh se describe para obtener las células dispersadas al azar dentro de las 3D-SAPS. 1. uno mismo-montaje preparación de andamio (SAPS) péptido; 2. célula de preparación de la suspensión; y 3. 3D-cell la encapsulación en SAPS. Observe que el esquema sólo muestra pasos 3.1 a 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figura 2: rendimiento y condrogénica diferenciación en cultivos 3D-SAPS celular. Tinción de viabilidad celular se realiza en 5 días y 4 semanas de la cultura detectadas bajo un microscopio de fluorescencia (células vivas en las células verdes y muertas en rojo). Barras de escala = 200 μm. compromiso General condrogénesis por azul de toluidina tinción (sulfatados glycosaminoglycans en azul) de construcciones 3D savias cultivadas en medios de control y condrogénica. Barras de escala = 500 μm. Esta figura ha sido modificada desde la L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figura 3: colágeno I, II y X expresión de hACh en condrogénesis. hACh cultivada en una monocapa de 2D y en 3D-programas de ajuste estructural después de 4 semanas en condrogénica medios y controles se evaluaron la expresión de colágeno tipo I (COL1), colágeno tipo II (COL2) y colágeno de tipo X (COL10). Expresión de actina se utilizó como control interno. Esta figura ha sido modificada desde la L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K vistas.  Ramon Llull University. Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Modelo biomimético tridimensional in vitro de neuroblastoma con andamios basados en colágeno

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Investigación sobre el cáncer

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicina

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo tissue repair. In these granular scaffolds, the innate porosity generated by the void space between microgels enables cell infiltration and migration. Controlling the void fraction and particle fraction is critical for MAP scaffold design, as porosity is a bioactive cue for cells. Spherical microgels can be generated on a microfluidic device for controlled size and shape and subsequently freeze-dried using methods that prevent fracturing of the polymer network. Upon rehydration, the lyophilized microgels lead to controlled particle fractions in MAP scaffolds. The implementation of these methods for microgel lyophilization has led to reproducible studies showing the effect of particle fraction on macromolecule diffusion and cell spreading. The following protocol will cover the fabrication, lyophilization, and rehydration of microgels for controlling particle fraction in MAP scaffolds, as well as annealing the microgels through bio-orthogonal crosslinking for 3D cell culture in vitro.

Minimizing the variability in the particle fraction within granular scaffolds facilitates reproducible experimentation. This work describes methods for generating granular scaffolds with controlled particle fractions for in vitro tissue engineering applications.

Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzado de cocultivo 3D de dos capas para células epiteliales y fibroblastos

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Avance de los sistemas de cocultivo 3D con membranas nanofibrosas de PVA-PCL

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Resumen

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Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Modelo biomimético tridimensional in vitro de neuroblastoma con andamios basados en colágeno

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario

Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas